Name: Análisis de Redes Tubular membrana en miocitos cardiacos de aurículas y los ventrículos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende a analizar redes tubulares de membrana en miocitos cardíacos de aurícula y ventrículo de ratón mediante tinción en células vivas y microscopía confocal. Este protocolo permite evaluar cuantitativamente la complejidad de la red de TATS.

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Este trabajo recibió apoyo a través de Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subproyectos A05 y B05 a S.E.L.) y KFO 155 (subproyecto 4 a S.E.L.), un premio de la Fundación Halbach a S.E.L. que apoya a E.W.; una beca de la Sociedad Alemana de Cardiología a S.B.; y un programa de intercambio del DAAD que apoya a T.K. como visitante en la Universidad de Maryland. La investigación que ha conducido a estos resultados ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea FP7/2007-2013 en virtud del acuerdo de subvención nº. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (a S.E.L.). S.E.L. es investigador principal del Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK).

<ol><li>Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Ca2%2B+signaling+in+the+heart+the+role+of+ryanodine+receptor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity.</a> J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).</li>
<li>Wehrens, X. H., Lehnart, S. E., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+release+and+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium release and cardiac disease.</a> Annu Rev Physiol. 67, 69-98 (2005).</li>
<li>Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+excitation-contraction+coupling+into+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Propagation of excitation-contraction coupling into ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 428 (3-4), 415-417 (1994).</li>
<li>Williams, G. S., Chikando, A. C., Tuan, H. T., Sobie, E. A., Lederer, W. J., Jafri, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+calcium+sparks+and+calcium+leak+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of calcium sparks and calcium leak in the heart.</a> Biophys J. 101 (6), 1287-1296 (2011).</li>
<li>Sperelakis, N., Rubio, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R.+orderly+lattice+of+axial+tubules+which+interconnect+adjacent+transverse+tubules+in+guinea-pig+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">R. orderly lattice of axial tubules which interconnect adjacent transverse tubules in guinea-pig ventricular myocardium.</a> J Mol Cell Cardiol. 2 (3), 211-220 (1971).</li>
<li>Soeller, C., Cannell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B.+of+the+transverse+tubular+system+in+living+cardiac+rat+myocytes+by+2-photon+microscopy+and+digital+image-processing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">B. of the transverse tubular system in living cardiac rat myocytes by 2-photon microscopy and digital image-processing techniques.</a> Circ Res. 84 (3), 266-275 (1999).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">et al. ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Oort, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+junctional+membrane+complexes+and+hyperactive+ryanodine+receptors+after+acute+junctophilin+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice.</a> Circulation. 123 (9), 979-988 (2011).</li>
<li>Wagner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+emission+depletion+live-cell+super-resolution+imaging+shows+proliferative+remodeling+of+T-tubule+membrane+structures+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulated emission depletion live-cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction.</a> Circ Res. 111 (4), 402-414 (2012).</li>
<li>Asghari, P., Schulson, M., Scriven, D. R., Martens, G., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+tubules+of+rat+ventricular+myocytes+form+multiple+junctions+with+the+sarcoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Axial tubules of rat ventricular myocytes form multiple junctions with the sarcoplasmic reticulum.</a> Biophys J. 96 (11), 4651-4660 (2009).</li>
<li>Lukyanenko, V., Ziman, A., Lukyanenko, A., Salnikov, V., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+groups+of+ryanodine+receptors+in+rat+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional groups of ryanodine receptors in rat ventricular cells.</a> J Physiol. 583 (Pt 1), 251-269 (2007).</li>
<li>Shacklock, P. S., Wier, W. G., Balke, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+transients+%28Ca2%2B+sparks%29+originate+at+transverse+tubules+in+rat+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ transients (Ca2+ sparks) originate at transverse tubules in rat heart cells.</a> J Physiol. 487 (Pt 3), 601-608 (1995).</li>
<li>Reynolds, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctophilin-2+is+necessary+for+T-tubule+maturation+during+mouse+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Junctophilin-2 is necessary for T-tubule maturation during mouse heart development.</a> Cardiovasc Res. 100 (1), 44-53 (2013).</li>
<li>Di Maio, A., Karko, K., Snopko, R. M., Mejia-Alvarez, R., Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+formation+in+cardiac+myocytes+two+possible+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">T-tubule formation in cardiac myocytes two possible mechanisms.</a> J Muscle Res Cell Motil. 28 (4-5), 231-241 (2007).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+density+of+transverse+tubules+and+L-type+Ca%282%2B%29+channels+in+canine+tachycardia-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Reduction in density of transverse tubules and L-type Ca(2+) channels in canine tachycardia-induced heart failure.</a> Cardiovasc Res. 49 (2), 298-307 (2001).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circ Res. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
<li>Lyon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+T-tubules+and+other+changes+to+surface+topography+in+ventricular+myocytes+from+failing+human+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6854-6859 (2009).</li>
<li>Crossman, D. J., Ruygrok, P. N., Soeller, C., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+organization+of+excitation-contraction+coupling+structures+in+failing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in the organization of excitation-contraction coupling structures in failing human heart.</a> PLoS One. 6 (3), e17901(2011).</li>
<li>Kemi, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+exercise+training+on+transverse+tubules+in+normal%2C+remodeled%2C+and+reverse+remodeled+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of exercise training on transverse tubules in normal, remodeled, and reverse remodeled hearts.</a> J Cell Physiol. 226 (9), 2235-2243 (2011).</li>
<li>Sachse, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+structures+and+function+of+myocytes+impaired+during+heart+failure+are+restored+by+cardiac+resynchronization+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular structures and function of myocytes impaired during heart failure are restored by cardiac resynchronization therapy.</a> Circ Res. 110 (4), 588-597 (2012).</li>
<li>Arakel, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+electrical+properties+of+the+heart+by+differential+trafficking+of+KATP+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tuning the electrical properties of the heart by differential trafficking of KATP ion channel complexes.</a> J Cell Sciences. 127 (Pt 9), 2106-2119 (2014).</li>
<li>Richards, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+tubules+are+a+common+feature+in+large+mammalian+atrial+myocytes+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1996-H2005 (2011).</li>
<li>Trafford, A. W., Clarke, J. D., Richards, M. A., Eisner, D. A., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+microdomains+and+the+t-tubular+system+in+atrial+mycoytes+potential+roles+in+cardiac+disease+and+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling microdomains and the t-tubular system in atrial mycoytes potential roles in cardiac disease and arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 98 (2), 192-203 (2013).</li>
<li>Greiser, M., Schotten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+remodeling+of+intracellular+Ca2%2B+signaling+during+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic remodeling of intracellular Ca2+ signaling during atrial fibrillation.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 134-142 (2013).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2%2B+transients+and+membrane+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> J Vis Exp. (77), 10-3791 (2013).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+genetic+manipulation+of+adult+cardiac+myocytes+for+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mouse intact cardiac myocyte mechanics cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> J Gen Physiol. 137 (1), 81-91 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%2C+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji, an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+histological+sections+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of histological sections Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
<li>Liu, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale+space+approach+to+directional+analysis+of+images%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Scale space approach to directional analysis of images.</a> Appl Opt. 30 (11), 1369-1373 (1991).</li>
<li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem Biophys Res Commun. 72 (1), 327-333 (1976).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li>
<li>Kohl, T., Westphal, V., Hell, S. W., Lehnart, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+in+heart+-+cardiac+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy in heart - cardiac nanoscopy.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 13-21 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses.

En las células del músculo estriado sanos, estructuras de membrana tubulares con orientaciones &quot;transversales&quot; (T-túbulos) perpendiculares al eje de células principales son abundantes. En consecuencia, los túbulos T se han caracterizado como extensiones continuas de la célula muscular principal &quot;lateral&quot; membrana de la superficie (sarcolema), que penetran profundamente el citosol hacia el centro de la celda. El papel fisiológico de los túbulos T continuo con la membrana de la superficie exterior es el acoplamiento eléctrico rápido de los compartimentos intracelulares remotas formadas por dominios de contacto de orgánulos SER en todo el volumen relativamente grande de células del músculo cardiaco por acoplamiento de proximidad nanométrica de voltaje activado de tipo L de Ca 2 + canales (Cav1.2) corriente de entrada (I Ca) activación de los receptores de rianodina adyacente (RyR2) SER Ca 2 + comunicados. En miocitos ventriculares (VM), los contactos de membrana no continuos (&quot;uniones&quot;) entre los dominios de unión de SER y T-tubules se cree que controlar miles de nanodominios liberación de Ca2 + intracelular individuales en cada celda 1. Para cualquier dominio contacto dado, las porciones de membrana yuxtapuestos cada uno de los T-túbulos y el periférico (unión) SER son aproximadamente 15 nm cerca uno del otro, por lo tanto, se define como nanodomain. De esta manera, muy pequeñas subespacios citoplasmáticos individuales son segregados que permiten comportamientos compartimiento células autónomas cuasi. Cuando un potencial de acción entrante activa los canales Cav1.2 en los túbulos T de máquinas virtuales, una parte relativamente pequeña de Ca2 + hacia adentro corriente aumentará rápidamente el subespacio concentración de Ca2 + [Ca 2 +] S en el attoliter nanodomain tamaño 1. A continuación, la [Ca 2 +] S aumento de Ca2 + activa los receptores de rianodina -gated (RyR2) dentro de la proximidad del nanómetro en la unión entre la membrana SER yuxtapuesta, y este proceso de acoplamiento se produce a lo largo de toda pareja eléctricamented miocitos nanodominios. RyR2s producen racimos de múltiples canales como densas con una estequiometría estimado de 1 canal Cav1.2 durante 5-10 RyR2 canales 2. Desde la SER-a citosol [Ca 2 +] gradiente es muy empinada (relación 10 4: 1) y RyR2s funcionan como alta conductancia Ca 2 + canales de liberación de los clústeres funcionalmente acoplados, RyR2 activación resulta en una gran cuantitativamente Ca 2 + versión actual de T-túbulos junto dominios SER unión crecientes subespacial local de [Ca 2 +] S 100 M o superior dentro de 1-2 ms 3,4. Este comportamiento amplificación de la señal cardiaca también se conoce como Ca 2 + inducida por Ca 2 + en libertad (CICR). Tomados en conjunto, los túbulos T son esenciales estructuras de membrana que activan rápidamente las señales de liberación de Ca 2 + a través de contactos SER nanodomain de unión y CICR ​​en toda la célula durante la excitación-contracción de acoplamiento (CE). Además de los túbulos T, túbulo axials (A-túbulos) con una orientación significativamente diferente paralela a las principales (longitudinal) del eje de células han sido documentados por microscopía electrónica (EM), y estudios de microscopía confocal de 2 fotones. Por ejemplo, una red continua de toda la célula de A-túbulos entre miofibrillas interconectados con T-túbulos cerca sarcómero Z-líneas se demostró por trazadores extracelulares y EM imágenes de conejillo de indias fijo VM 5. Uso de la tinción con fluoresceína dextrano ligado extracelular y vivir de imágenes 2-fotón de rata máquinas virtuales, una red de túbulos 3D reticular complejo se visualizó que consiste en ~ 60% túbulos T y ~ 40% A-túbulos 6. Este estudio no sólo llevó a la visualización en 3D de abundantes A-túbulos, sino también a la comprensión de que el corte para la visualización EM está inherentemente limitado para el análisis de redes complejas y dinámicas de membrana como el sistema túbulo-transversal axial (TATS). En consecuencia, confocal imágenes de células vivas de las membranas TATS directamente manchada con di-8-ANNEPS fue desarrollado. Si de células vivasRedes TATS se analizaron por transformación de Fourier, el aspecto habitual de componentes túbulo-T en el espacio cerca del sarcómero líneas z se refleja en el espectro de potencia de conjunto de una región de señales estriados 7. Esta estrategia de análisis indirecto se ha utilizado para detectar cambios regionales en todo el componente de células en la regularidad TATS en modelos de enfermedad 7. Por ejemplo, shRNA mediada junctophilin-2 derribo provocó insuficiencia cardíaca y la deficiencia de proteína específica isoforma resultaron en reorganización T-túbulos con nanodomain Ca 2 + disfunción versión 8. Recientemente hemos ampliado el análisis de las redes de membrana TATS a través de enfoques cuantitativos directos y aún más por microscopia de super-resolución de células vivas de los componentes individuales en TATS ratón máquinas virtuales utilizando el agotamiento de la emisión estimulada (STED) nanoscopía 9. Resolución de imagen nanométrica permitido para el análisis directo de los componentes TATS individuo más pequeños, que se aproximan una distribución 50:50 de transversalfrente a las orientaciones del túbulo axiales, confirmando cuantitativamente dos componentes TATS abundantes todavía orientados diferencialmente individuales en corazones sanos ratón 9. Estas estrategias se describen con más detalle en la sección del protocolo de abajo. Aunque el papel fisiológico de los abundantes componentes A-túbulos en el corazón adulto se ha mantenido enigmático, EM estudios han documentado estructuras de membrana SER asociados con A-túbulos que sugieren endógena Ca 2 + nanodominios liberación en cobaya y rata VMs 5,10. Confocal análisis de Cav1.2 y RyR2 encontró un alto grado de colocalización en las uniones A-túbulo 10. Desde ~ 20% de los espontáneos Ca 2 + chispas en rata VMs originó relativamente lejos de estrías Z-línea donde normalmente se producen túbulos T, un argumento ha sido que, efectivamente, pueden existir y funcionar nanodominios A-túbulo asociados como Ca 2 + sitios de liberación 11,12. Curiosamente, la formación de túbulos T-OC y la maduracióncurs sólo después del nacimiento y es paralelo al crecimiento de las células cardíacas, por ejemplo, a través de la brotación de invaginaciones del sarcolema precursor en P5 y inmadura ramificados asambleas red TATS en P10 en ratones 13. Parece que Junctophilin-2 es particularmente importante para la maduración postnatal red TATS desde shRNA knock-down impidió que el anclaje de las membranas de los túbulos T-SER a los cruces que conduce a un retraso en la liberación de Ca2 + y la organización TATS patológicas compatibles con arquitecturas inmaduros A-túbulo dominadas en VM 13. Estas observaciones pueden en última instancia conducir a una prueba de concepto de que los túbulos T se forman a través de procesos de invaginación de la membrana, mientras que A-túbulos pueden transformarse a través de mecanismos intracelulares adicionales o incluso alternativas 14. Caracterización de TATS cambios de membrana en las enfermedades del corazón se ha convertido en un área de investigación importante para cuestiones fisiopatológicas. Los informes iniciales en un modelo canino de estimulación inducida failu corazónre mostraron una pérdida de túbulos T y actual Cav1.2 (I Ca) 15. Un modelo de cerdo de miocardiopatía isquémica demostraron una reducción de la densidad de los túbulos-T y una sincronía reducido intracelular de Ca 2 + en libertad 16. Utilizando un modelo de ratas espontáneamente hipertensas (SHR) de la insuficiencia cardíaca, una pérdida de túbulos T se asoció con una reducción de acoplamiento nanodomain de Cav1.2 y RyR2 por el mecanismo propuesto de &quot;RyR2 orfandad&quot; 7. Una pérdida de túbulos T también se ha demostrado en las VM humana a partir de muestras de miocardiopatía isquémica, dilatadas, hipertróficas y 17. Además, se informó de un aumento de la A-túbulos en secciones de tejido de miocardiopatía dilatada humana 18. A raíz de un infarto de miocardio, mostramos un mecanismo diferencial de TATS reorganización en ratón VM con disminuciones significativas de los túbulos T, en contraste con los aumentos de los componentes A-túbulo 9. Es importante destacar que, la mejora de contraste local de lograrse a través de la membrana de células vivas superresolución STED microscopía de activar el análisis de componentes cuantitativa detallada a través de mediciones directas, que mostraron una proliferación significativa de la A-túbulos con aumentos globales de la longitud de la red TATS y complejidad de ramificación 9. Además, se demostró que el entrenamiento físico puede revertir la remodelación T-túbulo en ratas después de infarto de miocardio 19 y que la terapia de resincronización cardiaca puede conducir a revertir la remodelación de los túbulos T en perros con insuficiencia inducida tachypacing fibrilación corazón 20. En conjunto, los estudios tanto en las intervenciones terapéuticas potenciales humano enfermo y animal máquinas virtuales, así como posiblemente se beneficiarán de los procedimientos de aislamiento de células de alta calidad y estrategias de análisis cuantitativos detallados como se indica en el protocolo y los resultados de las secciones a continuación. Además, como se ha demostrado recientemente por superficie lateral frente TATS el tráfico de membrana de canal de KATP isoformas 21, es importante tener en cuenta m fibrilaciónyocytes (AMS) como biológicamente diferentes, así como comparativas modelo celular cardiaca frente a las máquinas virtuales. T-túbulos fueron recientemente documentados en ovejas y acompañamiento humano 22. La evidencia actual sugiere que existen pocos túbulos T en células de AM y normalmente en los mamíferos más grandes, como las ovejas y los seres humanos, pero no en los roedores pequeños 23. A diferencia de las máquinas virtuales, en los AM aparece intracelular de Ca 2 + liberación se produzca a partir de la propagación de la superficie celular por difusión hacia el centro de la celda que se traduce en marcado Ca espacial y temporal 2 + gradientes 23. Dentro de este marco parece importante dilucidar los mecanismos de Ca 2 + señalización intracelular inestabilidad de las formas de enfermedades comunes tales como la fibrilación auricular 24. En resumen, tanto el aislamiento de células AM y VM y cada uno de los corazones sanos y enfermos se emplean comúnmente protocolos. Sólo si el aislamiento de células se hace correctamente, a juzgar por la documentación microscópico de calidad suficiente de células, las muestras de AM y VM deben ser carried hacia adelante para el análisis cuantitativo TATS. Por consiguiente, las siguientes secciones de protocolo son críticamente dependientes de células de alta calidad aislados de ratón o de otras especies, seguido por microscopia de células vivas para analizar las membranas intactas TATS. Como se ha señalado anteriormente, la caracterización de membranas TATS es un área de investigación difícil, con una propensión a la fijación y preparación de artefactos 6, los cambios de la membrana debido a alteraciones osmóticos y limitaciones de la resolución de la microscopía de luz convencional 9. Tomamos nota de que los protocolos recientes del estado de la técnica para el aislamiento de los AM humanos de Ca 2 + de imágenes y patch-clamp y de rata máquinas virtuales para el cultivo celular se han publicado previamente en esta revista 25,26.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Chemicals and Enzymes</td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime</td><td>Sigma-Aldrich, Múnich, Alemania</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Suero para terneros bovinos</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Alemania</td><td>SH30073</td><td>Triple 0.1 &micro; m Filtrado estéril.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, Múnich, Alemania</td><td>21115</td><td>Diluido 1:10 en agua MQ para obtener 100 mM de concentración de CaCl2 stock.</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo II</td><td>Worthington a través de Cell Systems, Troisdorf, Alemania</td><td>a petición</td><td>La actividad enzimática depende de los lotes individuales de colagenasa. La colagenasa II y otras actividades enzimáticas (caseinasa, clostripina, trípticas) se pueden evaluar en la "herramienta de selección de lotes de colagenasa". Determine el rendimiento y la calidad de las células individualmente para cada nuevo lote de colagenasa.</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Rotexmedica, Trittau, Alemania</td><td>PZN-03862340</td><td>Diluida en NaCl al 0,9% e inyectada por vía subcutánea en la piel abdominal.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Foreno 100% (V/V)</td><td>Abbott, Libertyville, IL, EE. UU</td>. <td>B506</td><td>Agente activo: isoflurano, 250 ml. Utilice aproximadamente 2 Vol% en el instrumento dispensador de aire/oxígeno.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Laminina (2 mg/ml)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Alemania</td><td>354232</td><td>La laminación se describe en el paso 2.1.</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>8283.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>4984.2</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>HN01.1</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>4721.2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dyes</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>D-3167</td><td>Solución madre de 2 mM en DMSO</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich, Múnich, Alemania</td><td>T8154</td><td>Trypan blue se mezcla suavemente 1:1 mediante una pipeta de plástico de 1 ml con suspensión de células antes del recuento de células en el citómetro de Neubauer.</td></tr><tr><td colspan="4">Langendorff Termostato de perfusión</td></tr><tr><td>Circulation</td><td>Lauda, Lauda-K&ouml; nigshofen, Alemania</td><td></td><td>Véase Louch et al. (JMCC 2011). Caliente el termostato y los tampones en el tubo de perfusión a 37 & deg; C 15 min antes de usar.</td></tr><tr><td>Tubo de silicona flexible Tygon para bomba peristáltica</td><td>VWR, Darmstadt, Alemania</td><td>224-2252</td><td>El tubo debe cambiarse regularmente.</td></tr><tr><td>Tubo de silicona flexible Tygon para termostato</td><td>VWR, Darmstadt, Alemania</td><td>228-4340</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de perfusión envolvente con serpentín calefactor</td><td>Rettberg, G&ouml; ttingen, Alemania</td> hecho <td>a medida</td><td>La bobina y los tubos de calefacción deben limpiarse a fondo con agua MQ después de su uso. No utilice detergentes. Los componentes de vidrio deben bañarse regularmente&nbsp; en 10 mM de NaOH durante la noche.</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Ismatec, Wertheim, Alemania</td><td>ISM830</td><td></td></tr><tr><td>Llave de paso de tres vías Discofix C Luer Lock 10 cm</td><td>Braun, Melsungen, Suiza</td><td>16500C</td><td></td></tr><tr><td>Llave de paso de tres vías Discofix 3SC</td><td>Braun, Melsungen, Suiza</td><td>4095146</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instruments</td></tr><tr><td>42 mm cubreobjetos</td> <td>de vidrioMenzel Gl&auml; ser a través de Thermo Scientific, Schwerte, Alemania</td><td>a petición</td><td>0,13-0,16 mm de espesor</td></tr><tr><td>Cánula 21 G</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, EE. UU</td><td>. 304432</td><td>Cortado a una longitud de ~5 mm, desbastado con papel de lija.</td></tr><tr><td>Cubreobjetos para citómetro Neubauer 24 x 24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser a través de Thermo Scientific, Schwerte, Alemania</td><td>bajo pedido</td><td>Pinza de Graefe de 0,38-0,42 mm de grosor</td></tr><tr><td>, puntas de 0,5 mm, ligera curva</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710 NLO</td><td>Carl Zeiss, Jena, Alemania</td><td></td><td>Objetivo de aceite 63X 1.4 NA</td></tr><tr><td>Citómetro mejorado Neubauer</td><td>Labor Optik, Friedrichsdorf, Alemania</td><td>1100000</td><td>Procedimiento de recuento: Limpie el citómetro y el cubreobjetos provistos con la cámara de recuento con etanol al 70 %. Presione suavemente el cubreobjetos sobre la cámara de conteo para que las dos superficies de vidrio estén en contacto y se puedan observar los anillos de Newton. Posteriormente, 10-20 &micro; La suspensión de celdas L se puede aplicar al borde del cubreobjetos para ser aspirado al vacío por acción capilar. Cuente los miocitos intactos frente a los defectuosos utilizando los cuadrados de la cuadrícula del citómetro que refleja 100 nl. Repita el procedimiento de conteo en la segunda cuadrícula provista en el citómetro. Calcule la densidad de las células en su suspensión celular original teniendo en cuenta las diluciones y los atajos de conteo.</td></tr><tr><td>Cámara de imagen POC-R2</td><td>Pecon, Erbach, Alemania</td><td></td><td>Volumen de suspensión de la celda: 800 &micro; l; densidad de recubrimiento deseada: ~1,000 AM y ~10,000 VM</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte, hojas de 8 mm rectas, romas</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #7 para estudiantes, acero inoxidable</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris para estudiantes, curvas, 11,5 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras para iris para estudiantes, rectas, 11.5 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras surcigales para estudiantes, rectas, afiladas, 12 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de tejido, 1 x 2 dientes, delgadas, 10 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>11023-10</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de redes tubular membrana en miocitos cardiacos de aurículas y los ventrículos

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

En los miocitos cardíacos, una compleja red de túbulos de membrana, el sistema de túbulos axiales transversales (TATS), controla las funciones de señalización intracelular profundas. Si bien la membrana de la superficie externa y los componentes asociados de la membrana TATS parecen ser continuos, existen diferencias sustanciales en el contenido de lípidos y proteínas. En los miocitos ventriculares (VM), ciertos componentes de TATS son muy abundantes, lo que contribuye a las redes de túbulos rectilíneos y a las arquitecturas 3D de ramificación regular. Se cree que los componentes periféricos de TATS propagan potenciales de acción desde la superficie celular a miles de dominios de contacto de membrana del retículo sarcoendoplasmásico intracelular (SER) remotos, activando así las unidades de liberación de Ca2+ intracelular (CRU). A diferencia de las VM, la organización y el papel funcional de las membranas de TATS en los miocitos auriculares (AM) es significativamente diferente y mucho menos conocida. En conjunto, la caracterización estructural cuantitativa de las redes de membrana de TATS en miocitos sanos y enfermos es un requisito previo esencial para una mejor comprensión de la plasticidad funcional y la reorganización fisiopatológica. Aquí, presentamos una combinación estratégica de protocolos para el análisis cuantitativo directo de redes de membranas TATS en VM y AM vivas. Para ello, acompañamos los aislamientos de células primarias de VM y/o AM de ratón con pasos críticos de control de calidad y protocolos de tinción directa de membrana para la obtención de imágenes de fluorescencia de membranas TATS. Utilizando un flujo de trabajo optimizado para el procesamiento de imágenes TATS confocal o de superresolución, se generan datos binarizados y esqueletizados para el análisis cuantitativo de la red TATS y sus componentes. A diferencia de las estrategias de análisis de imágenes agregadas regionales indirectas publicadas anteriormente, nuestros protocolos permiten la caracterización directa de componentes específicos y derivan propiedades fisiológicas complejas de las redes de membrana de TATS en miocitos vivos con herramientas de software de alto rendimiento y acceso abierto. En resumen, la estrategia de protocolo combinado se puede aplicar fácilmente para estudios cuantitativos de la red TATS durante la adaptación fisiológica de los miocitos o los cambios en la enfermedad, la comparación de diferentes tipos de células cardíacas o del músculo esquelético, el fenotipado de modelos transgénicos y las intervenciones farmacológicas o terapéuticas.

En los miocitos cardíacos, estructuras tubulares de membrana forman redes intracelulares. Se describen protocolos para i) el aislamiento de los miocitos de corazón de ratón, incluyendo el control de calidad, ii) la tinción de células vivas para la microscopía de fluorescencia estado-of-the-art optimizado, y iii) el análisis de imagen directa para cuantificar la complejidad de los componentes y la plasticidad de la membrana intracelular redes.

Análisis de Redes Tubular membrana en miocitos cardiacos de aurículas y los ventrículos

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar las redes de membranas tubulares en miocitos auriculares y ventriculares. Esto se logra aislando primero los miocitos auriculares y ventriculares del corazón de un ratón adulto. En el segundo paso, el sistema de túbulos axiales transversales o tats se tiñe en los miocitos cardíacos aislados vivos intactos.A continuación, se visualiza la red de membranas de tats mediante microscopía de fluorescencia confocal o stead, y luego se analizan cuantitativamente los componentes de la red. En última instancia, las diferencias entre las redes de membranas de diferentes tipos de células o entre grupos simulados y de tratamiento pueden revelarse mediante el análisis cuantitativo de imágenes de tatuajes. La principal ventaja de esta técnica de aislamiento y análisis celular es que un flujo de trabajo completo del proceso de aislamiento conduce a la obtención de imágenes de fluorescencia directa de los miocitos, lo que permite el análisis de datos cuantitativos de la red de membrana táctil.Este método puede proporcionar información sobre la organización de redes complejas de membranas en cardiomiocitos vivos y sanos, pero también se puede aplicar a miocitos de animales enfermos o transgénicos. Los recién llegados a este protocolo se beneficiarán de una formación introductoria adicional para lograr un aislamiento constante de los miocitos cardíacos de alta calidad y un requisito previo importante para realizar la técnica: para aislar los miocitos, comience por perfundir el corazón de un ratón de 12 semanas o más con un tampón de perfusión oxigenado a 37 grados centígrados durante cuatro minutos tan pronto como sea posible la extracción del órgano. A continuación, examine el corazón con un tampón de digestión de 37 grados centígrados durante ocho a 10 minutos, controlando el progreso de la digestión del tejido para aumentar la opacidad, la suavidad y la acidez en toda la superficie aparente del corazón.Después de la digestión, desvíe el apéndice auricular derecho y diseccione la aurícula derecha justo por encima de las válvulas ventriculares auriculares. Continuar la disección con la aurícula izquierda y luego diseccionar y desechar el aparato valvular fibroso. Termine la disección liberando las paredes ventriculares libres izquierda y derecha, así como el tabique y las partes más pequeñas del tejido, según sea necesario.A continuación, transfiera todo el tejido ventricular a una placa de Petri de 60 milímetros que contenga 2,5 mililitros de tampón de digestión y, a continuación, corte el tejido en trozos cúbicos de aproximadamente un milímetro. Coma lentamente los trozos de tejido con una pipeta de transferencia para disociar suavemente los miocitos ventriculares en una suspensión unicelular, teniendo cuidado de evitar burbujas o daños por chorros de líquido. A continuación, añada 7,5 mililitros de tampón de parada a la suspensión de la célula.Paralelamente, corte el tejido auricular digerido en trozos cúbicos de aproximadamente un milímetro en un mililitro de digestión, tampón en una placa de Petri de 60 milímetros y luego tritrate suavemente los miocitos auriculares como se acaba de demostrar. Después de la agitación mecánica, agregue cuatro mililitros de tampón de parada para detener la actividad residual de la colagenasa en la suspensión de miocitos auriculares. A continuación, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y deje que los trozos de tejido restantes se sedimenten durante 15 segundos antes de cosechar los miocitos aislados con la fracción supinada.Después de un paso de lavado, suspenda suavemente los miocitos auriculares en cinco mililitros de tampón de perfusión y divida la suspensión celular en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros en aproximadamente una vez 10 a las tres alícuotas celulares para teñir las membranas tat de los miocitos ventriculares. Primero, deje que las células se asienten por gravedad durante ocho minutos y un tubo de reacción de 1,5 mililitros para teñir los miocitos auriculares envía, rechace las células durante dos minutos a 20 veces G a temperatura ambiente para cualquier tipo de célula. A continuación, retire con cuidado el supinato teniendo cuidado de evitar cualquier agitación innecesaria de la célula granulada.A continuación, vuelva a suspender suavemente las células en 800 microlitros del tinte tyle específico de la membrana, el colorante ocho y eps, transfiera inmediatamente los miocitos a cubreobjetos recubiertos de laminina en una cámara de imagen después de una incubación de 15 minutos en el lavado oscuro. La tapa se desliza una vez y luego se cubren con un mililitro de tampón de perfusión. Tome una imagen de muestra de una sección central de miocitos intracelulares y, a continuación, utilice la función de recorte para ajustar la ventana de recorte y el tamaño de píxel final a 100 por 100 nanómetros.Para seleccionar el plano de imagen final, utilice fotogramas de imagen individuales para elegir manualmente el plano de imagen más adecuado en la dirección Z. Confirmar que la red de membranas de TA incluye componentes tubarios t y a tubarios y es visualmente evidente en el plano focal. Tenga en cuenta que un plano de imagen intracelular típico puede incluir un núcleo como punto de referencia intracelular central.Para analizar la red de membranas tats y sus componentes, ahora abra el archivo de imagen utilizando el software de análisis de imágenes adecuado. Utilice la herramienta de selección de polígonos para delinear la región de interés mientras excluye la membrana de la superficie exterior e incluye porciones intracelulares de la red de membranas tats, como se muestra en esta imagen. A continuación, utilice los comandos editar y borrar fuera para generar el ROI seleccionado de modo que el área intracelular seleccionada contenga solo las partes de la membrana intracelular de la red tats, pero no ninguna parte de la membrana de la superficie.Ahora haga clic en procesar y restar fondo y establezca el radio de la bola rodante en cinco píxeles. A continuación, seleccione el proceso y mejore el contraste local. Y establezca el tamaño del bloque en 49, los bins del histograma en 256, la pendiente máxima en tres y la máscara en ninguno.Haga clic en procesar y suavizar debajo de los complementos, seleccione segmentación y fusión de regiones estadísticas y establezca el parámetro en Q 100. A continuación, haga clic en mostrar promedios. A continuación, seleccione el tipo de imagen y ocho bits y, a continuación, seleccione el ajuste de imagen y el umbral, comenzando con un umbral de 40.Tenga en cuenta que la elección correcta del umbral debe producir solo estructuras de membrana tats específicas y no señales falsas positivas debidas al ruido de fondo. Luego, en complementos, seleccione esqueleto y 2D 3D esqueletizado y guarde la imagen 2D esqueletizada como un archivo adoptivo. Ahora seleccione los complementos nuevamente y analice skeleton 2D 3D para analizar el archivo de imagen esqueletizado para la salida de datos cuantitativos.A continuación, seleccione ninguno para el método de ciclo de poda y confirme la generación automática de la tabla de datos resultante. Ahora utilice la direccionalidad del complemento Fiji para analizar las orientaciones individuales de los componentes de la red fiscal apropiados a partir de los datos de imagen esqueletizados. En método, elija componentes FURIER, bins finales 180 y un inicio de histograma de menos 45 grados.Por último, compruebe la tabla de visualización y genere un histograma de direccionalidad. En esta primera figura, se muestra una imagen esqueletizada representativa de los tats en un miocito ventricular sano compuesto por elementos transversales que son perpendiculares al eje X de la imagen y de componentes axiales que están en paralelo al eje x. La aplicación del complemento de direccionalidad da como resultado un histograma de orientación para los tats ventriculares con picos comparables a cero grados, representando la proporción axial y a 90 grados representando la transversal. Por el contrario, una imagen esqueletizada representativa de los tats en un miocito auricular se compone principalmente de componentes axiales que son paralelos al eje X de la imagen.Por lo tanto, el histograma de orientación correspondiente exhibe un pico dominante alrededor del intervalo de cero grados que representa la proporción de tatuajes axiales y solo un pequeño pico a 90 grados, que representa la proporción transversal de tatuajes. Al intentar este procedimiento, es importante verificar la calidad de la célula en cada paso después del aislamiento celular, durante la obtención de imágenes y, lo que es más importante, justo antes del análisis de la imagen. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se diferencian completamente las estructuras de membrana complejas, las redes tes y las proteínas potencialmente asociadas a la membrana. Los miocitos cardíacos adultos pueden ser visualizados por microscopía confocal y analizados cuantitativamente.No olvide que trabajar con ojos de membrana lipofílica, enzimas digestivas y pacientes cardíacos potencialmente infecciosos, EM puede ser un peligro, y que siempre se deben tomar precauciones como la protección de la piel con hierro al realizar estos procedimientos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se describe el aislamiento de miocitos auriculares humanos que pueden ser utilizados para el Ca...

El aislamiento de miocitos auriculares humanos para la medición simultánea de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitorios y corrientes de membrana

Se pueden aislar del corazón cardiomiocitos individuales de ratones de tipo salvaje y mutantes para estudiar su contractilidad y transitorios de calcio. Esto permite caracterizar la contribución de la disfunción celular a la disfunción cardíaca por cualquier causa.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Los conocimientos actuales sobre las bases celulares de las enfermedades cardiacas se basa principalmente en estudios sobre modelos animales. Aquí describimos y validar un nuevo método para obtener cardiomiocitos viables individuales de pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. Miocitos ventriculares humanos pueden ser utilizados para estudios electrofisiológicos y las pruebas de drogas.

Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

Las mutaciones que conducen a defectos cardíacos congénitos se benefician de la investigación in vivo de la estructura cardíaca durante el desarrollo, pero los estudios estructurales de alta resolución en el corazón embrionario de ratón son técnicamente desafiantes. Aquí presentamos un método robusto de inmunofluorescencia y análisis de imágenes para evaluar las estructuras específicas de los cardiomiocitos en el corazón de ratón en desarrollo.

Análisis para el Desarrollo de los cardiomiocitos mediante inmunofluorescencia en el corazón de embriones de ratón

Este protocolo describe un método novedoso para crear un modelo de elementos finitos espacial detallada de la arquitectura intracelular de cardiomiocitos de imágenes de microscopía confocal y microscopia electrónica. La potencia de este modelo espacial detallada se demuestra mediante estudios de caso en la señalización de calcio y bioenergética.

Creando un modelo geométrico realista estructural de elementos finitos de cardiomiocitos para estudiar el papel de la arquitectura celular de cardiomiocitos biología de sistemas

Este protocolo se utiliza para aislar cardiomiocitos auriculares individuales del corazón adulto del ratón utilizando un enfoque de digestión de trozos. Este enfoque se utiliza para aislar los miocitos auriculares derecho o izquierdo que se pueden utilizar para caracterizar la electrofisiología de miocitos auriculares en estudios de abrazaderas de parches.

Aislamiento de miocitos auriculares de ratones adultos

Se describe un método para el aislamiento simultáneo de micocitos y no miocitos tanto de las adriículas como de los ventrículos de un solo corazón de ratón adulto. Este protocolo da como resultado rendimientos consistentes de micocitos cardíacos altamente viables y no miocitos y detalla condiciones óptimas de cultivo específicos de células para fenotipado y análisis in vitro.

Aislamiento simultáneo y cultura de los miocitos atriales, los miocitos ventriculares y los no miocitos de un corazón de ratón adulto

La formación de una red adecuada de sarcomere es importante para la maduración de los cardiomiocitos derivados del iPSC. Presentamos un enfoque basado en la super resolución que permite la evaluación cuantitativa de la maduración estructural de los cardiomiocitos derivados de células madre, para mejorar las condiciones de cultivo promoviendo el desarrollo cardíaco.

Análisis de la red α-Actinin en cardiomiocitos humanos derivados de iPSC mediante microscopía de localización de molécula única

Aquí, describimos una metodología fácil de usar para generar matrices de microtejidos cardíacos autoensamblados en 3D compuestos por cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes prediferenciadas inducidas por humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Esta técnica fácil de usar y de baja capacidad de células para generar microtejidos cardíacos se puede implementar para el modelado de enfermedades y las primeras etapas del desarrollo de fármacos.

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

Se presenta un conjunto de protocolos que describen la medición de la función contráctil a través de la detección de la longitud del sarcómero junto con la medición transitoria de calcio (Ca2+) en miocitos aislados de rata. También se incluye la aplicación de este enfoque para estudios en modelos animales de insuficiencia cardíaca.

Análisis de disfunción contráctil cardíaca y transitorios de Ca2+ en miocitos de roedores

Aprende a analizar redes tubulares de membrana en miocitos cardíacos de aurícula y ventrículo de ratón mediante tinción en células vivas y microscopía confocal. Este protocolo permite evaluar cuantitativamente la complejidad de la red de TATS.

Análisis de Redes Tubular membrana en miocitos cardiacos de aurículas y los ventrículos

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