Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

El objetivo general de este procedimiento es producir una preparación ex vivo del órgano nasal de ratón conectado funcionalmente, o VNO, un bulbo olfativo accesorio o un OB. Esto se logra realizando primero una disección gruesa del cráneo del ratón para aislar un solo hemisferio del hocico y el bulbo olfatorio. En el segundo paso, los delicados axones VNO y un OB se exponen a través de una disección secundaria en una cámara de perfusión de tejidos. Finalmente, se inserta una cánula delgada en el VNO a través de la cual se puede introducir el olor y el estímulo.

En última instancia, los registros electrofisiológicos se pueden utilizar para medir la actividad neuronal dentro del OB A durante la estimulación del OVN. La ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes, como la electrofisiología de corte in vitro, es que con esta técnica, el órgano sensorial y los circuitos neuronales posteriores permanecen funcionalmente conectados. La demostración visual de este método es fundamental, ya que hay muchos pasos de disección delicados que son difíciles de aprender, y porque los errores en cualquiera de estos pasos pueden resultar en una disección fallida. Para comenzar la disección primaria, primero use pinzas Addin para extraer los huesos parietal y frontal del cráneo del ratón, teniendo cuidado de no hacer contacto con los bulbos olfativos.

A continuación, use un bisturí para hacer un corte coronal a través del lóbulo frontal, dos milímetros mimo a los senos paranasales y luego retire el cordón cerebral al corte. Use tijeras rectas para eliminar los aspectos expuestos del cráneo ventral, dejando los senos paranasales y el tejido nervioso restante. Retire el arco cigomático y los músculos faciales en el lado derecho anatómico del cráneo y luego gire el hocico con el lado ventral hacia arriba.

Para exponer el paladar, inserte inmediatamente la punta de la hoja del bisturí debajo de la paleta paralela al paladar y luego mueva la hoja hacia los incisivos. Agarre el borde rostral liberado de la paleta con las pinzas y retire el paladar tirando con cuidado. Luego, en el lado anatómicamente izquierdo del cráneo, inserte solo la punta de la hoja del bisturí en el vacío cerca de los molares y gire la muñeca para extender el agujero palatino codosamente.

Comenzando desde el pequeño agujero cerca de los molares, use la punta de la hoja del bisturí para continuar cortando desde el agujero palatino a través de los incisivos, comenzando rostral hasta el VNO anatómica izquierdo con múltiples cortes de raya. A continuación, gire el pañuelo de modo que el cráneo dorsal quede hacia arriba y oriente una hoja de afeitar recta vertical y paralela a la línea media en el borde de la cojo de la preparación en el borde ventral del tejido, toque el borde cortante de la hoja de afeitar inmediatamente a la izquierda de la línea media y balancee suavemente la hoja moviéndose a lo largo del palatino izquierdo para Raymond, manteniendo la hoja paralela a la roca de la línea media. La hoja de afeitar se mueve lentamente con presión hacia la parte anterior del tejido, deteniéndose inmediatamente después de romper la resistencia en la placa cribiforme.

Agarre los hemisferios expuestos cerca de los lados del mimo con los dedos enguantados y gírelos suavemente lateral y anterior para separar los tejidos. Ahora aplique de 50 a 100 microlitros de pegamento para tejidos en una tabla de plástico delgada. Agarre el pañuelo con pinzas y seque la preparación con una toalla de papel para eliminar el exceso de humedad de su lado lateral.

Use las pinzas para colocar suavemente el borde lateral del hemisferio derecho sobre el pegamento. A continuación, coloque una gota de grasa al vacío de tres a cinco milímetros de diámetro y dos milímetros de profundidad en el centro de una cámara de disección secundaria y coloque el lado de la tabla opuesto al tejido firmemente contra la grasa. Llene inmediatamente la cámara de disección con disección refrigerada, líquido cefalorraquídeo artificial o LCR A, y transfiera la cámara al área de disección fina.

A continuación, se comienza la profusión de la cámara con LCR estándar A oxigenado orientando la tabla de modo que el bulbo olfativo quede directamente en la corriente del líquido recién oxigenado para realizar. La disección secundaria Comience con el uso de pinzas finas para eliminar cualquier bulbo olfatorio contralateral visible o tejido cortical. A partir de la preparación, ubique la duramadre blanca a lo largo de la superficie medial dorsal del bulbo olfatorio y, luego, con dos pares de pinzas finas, desgarre la duramadre agarrándola por la parte más blanca y separando las pinzas.

A continuación, lenta y cuidadosamente, retire la corteza frontal con pinzas finas sin dañar los bulbos olfativos subyacentes. Una vez separada la corteza frontal, se corta y retira el tejido ventral y posterior al OB A teniendo cuidado de no dañar la capa glomerular. A continuación, pase un solo punto de las pinzas finas entre el cartílago septal y el ala del VNO, una pieza delgada de tejido óseo que corre a lo largo del borde dorsal de ambos VN Os.To retire con cuidado el VNO contralateral después de quitar el VNO por completo, use pinzas finas para hacer un corte en el borde ventral del cartílago septal, donde se estrecha a un avascular blanco que corre a lo largo del borde ventral del hueso septal.

Pellizque las pinzas finas para hacer una punta semi roma e inserte las pinzas de pellizco lateralmente al corte. A continuación, levante lentamente el cartílago lejos del tejido septal procediendo sin alterar el tejido septal subyacente. Agarre el hueso con pinzas y mueva suavemente el hueso hacia adelante y hacia atrás hasta que se agriete cerca de la placa de reforma de la cuna.

Ahora, conecte una cánula de poliamida a un dispositivo de perfusión rápida e inicie un flujo de solución de timbre de 0,1 a 0,3 mililitros por minuto a través de la cánula de poliamida. Mida el caudal con un medidor de flujo de volumen pequeño en línea. Por último, oriente la cánula en paralelo a la entrada VNO.

Cuando la cánula está en su lugar, observe cómo la presión de salida hace que el VNO se infle, lo que lleva a la evacuación del vaso sanguíneo. A continuación, inserte inmediatamente la cánula en el VNO, manteniendo constante el ángulo de la cánula para que permanezca paralela a la abertura del VNO y comience la evaluación de la función fisiológica. Una gran fuente de variabilidad entre las preparaciones es la densidad y fragilidad de los huesos del cráneo y el hocico de los animales de experimentación.

No es raro que los tejidos septales permanezcan unidos al hemisferio contralateral, especialmente cerca de los puntos de unión a los huesos dorsales del hocico. Otros errores de disección comunes surgen durante la disección fina secundaria, durante la cual los axones del nervio nasal RO pueden dañarse en el tejido septal cerca del VNO o cerca del OB. Estos y otros eventos similares darán lugar a una conectividad incompleta entre las neuronas sensoriales nasales RO y la representación A OB. Los preparativos son inutilizables una vez finalizado con éxito el procedimiento.

La conectividad funcional se puede verificar utilizando un ensayo fisiológico, como registros electrofisiológicos de una sola unidad de actividad neuronal en respuesta a la estimulación de VNO con odorantes. Al intentar este procedimiento, es importante mantener la calma y tomar descansos cortos. Si te fatigas, pequeños errores en la realización de esta técnica pueden dañar estas delicadas estructuras neuronales.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar disecciones ex vivo del sistema de fábrica de accesorios tempranos para estudios electrofisiológicos o de imagen.