Name: A Novel In vivo Técnica de transferencia de genes y In vitro ensayos basados en células para el estudio de la pérdida ósea en los trastornos musculoesqueléticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprende una técnica de transferencia de genes in vivo mediante entrega hidrodinámica de ADN mini-círculo RANKL y protocolos de cultivo celular in vitro para generar osteoclastos a partir de macrófagos de médula ósea de ratón y células PBMC humanas.

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La investigación fue financiada en parte por las becas de investigación de los NIH R01 AR062173 y SHC 250862 a la IEA. ES es el beneficiario de la beca predoctoral NIH T32 CTSC.

1. Entrega hidrodinámico de ADN MC sRANKL <ol><li> Entrega hidrodinámica a través del ratón de la cola de la vena <ol><li> Pesar el ratón antes de la inyección en la vena de la cola. Diluir sRANKL o proteína fluorescente verde (GFP) MC en solución de Ringer (pre-calentamiento a 37 ° C) en un volumen total de ~ 10% del peso corporal del ratón. </li><li> Caliente el ratón en una jaula durante 10 min antes de la inyección con el fin de dilatar los vasos sanguíneos y hacer que las venas laterales (LVs) visibles. Monitorear el ratón con cuidado para evitar la deshidratación y la hipertermia. </li><li> Tan pronto como los volúmenes lógicos están dilatados y visibles, transferir el ratón a la inmovilización e inserte el conector lo suficiente en el barril para restringir el movimiento. Monitorear el ratón para la actividad normal, como la respiración. Ajuste el tapón de inmovilización, si es necesario. </li><li> Desinfectar el área de la inyección de 3/4 de la punta de la cola con un algodón con alcohol. Utilice una aguja de 27 a 30 para el ratón inyección en la vena de la cola. Sostenga la cola firmemente con una mano e inserte la aguja ena la vena de la cola. Aplique presión sobre la jeringa y completar la inyección dentro de 5-7 seg. </li><li> Retire la aguja de la vena de la cola y aplique presión con un algodón sobre el lugar de la inyección para detener el sangrado. Monitorear el ratón durante 15-30 minutos, a continuación, transferir el ratón de nuevo a vivarium una vez que el ritmo de la respiración se reduce a su ritmo normal. </li></ol></li><li> Confirmación de la expresión y cuantificación de Ratón Serum TRACP5b Mensaje Gene Transfer sistémica Ratón sRANKL <ol><li> Caliente el ratón en una jaula durante 5-10 minutos con el fin de dilatar los vasos sanguíneos y hacer LV visible. Monitorear el ratón con cuidado para evitar la deshidratación y la hipertermia. </li><li> Hacer una pequeña incisión con una cuchilla a la cola del ratón en un sitio de una cuarta parte de la punta de la cola. </li><li> Recoge alrededor de 100 l de sangre en tubos de separación de suero. </li><li> Incubar los tubos de separación de suero a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 5 min y recoger el suero. Store suero en -80 ° C para su posterior análisis. </li><li> Realizar sRANKL ELISA y ensayo de TRACP5b suero de ratón en muestras de suero utilizando un kit comercial disponible. </li></ol></li></ol> 2. In vitro generación de osteoclastos de Ratón BMMs <ol><li> Aislamiento y cultivo de BMMs <ol><li> El aislamiento de la tibia y los huesos de fémur: La eutanasia el ratón donante con CO 2, y desinfectar las piernas con etanol al 70%. Diseccionar desde el pubis hasta el hueso calcáneo, para quitar los huesos fémur y la tibia intacta. </li><li> Quite la piel y el músculo cuidadosamente sin dañar el hueso. Coloque fémur procesado y hueso de la tibia en una placa de Petri que contiene tampón fosfato salino (PBS). </li><li> La eliminación de la médula ósea: Corte la punta en un lado de los huesos del fémur y de la tibia y enjuagar la médula ósea en un tubo de 50 ml utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 25, cargado con α-MEM que contiene 1% de penicilina / estreptomicina (osteoclastos Cultura Medio / OCM). </li><li&gt; Proceso de médula ósea: Mezclar y transferir la suspensión de la médula ósea a un nuevo tubo de 50 ml pasando a través de un filtro de células de 70 m de nylon. Centrifugar las células a 300 xg y volver a suspender en α-MEM que contiene 1% de penicilina / estreptomicina y 10% de FBS (medio de osteoclastos Cultura / OCM (+)). </li></ol></li><li> Cultura de los macrófagos <ol><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células. </li><li> Plate 1 x 10 6 células por pocillo en una placa de 6 pocillos o 3 x 10 5 células a cubreobjetos de vidrio (5 mm) o rodajas de dentina colocados en placas de 96 pocillos y se incuba a 37 ° C. </li><li> Aspirar todos los medios que contienen las células no adherentes y se incuban las células a 37 ° C con OCM fresca (+) que contiene 25 ng / ml ratón M-CSF durante 48 horas. </li><li> Aspirar todos los medios de comunicación y se incuban las células a 37 ° C con frescos OCM (+) un medio que contenía 25 ng / ml ratón M-CSF, y 30 ng / ml sRANKL ratón para iniciar la osteoclastogénesis. Reponer los medios de comunicación cada 3 días según sea necesario. </li><li> Se cultivan las célulasdurante aproximadamente 6-8 días para formar células multinucleares gigantes capaces de resorción ósea. En cuanto aparezcan células multinucleadas, realice TRAP (fosfatasa ácida resistente al tartrato) tinción utilizando un kit comercial disponible, y cuando está completamente madura, realizar ensayos funcionales. Visualizar anillos de actina F en cubreobjetos utilizando mancha faloidina y la imagen de las células unidas a la dentina rebanadas por microscopía electrónica de barrido (SEM) como se ha descrito previamente 19. </li></ol></li></ol> 3. Generación de osteoclastos in vitro de las PBMC humanas <ol><li> Aislamiento de PBMC humanas <ol><li> Añadir 10 ml de pre-calentado Histopaque-1077 en un tubo de 50 ml. </li><li> Filtro de leucocitos vacío obtiene a partir del banco de sangre con PBS estéril en un tubo de 50 ml (proporción de 1:1 de sangre con PBS). Capa de la sangre diluida sobre la solución Histopaque muy lentamente, asegurándose de que la sangre no se mezcla con el histopaque. </li><li> Centrifugar las muestras a 1000 xg durante 20 min a 18 ° C. Seguiring centrifugación, aislar cuidadosamente la capa de la capa leucocitaria blanca que contiene las células blancas de la sangre y transferir a un nuevo tubo de 50 ml. </li><li> Diluir las células con PBS y se centrifuga de nuevo a 650 xg durante 5 minutos para recoger las células. </li><li> Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en OCM (-) de los medios y contar las células utilizando un contador de células. </li></ol></li><li> Plating y cultivo de CMSP <ol><li> Resuspender las células en las OCM (+) los medios de comunicación y la placa de 8 x 10 6 células / ml por pocillo en una placa de 6 pocillos o 1 x 10 6 células / ml por pocillo en placas de 96 pocillos. Las células de la placa sobre cubreobjetos de vidrio (5 mm) según se requiera para obtener imágenes de inmunofluorescencia, así como en secciones de hueso adecuados para ensayos de resorción ósea como anteriormente descritos 20. </li><li> Cambio de los medios de cultivo, la reposición de las células con M-CSF humano cada 2-3 días o según sea necesario. A continuación, proceder a la etapa de diferenciación en el día 5 por la adición de 30 ng / ml de sRANKL humana junto con 25 ml de M-CSF ng / humano en OCM (+) medios para iniciar osteoclastogeneses. </li><li> Se cultivan las células durante aproximadamente 14 a 21 días para formar células multinucleares gigantes. Tan pronto como aparecen células multinucleadas, a continuación, estas células se pueden etiquetar para TRAP, y cuando está completamente madurado, ensayos funcionales pueden llevarse a cabo. Anillos de actina F se pueden visualizar en cubreobjetos utilizando tinción phalloidin. La morfología de las células puede examinarse en células unidas a la dentina rebanadas por SEM. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Las afecciones musculoesqueléticas son las principales causas de morbilidad y discapacidad, y se componen de más de 150 enfermedades y síndromes; que afecta hoy a unos 90 millones de estadounidenses. Inflamación de las articulaciones y la destrucción ósea son las características predominantes de los trastornos musculoesqueléticos, como la artritis y la osteoporosis. La osteoporosis es una enfermedad que debilita la integridad ósea, a menudo conduce a las fracturas de los huesos. La artritis es una enfermedad crónica car...

Enfermedades musculoesqueléticas afectan a millones de personas en los Estados Unidos y del presente graves consecuencias para los sistemas de salud nacionales y locales 1. Estos trastornos se caracterizan por la pérdida de hueso y función de las articulaciones que requieren tratamiento extenso y largos períodos de recuperación. Comúnmente, un aumento relativo en el número y / o actividad de los osteoclastos, células especializadas para reabsorber el hueso, en la osteoporosis y la artritis se observa 2. En condiciones fisiológicas el número y la actividad de los osteoclastos está regulada por el activador del receptor del factor nuclear κ-B ligando (RANKL), que es producida por los osteoblastos. La osteoprotegerina (OPG), un receptor señuelo para RANKL también es producida por los osteoblastos 3 modelos animales in vivo que implican la sobreexpresión sistémica de sRANKL, o supresión de OPG son muy valiosa en la investigación de la osteoporosis.; Sin embargo, estos métodos requieren la generación de ratones transgénicos 4,5. Aquí, una nueva alternativamétodo de sobreexpresar sRANKL para el estudio de los trastornos musculoesqueléticos relacionados-se describe. Específicamente, minicircle (MC) la tecnología del ADN y los métodos de entrega hidrodinámicas se utilizaron para lograr la transferencia de genes de sRANKL in vivo e sobreexpresan ratón sRANKL sistémicamente 6. Este método también es complementaria a otros modelos in vivo de la osteoporosis, tales como la modulación hormonal de los osteoclastos siguientes ovariectomía 7 y la intervención dietética con dieta baja en calcio 8. Estos modelos son muy útiles para estudiar diferentes aspectos de los trastornos musculoesqueléticos relacionados-sin embargo, requieren de procedimientos quirúrgicos y pueden durar hasta varios meses, a un costo significativo 9. Ovariectomizadas (OVX) modelo de roedores es un modelo animal experimental en que la extirpación de los ovarios conduce a la deficiencia de estrógenos imitando así la osteoporosis posmenopáusica humana 10. La osteoporosis post-menopáusica humana, una condición donde Defici estrógenoparencia conduce a un mayor riesgo de fracturas óseas y la osteoporosis afecta a aproximadamente ocho millones de mujeres en los Estados Unidos solamente. Aunque el modelo OVX es útil para la osteoporosis post-menopáusica que ofrece ventajas limitadas en el estudio de la osteoporosis en general. El estrógeno suprime la pérdida de hueso, mediante la inducción de osteoclastos y la inhibición de la apoptosis de los osteoblastos, por lo tanto, en su ausencia se observa un aumento de la actividad de los osteoclastos 10-12. Un desequilibrio en la relación RANKL-OPG que favorece la resorción ósea también se observa 13. Sin embargo, la deficiencia de estrógenos en vivo también se acompaña de disminución de los niveles de transformación del factor de crecimiento β (TGF β), aumento de la interleucina-7 (IL-7) y de TNF, IL-1 e IL-6 14,15. Como estas citoquinas han conocido funciones moduladoras de remodelación ósea independiente de la vía de RANKL, es imposible atribuir cualquier activación de los osteoclastos exclusivamente al eje RANKL-RANK. El modelo que se describe en este documento permite a los investigadores estudiar en vivo eje RANKL a RANK en la osteoclastogénesis y la pérdida ósea sin las citoquinas pro-inflamatorias en comparación con modelos de roedores OVX. Además, las técnicas de la osteoclastogénesis in vitro son herramientas esenciales para el estudio de la activación de los osteoclastos para posibles tratamientos terapéuticos de las enfermedades musculoesqueléticas. Estudios anteriores también han demostrado que el cultivo de macrófagos derivados de médula ósea de ratón (BMMs) con macrófagos de ratón factor estimulante de colonias (M-CSF) y el ratón sRANKL puede conducir a la diferenciación de los osteoclastos 3,16,17. Aquí se describen los protocolos para generar células similares a osteoclastos multinucleadas de médula ósea de ratón, así como de células de sangre periférica humana (PBMC) in vitro 18. Los ensayos basados ​​en células necesarios para definir un osteoclastos terminales diferenciadas y completamente funcional madura también se describen brevemente. Estas técnicas in vitro complementan la novela en el enfoque vivo y juntos sirven como pherramientas de investigación para estudiar owerful diferenciación de los osteoclastos y la activación. El uso de estos sistemas, los científicos son capaces de generar los osteoclastos in vivo e in vitro y definir los estímulos y señales requeridas para su proliferación y activación, así como probar la eficacia de los inhibidores farmacológicos y biológicos.

<table><tbody><tr><td>alpha-MEM</td><td>Tecnologías de Vida&nbsp;</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF Humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-492</td><td></td></tr><tr><td>Ratón M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-643</td><td></td></tr><tr><td>Ligando RANK Humano - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-631</td><td></td></tr><tr><td>Ratón RANK-Ligando - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-076</td><td></td></tr><tr><td>Restricción de venas de cola para ratones</td><td>Braintree</td><td>TV-150 Ratón STD</td><td></td></tr><tr><td>TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit&nbsp;</td><td>R& D systems</td><td>MTR00</td><td></td></tr><tr><td>Kit de fosfatasa ácida, leucocitos (TRAP) Sigma</td><td></td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo MouseTRAP&nbsp;</td><td>sistema de inmunodiagnóstico</td><td>SB-TR103</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vivo técnica de transferencia de genes y in vitro ensayos basados ​​en células para el estudio de la pérdida ósea en los trastornos musculoesqueléticos

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

La diferenciación y activación de los osteoclastos juegan un papel clave en el desarrollo de enfermedades musculoesqueléticas, ya que estas células están principalmente involucradas en la resorción ósea. Los osteoclastos pueden generarse in vitro a partir de células precursoras de monocitos/macrófagos en presencia de ciertas citocinas, que promueven la supervivencia y la diferenciación. Aquí se demuestran técnicas tanto in vivo como in vitro, que permiten a los científicos estudiar diferentes contribuciones de citoquinas a la diferenciación, señalización y activación de osteoclastos. El sistema de transferencia de genes de entrega de ADN en minicírculos proporciona un método alternativo para establecer un modelo relacionado con la osteoporosis y es particularmente útil para estudiar la eficacia de varios inhibidores farmacológicos in vivo. De manera similar, los protocolos de cultivo in vitro para producir osteoclastos a partir de células precursoras humanas en presencia de citocinas específicas permiten a los científicos estudiar la osteoclastogénesis en células humanas para aplicaciones traslacionales. Combinadas, estas técnicas tienen el potencial de acelerar los esfuerzos de descubrimiento de fármacos para terapias dirigidas específicas de osteoclastos, lo que puede beneficiar a millones de pacientes con osteoporosis y artritis en todo el mundo.

Aquí, una técnica de transferencia de gen nuevo para la diferenciación de los osteoclastos in vivo y protocolos de cultivo de células para la diferenciación de células precursoras en los osteoclastos in vitro como un método para estudiar los efectos de las citoquinas en la osteoclastogénesis se describen. En la Figura 1, se muestran los resultados representativos de la transferencia de genes exitosa de GFP y ratón sRANKL MC en ratones. En la Figura 2, se muestran las i...

La diferenciación de las células precursoras en osteoclastos está regulada por citocinas y factores de crecimiento. En este trabajo se describe una nueva técnica de transferencia génica para la diferenciación de osteoclastos in vivo y protocolos de cultivo celular para diferenciar células precursoras en osteoclastos in vitro como método para estudiar los efectos de las citocinas en la osteoclastogénesis.

A Novel In vivo Técnica de transferencia de genes y In vitro ensayos basados ​​en células para el estudio de la pérdida ósea en los trastornos musculoesqueléticos

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

El objetivo general es informar sobre una nueva técnica de transferencia de genes para la diferenciación de osteoclastos in vivo. También describimos los protocolos de cultivo celular para diferenciar macrófagos de médula ósea de ratón de pbmc humano en osteoclastos. Este video se dividirá en tres partes.Uno, la entrega hidrodinámica de un mini círculo de líquenes de rango, ADN, dos generaciones de osteoclastos in vitro de ratón, macrófagos de médula ósea y tres generaciones de osteoclastos in vitro de pbmc humano. Primera parte, entrega hidrodinámica del minicírculo de líquenes de rango, ADN. La siguiente animación muestra una breve descripción general de la administración hidrodinámica a través de la inyección de venas de cola de ratón.Primero coloque el mouse bajo un mapa de calor durante 10 minutos antes de la inyección. Esto dilata los vasos sanguíneos y hace que las venas laterales sean más visibles. A continuación, localice el lugar de la inyección y proceda con la inyección, asegurándose de completar la inyección en un plazo de cinco a siete segundos.La siguiente parte de este video mostrará una descripción más detallada de los procedimientos involucrados en la entrega hidrodinámica a través de la vena de cola de ratón. Reúna los materiales para una inyección. Caliente el ratón en una jaula durante 10 minutos antes de la inyección.Vigile cuidadosamente al ratón para evitar la deshidratación y la hipotermia. Calentar el ratón dilata los vasos sanguíneos y hace que las venas laterales sean más visibles. Una vez que las venas sean visibles, transfiera el ratón a un sistema de retención e inserte un émbolo para restringir el movimiento del ratón.Desinfecte el lugar de la inyección con una toallita con alcohol. Usando una aguja de calibre 27 a 30 para la inyección de la cola del ratón con ligando de rango diluido o mini círculo GFP en la solución de timbre precalentada. Sostenga la cola firmemente con una mano e inserte la aguja en la vena de la cola.Aplique presión sobre la jeringa y complete la inyección en un plazo de cinco a siete segundos. Después, retire la aguja de la cola de la vena y aplique presión con la bola de algodón en el lugar de la inyección para detener el sangrado. Se debe observar un aumento de la frecuencia respiratoria debido a la sangre diluida y se deben administrar inyecciones exitosas.Monitoree la boca durante 15 a 30 minutos, luego vuelva a transferirlo al bario. Una vez que el ratón alcanza una frecuencia respiratoria normal, la entrega hidrodinámica de genes utiliza la presión hidrodinámica generada por una inyección rápida de líquido de gran volumen en un vaso sanguíneo para superar las barreras físicas de la membrana celular del endotelio que impide que el ADN ingrese a las células del parénquima. Las células del parénquima se transfectan porque la proximidad al endotelio capilar permite el acceso inmediato al ADN.Una vez que se rompe la barrera endotelial. Segunda parte, generación de osteoclastos in vitro a partir de macrófagos de médula ósea de ratón, el primer paso es sacrificar los huesos de tibia y fémur aislados de ratón. Enjuague la médula ósea con una jeringa cargada con PBS, luego cuente las células y luego coloque una placa breve.Después de sacrificar al ratón donante y extraer los huesos del fémur y la tibia, la médula ósea se introduce en un tubo de 50 mililitros. Usando una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 25 cargada con PBS, mezcle y luego transfiera la suspensión de médula ósea a un nuevo tubo de 50 mililitros pasándolo a través de un colador de células de nylon. Después de pasar la suspensión de médula ósea a través de una centrífuga de filtro de células de nailon, descienda por las células y vuelva a suspenderla en un medio de cultivo de osteoclastos, prepare una placa de 96 pocillos con rodajas de dentina de cinco milímetros.Del mismo modo, puede preparar una placa de 96 pocillos utilizando cubreobjetos de vidrio de cinco milímetros. Observe la rebanada de dentina colocada a la izquierda y el engobe de la cubierta de vidrio a la derecha usando un hemo, citómetro o contador de células automatizado, cuente las celdas y luego coloque 300,000 celdas en deslizamientos de cubierta de vidrio o rodajas de abolladura colocadas en la placa de 96 pocillos e incube en una incubadora a 37 grados Celsius. Retire todos los medios que contengan todas las células no adherentes y agregue un nuevo medio de clase también suplementado con MCSF durante 48 horas.Después de 48 horas, retire todos los medios y luego agregue los medios osteoclastos que contengan MCSF de ratón y rango de ratón para iniciar la osteoclastogénesis, retire y reponga los medios cada tres días según sea necesario. Clase osteo madura definida por la formación de células trampa positivas multinucleadas. Formación y reabsorción de F activa en la dentina tercera parte.También generación de clases in vitro a partir de pbmc humano. Agregue 10 mililitros de histo pack precalentado en un tubo de 50 mililitros y el filtro de leucocitos obtenido de un banco de sangre enjuagado con PBS en un tubo de 50 mililitros. A continuación, coloque la sangre sobre la solución del paquete de histo muy lentamente, asegurándose de que la sangre no se mezcle con la solución del paquete de histo.Observe cómo la sangre se coloca en capas sobre las muestras de centrífuga de solución del paquete histo a 2.250 RPM durante 20 minutos a 18 grados centígrados. Fíjate en la capa de pelaje Buffy en el centro de las tres capas. Después de la centrifugación, aísle la capa de capa leucitaria blanca que contiene los glóbulos blancos y transfiérala a un nuevo tubo de 50 mililitros.Luego, después de completar el paso, diluya las celdas con PBS y centrifugue nuevamente a 1800 RPM durante cinco minutos para recolectar las celdas. Después de la centrifugación, elimine el nombre super. Vuelva a suspender las células en los medios de cultivo de osteoclastos, mezcle y agite las células y los medios juntos.Cuente las células con hemo, citómetro o contador de células Prepare una placa de 96 pocillos con rodajas de abolladura o deslizamientos de cubierta de vidrio como se demostró anteriormente en este video. A continuación, coloque 1 millón de células por pocillo en los envoltorios de la cubierta de vidrio o en las rodajas de abolladura 24 horas después del enchapado. Agregue MCSF humano a los medios de cultivo.Cambie el medio de cultivo, reponiendo las células con MCSF humano cada dos o tres días, según sea necesario. A continuación, se procede a la etapa de diferenciación mediante la adición de ligando de rango humano suplementado con MCSF humano y medios osteoclastos para iniciar la osteoclastogénesis, osteoclastos maduros definidos por la formación de células multinucleadas atrapadas positivas, formación de anillos de actina F y reabsorción en los resultados de la dentina. Aquí describimos nuestro modelo de ratón de osteoclastogénesis in vivo utilizando la administración hidrodinámica de un mini círculo de ligando de rango soluble, ADN, así como el cultivo in vitro y la diferenciación de células precursoras.A los osteoclastos. La figura uno muestra la transferencia exitosa de genes de GFP y el minicírculo del ligando de rango en ratones, la figura dos muestra imágenes representativas de médula ósea de ratón o cultivos de diferenciación celular PBMC de células precursoras a osteoclastos por microscopía de campo claro, la figura tres muestra imágenes representativas de tres métodos independientes para caracterizar osteoclastos derivados de la médula ósea de ratón. Demostramos que la presencia de ligando de rango soluble activa la expresión y liberación de la figura trampa tres A y B, la formación de anillos de actina F.Figura tres C y D. También mostramos por microscopía electrónica de barrido que el liquen de rango soluble induce la formación de fosas de reabsorción en la dentina figura tres E y F. La figura cuatro muestra los mismos métodos de caracterización en osteoclastos derivados de PBMC. Una vez más, la presencia de ligando de rango soluble activa la expresión y liberación de la trampa figura cuatro A y B. La formación de anillos de actina F figura cuatro C y D y ligando de rango soluble induce la formación de fosas de reabsorción en la dentina figura cuatro E y F. Juntas, estas técnicas forman poderosas herramientas de investigación para la diferenciación y activación de la clase osteo. Con estos sistemas, somos capaces de generar osteoclases in vivo e in vitro y definir los estímulos y señales necesarios para la proliferación y activación, así como probar la eficacia de los inhibidores farmacológicos y biológicos.

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Medicine

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Un examen longitudinal de la pérdida ósea en los fémures y tibias de ratones adultos se llevó a cabo después de una lesión de la médula espinal utilizando secuencial de dosis baja de rayos X de los análisis. La pérdida de hueso tibia se detectó durante todo el estudio, mientras que la pérdida ósea en el fémur no se detectó hasta 40 días después de la lesión.

Evaluación longitudinal de ratón posteriores pérdida de masa ósea del miembro después de una lesión de la médula espinal utilizando Novel, En vivo Metodología

Los modelos animales se utilizan con frecuencia para estudiar la metástasis del cáncer de hueso. En este protocolo vamos a describir dos métodos comunes de la inoculación del tumor para los estudios de metástasis óseas y describir brevemente algunos de los análisis utilizados para supervisar y cuantificar estos modelos.

Los modelos de metástasis en los huesos

La medición cuantitativa de la función de progenitores de médula en la curación de la fractura requiere alta resolución tecnología de imágenes en serie. Aquí, se proporcionan protocolos para el uso de microscopía intravital y seguimiento osteo-linaje secuencialmente imagen y cuantificar la migración, proliferación y diferenciación de osteogénicas células madre / progenitoras endógenas en el proceso de reparación de fractura ósea.

Secuencial<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura

Combinado de imágenes ópticas y μCT en un modelo de ratón de infección implante ortopédico, la utilización de una cepa bioluminiscente ingeniería de Staphylococcus aureus, siempre que la capacidad de supervisar de forma no invasiva y longitudinalmente la dinámica de la infección bacteriana, así como la respuesta inflamatoria correspondiente y cambios anatómicos en la hueso.

Combinado<em&gt; En vivo</em&gt; Óptica y μCT imágenes para vigilar la infección, inflamación y Hueso anatomía en una infección de implantes ortopédicos en ratones

El protocolo describe un novedoso modelo de cámara de ventana de fémur murino que se puede utilizar para rastrear el movimiento de las células en la médula ósea femoral in vivo. La microscopía de fluorescencia multifotónica intravital se utiliza para obtener imágenes de tres componentes de la médula ósea femoral (vasculatura, matriz de colágeno y neutrófilos) a lo largo del tiempo.

Fémur Window Cámara Modelo de<em&gt; En Vivo</em&gt; Seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Describimos un protocolo in vivo para medir la dorsiflexión del pie tras la estimulación del nervio peroneo y la contracción del compartimento crural anterior de la extremidad posterior de la rata. Estas mediciones son una herramienta traslacional indispensable para evaluar la patología del músculo esquelético y los enfoques de ingeniería de tejidos para la reparación y regeneración muscular.

Aplicaciones de la<em&gt; En Vivo</em&gt; Pruebas funcionales de la rata tibial anterior para la evaluación de la ingeniería tisular de reparación del músculo esquelético

Los pequeños peces de laboratorio se han convertido en modelos populares para la investigación ósea sobre los mecanismos subyacentes a los trastornos óseos humanos y para el cribado de fármacos moduladores óseos. En este reporte, describimos un protocolo para evaluar el efecto del alendronato sobre las células óseas en larvas de medaka con lesiones osteoporóticas.

El tratamiento de drogas y<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen de osteoblasto-osteoclastos Interacciones en un modelo Medaka pescado osteoporosis

El objetivo de este protocolo es generar un modelo de fractura de compresión vertebral relacionada con la osteoporosis rata desnudo que puede ser evaluados longitudinalmente en vivo usando un microcomputed semiautomatizado basado en tomografía cuantitativa análisis estructural.

Semiautomatizado Longitudinal basado en la tomografía Microcomputed cuantitativo análisis estructural de un modelo de rata desnuda fractura Vertebral relacionada con la Osteoporosis

El protocolo propuesto implica un enfoque global para evaluar la formación ósea en el contexto de la regeneración ósea mediante análisis multimodales. Su objetivo es proporcionar información cualitativa y cuantitativa sobre la formación de hueso nuevo, mejorando el rigor y la validez de las investigaciones básicas y preclínicas.

Caracterización integral de la mineralización tisular en un modelo ex vivo

El modelo de lesión de la médula ósea murina es una herramienta útil para estudiar la osteogénesis postnatal a través de la osificación intramembranosa. Este protocolo quirúrgico simplificado describe el procedimiento de ablación de la médula ósea para la evaluación posterior de la formación de hueso nuevo y las respuestas celulares después de una lesión.

Metodología mejorada para el estudio de la osteogénesis postnatal mediante osificación intramembranosa en un modelo de lesión de médula ósea murina

Aquí, presentamos un enfoque de terapia génica que administra quitosano recubierto de ABE directamente a la médula ósea mediante inyección intraósea.

Mejora de la entrega y expresión génica mediante inyección intraósea de nanopartículas de quitosano Encapsulado en plásmidos de base de adenina

Aprende una técnica de transferencia de genes in vivo mediante entrega hidrodinámica de ADN mini-círculo RANKL y protocolos de cultivo celular in vitro para generar osteoclastos a partir de macrófagos de médula ósea de ratón y células PBMC humanas.

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