Combinando clasificación magnética de las células madre y las pruebas de fluctuación para analizar la inestabilidad del genoma Durante mitótico Aging Cell en Saccharomyces cerevisiae

El objetivo general del siguiente experimento es determinar si los cambios en las frecuencias de mutación con un aumento de la replicación. La edad de las células de levadura se debe simplemente a rondas adicionales de división celular o a cambios específicos de la edad en las tasas de acumulación de mutaciones. Esto se logra midiendo primero las frecuencias y tasas de mutación en células jóvenes mediante la dispersión de células en medios selectivos y no selectivos para calcular una frecuencia de mutación predicha para células de edades crecientes debido a la acumulación de mutaciones con cada ronda de división celular.

A continuación, una población de células de levadura se marca con biotina cultivada en cultivo líquido y las células marcadas originales se recuperan mediante clasificación magnética para obtener células madre envejecidas que han sufrido varias divisiones celulares. A continuación, las células madre envejecidas se vuelven a generar para aumentar su edad y luego se clasifican de nuevo o se tiñen para las cicatrices de los glúteos, y luego se extienden a medios selectivos y no selectivos para determinar su edad replicativa media y la frecuencia de mutación. Se obtienen resultados que muestran si hay aumentos o disminuciones específicos de la edad en la acumulación de mutaciones, basándose en una comparación de la frecuencia de mutación observada experimentalmente con la frecuencia de mutación predicha para las células de la edad media observada. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del envejecimiento, como si los cambios en las tasas de acumulación de daño genético contribuyen al envejecimiento normal, o si los efectos de alteración de la vida útil de varios factores genéticos y ambientales, en parte se deben a cambios en las tasas de mutación.

Melissa Patterson, estudiante de posgrado en mi laboratorio, demostrará el procedimiento para establecer una tasa de mutación de referencia por generación de células utilizando pruebas de fluctuación para células cultivadas en condiciones de cultivo estándar. Para cada cultivo replicado, diluya las células de uno a 2000 y extienda de uno a cuatro microlitros en un medio no selectivo para determinar las unidades formadoras de colonias por mililitro. Granule las células restantes a 2.400 g durante un minuto en una microcentrífuga y use 100 microlitros de agua para resuspenderlas antes de esparcirlas en un medio selectivo para identificar los mutantes.

Después de incubar las placas a 30 grados centígrados durante tres días, contar las colonias, determinar la tasa de mutación inicial y la frecuencia de acuerdo con el protocolo de texto adjunto para etiquetar charmy CCI con biotina: Comience por rayar el cultivo de un stock de glicerol en un medio YPD e incubar a 30 grados centígrados durante uno a tres días. Con una punta de pipeta estéril, transfiera las células de la placa a al menos un mililitro de agua. Tenga en cuenta que de uno a un centímetro y medio de una porción gruesa de la raya dará aproximadamente 10 a las ocho celdas.

Utilice un hemocitómetro para determinar la densidad celular exacta para cada cepa o condición de tratamiento. Utilice un caldo de reactivo de biotina de cinco milimolares para etiquetar de 10 a ocho células por punto de recolección de acuerdo con el procedimiento estándar del fabricante. Realice todos los pasos de centrifugación durante cinco minutos a cuatro grados centígrados después del lavado final.

Use agua para suspender las células marcadas hasta una concentración final de 10 a ocho células por mililitro para verificar la viabilidad celular, diluya 10 microlitros de células con 23 microlitros de agua y 67 microlitros de 0.4% de azul de Triam en un XPBS, incube las células durante 40 minutos a temperatura ambiente antes de usar un hemocitómetro para marcar células vivas o no teñidas y muertas o teñidas. Después de medir los valores basales para la edad celular y la frecuencia de mutación, de acuerdo con el protocolo de texto, transfiera las células marcadas con biotina a 20 mililitros de medio YPD. Imagina las ocho celdas.

Cultive los cultivos durante 16 a 18 horas a 20 grados centígrados a aproximadamente 10 a ocho células por mililitro. No permita que las células alcancen la fase estacionaria y, si es necesario, manténgalas a cuatro grados centígrados durante varias horas para optimizar el momento del período de crecimiento y recolección. Después de determinar la densidad celular y peletizar las celdas a cuatro grados centígrados, lave las celdas agregando 30 mililitros de etiquetado de perlas, tampón y vórtice, luego centrifugue la suspensión y vierta el sobrenadante.

Después de un segundo lavado, suspendemos las células en 50 microlitros de tampón de etiquetado de perlas. Pretenda las ocho celdas totales por vórtice. Agregue dos microlitros de perlas magnéticas, simule las ocho celdas totales y, después del vórtice, incube brevemente en hielo durante 10 minutos, invirtiendo periódicamente.

A continuación, use 30 mililitros de tampón de etiquetado de cuentas para lavar las celdas tres veces. A continuación, añada 0,5 mililitros de tampón de etiquetado de perlas. Simule las ocho celdas totales y haga un vórtice breve de la bolita en una configuración media hasta que las celdas se vuelvan a suspender.

Vierta la suspensión a través de un colador de células de 40 micras en un tubo de 50 mililitros para eliminar los grumos de células restantes. Si es necesario, deje las celdas en hielo durante una o dos horas antes de cargarlas en la columna. Siga el protocolo recomendado por el fabricante para las columnas magnéticas, utilizando hasta dos veces 10 por las nueve celdas totales por una.

Tenga cuidado de quitar cualquier elemento aireable al cargar las columnas y retire y reemplace la columna en el separador entre lavados para evitar que las celdas queden atrapadas entre las cuentas. Cuando utilice separadores de varias columnas para procesar varias columnas de la misma muestra, eluya todas en el mismo tubo de recolección para reducir el tiempo de manipulación y disminuir la pérdida de células si lo desea. Guarde el flujo a través de los pasos de unión y lavado para analizar las células jóvenes producidas por las células madre después de concentrar las células por centrifugación a 3000 Gs durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, aspire todo menos un mililitro de tampón.

Imagina las ocho células marcadas con biotina originales. A continuación, haga un vórtice breve para suspender las células del búfer restante. Use azul de triam para teñir una alícuota de células diluidas y use un hemocitómetro para determinar la densidad celular y la viabilidad.

A continuación, calcule el número total de células recuperadas. Si el número de células es sustancialmente mayor de lo esperado, pase la muestra de elución a través de otra columna para tratar de eliminar las células jóvenes contaminantes. Si el número de celdas es sustancialmente menor de lo esperado, pase el flujo guardado.

Muestree a través de otra columna para tratar de mejorar el rendimiento de las células madre si lo desea. Vuelva a generar células para aumentar la edad replicativa y siga el etiquetado y la clasificación de las perlas sin el etiquetado de biotina. Para determinar la edad replicativa, transfiera 25 microlitros de células recuperadas a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y use un mililitro de un XPBS para lavar las celdas dos veces para etiquetar las cicatrices de las yemas en la superficie de las células.

Utilice 180 microlitros de un XPBS y 20 microlitros de WGA conjugado con fluorescencia para resuspender las células, cubra el tubo de centrífuga de 1,5 mililitros con papel de aluminio e incube con un balanceo suave a 30 grados centígrados durante 30 minutos después de la incubación. Use un XPBS para lavar las celdas tres veces. Luego, para la microscopía fluorescente, use un reactivo Antifa para montar las células en portaobjetos para evitar el movimiento de las células durante la toma de imágenes.

Cura completamente los portaobjetos en la oscuridad durante un máximo de unos días. Cuente las cicatrices de las yemas en al menos 50 células por muestra para obtener una medida representativa de la edad celular. Alternativamente, después de suspender las células en un XPBS, realice la citometría de flujo utilizando la configuración descrita en el gráfico de protocolo de texto, cicatrices de yemas en células jóvenes y células de edad contadas por microscopía en el eje Y contra la media geométrica normalizada de la fluorescencia conjugada WGA de las mismas poblaciones celulares en el eje x.

Finalmente, obtenga la ecuación de una línea de tendencia lineal para esta relación Para su posterior sustitución, la media geométrica normalizada de la intensidad de fluorescencia conjugada WGA de una población celular para X en la ecuación y resuelva Y para determinar la edad celular promedio de una muestra. Este gráfico ilustra que la tasa de mutación en el gen can one fue similar antes y después del etiquetado con biotina: en las poblaciones independientes de levadura joven, las frecuencias de mutación también fueron similares en las células jóvenes antes y después del etiquetado con biotina cuando se cultivaron a 20 grados Celsius o 30 grados Celsius. El gráfico que se muestra aquí muestra lo que se puede observar al contar las células recuperadas después del marcaje de la biotina y la clasificación de las células no tratadas o las células tratadas con peróxido de hidrógeno milimolar después de la primera clasificación.

El número de células puede parecer mayor de lo esperado después de la primera clasificación, y se espera una pequeña pérdida progresiva de células con la clasificación continua. La edad replicativa se determinó mediante conteo manual de células marcadas con fluorescencia, pero cicatrices en las células, como se muestra aquí como se ve en esta figura. La señal fluorescente pero cicatricial de la citometría de flujo se comparó con los recuentos manuales para obtener una relación lineal que permita determinar la edad replicativa de las poblaciones de células madre y control mediante citometría de flujo.

Estos gráficos muestran ejemplos de frecuencias de mutación observadas similares o elevadas de células madre envejecidas en comparación con las frecuencias predichas calculadas a partir de la edad promedio de las células madre y las frecuencias y tasas de mutación obtenidas para las poblaciones de células jóvenes. Dependiendo de la ubicación genómica de la puede un gen siguiendo este procedimiento. Se pueden utilizar otros métodos, como la tinción de especies reactivas de oxígeno o morfología ular, para responder a preguntas adicionales, como qué cambios en la fisiología celular están asociados con los cambios relacionados con la edad en la acumulación de mutaciones.