Name: Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprende a identificar interacciones proteína-proteína mediante microarrays de proteínas funcionales de alta densidad. Este método permite el análisis paralelo de miles de interacciones en proteomas completos.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención de los NIH. Los ensayos que se muestran en la Figura 1 fueron realizados por el Dr. Joseph Fasolo. Agradecemos al Dr. Rui Chen por sus útiles comentarios.

1. Preparación de la sonda <ol><li> Cultura y purificar las sondas V5-quinasa de fusión utilizados para examinar las interacciones con otras proteínas como sigue: <ol><li> Utilice recién rayada cepa Y258 de levadura (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) que contiene proteína V5-fusión (expresado desde GATEWAY vector pYES-DEST52). Utilice la proteína aislada como sonda en los microarrays. Placa de la levadura en completa-uracilo sintético (Sc-Ura) / 2% de dextrosa / Agar y crecer a 30 ° C durante 3 días a partir de cultivo congelado (-80 ° C glicerol). </li><li> Inocular cultivos iniciadores (5-20 ml) de una sola colonia y crecer durante la noche en SC-ura / 2% de dextrosa en agitación plataforma (220-250 rpm) o rueda a 30 ° C. </li><li> A la mañana siguiente, inocular 400 ml de la Sc-Ura / 2% cultura rafinosa con cultivo iniciador suficiente para una DO final de 600 0.1. </li><li> Cultivar los inóculos a OD 600 de 0,6, seguido de galactosa inducción de la fu V5-quinasaSion constructo de expresión mediante la adición de una solución de levadura Extracto de 3x / peptona (YEP) suplementado con 6% de galactosa, mediante la adición de suficiente para diluir los medios de inducción por un factor de 3 para que concentración final de galactosa es 2%. </li><li> Inducir a las células a 30 ° C durante 6 horas en una plataforma de agitación. Utilice un matraz de 2 L Erlenmeyer para asegurar la aireación adecuada. </li><li> Cosecha células utilizando un rotor JA-10 (o comparable) haciendo girar 400 ml de suspensión celular a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Se lavan las células una vez con 50 ml de hielo búfer y transferir a un tubo cónico de 50 ml de PBS frío. Lavar el pellet de nuevo en hielo tampón PBS frío (sin detergentes u otros aditivos) que se utilizan para la lisis y traslado a 2 ml complemento tapa tubos para la lisis. </li><li> Girar las células a 20.000 xg durante 1 min a 4 ° C en un precipitado y pipeta de distancia el búfer. </li><li> Coloque los tubos en hielo y continúe con el paso de lisis. </li><li> Lyse las células (250-350 l pellet) con 00,5 mm perlas de óxido de circonio en una proporción 1: 1: 1 volumen de sedimento celular, cuentas, y solución salina tamponada con fosfato (PBS) lisis de amortiguación y agitar la mezcla usando una plataforma de agitación 3 veces a intervalos de 2 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar el lisado a 20.000 xg en una microcentrífuga de sobremesa durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Pipeta sobrenadante en el tubo de centrífuga de policarbonato de alta velocidad y aclarar por ulracentrufugation durante 30 minutos a 150.000 xg a 4 ° C. </li><li> Transferir el lisado aclarado a un tubo que contiene resina de Ni 2+ prelavado afinidad (~ 100 l) y se incuba en un nutator durante 2 horas a 4 ° C para capturar histidina (His) 6X proteína marcada V5-fusión. </li><li> Lavar la resina tres veces durante 10 minutos a 4 ° C con tampón de lavado. Se precipitan la resina usando una centrífuga de mesa durante 5 min a 1000 xg a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. Añadir tampón de lavado fresca para cada lavado y devolver el tubo de la nutator para la agitación durante el lavado. </li><li> Después del lavado steps son completos, aplicar la resina se lava a una columna fresca G-25 para la elución. </li><li> Aplicar 25 l de tampón de elución de una manera paso a paso empezando con 100 mM de imidazol a 500 mM de imidazol en incrementos de 50 mm para un total de 9 fracciones. </li><li> Ensayo de fracciones recogidas usando gel de poliacrilamida dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) y tinción de Coomassie para identificar la fracción (s) más altamente enriquecido para uso en el ensayo y añadir glicerol al 30% y se almacena a -80 ° C hasta su uso en el ensayo. </li></ol></li></ol> 2. Sondeo los Arrays NOTA: Por favor consulte el paso 2.6 de esta sección para preparar la solución de anticuerpos antes de comenzar el ensayo. <ol><li> Para detectar interacciones, diluir el anticuerpo conjugado-V5 fluoróforo (es decir AlexaFluor 647) a 260 ng / ml en tampón sonda y mezclar bien por agitación. NOTA: Preparar esta solución de anticuerpo 30 min antes de su uso y colocar el tubo en un nutato o rueda para asegurar una mezcla completa y una suspensión homogénea de anticuerpos. </li><li> Diluir la sonda proteína V5-fusión en un rango de concentración de 5-500 g / ml. NOTA: Optimizado para cada ensayo interacción proteína-proteína, utilizando tampón sonda. Optimización implica la adición de más sondas para sondear tampón. Típicamente 10 mg / ml se utiliza como punto de partida y ajusta en consecuencia sobre la base de la intensidad de la señal. </li><li> Retire los microarrays de proteínas del congelador (-20 ° C) y llevar a 4 ° C en el refrigerador justo antes de su uso. </li><li> Añadir tampón de bloqueo directamente al soporte de diapositivas que contiene los micorarrays proteínas y cubrir la parte superior con parafilm para evitar fugas. Bloquear las matrices en tampón de bloqueo durante 1 hr por agitación a 50 rpm en un escenario a 4 ° C. </li><li> Después del bloqueo, transferir los arrays a una cámara humidificada enfriado a 4 ° C, y añadir 90 l de sonda diluida directamente a la superficie de la matriz. Superposición del arrays con un resbalón elevador levantado e incubar estática (sin agitación) en la cámara húmeda a 4 ° C durante 1,5 horas. </li><li> Lavar las matrices 3 veces durante 1 min cada uno en tampón de sonda en tres tubos de 50 ml cónicos. Añadir la diapositiva para tubos cónicos que contienen suficiente búfer sonda pre-enfriado para envolver completamente el portaobjetos. Deje que el deslizamiento elevador se deslice suavemente fuera de los microarrays de proteínas (no lo fuerce fuera ya que esto podría causar daños a la superficie de la matriz). </li><li> Aplicar la solución de anticuerpos directamente a la matriz inmediatamente después de completar el lavado (paso 2.5) y la superposición con una hoja de levantador planteado como antes. Incubar las matrices de 30 min a 4 ° C en la cámara de humidificado. </li><li> Realice el mismo paso de lavado como antes (3 veces 1 min en tampón de sonda), y centrifugado en un tubo cónico de 50 ml a 800 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min a temperatura ambiente. Seque las matrices en un soporte de diapositivas en la oscuridad durante 30 minutos antes de la exploración de la matriz en 647 nm. </li></ol>

<ol><li>Fasolo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+protein+kinase+interactions+identified+by+protein+microarrays+reveal+novel+connections+between+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes.</a> Genes. 25, 767-778 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProCAT%3A+a+data+analysis+approach+for+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays.</a> Genome biology. 7, R110(2006).</li>
<li>Breitkreutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+protein+kinase+and+phosphatase+interaction+network+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast.</a> Science. 328, 1043-1046 (2010).</li>
<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415, 141-147 (2002).</li>
<li>Jeong, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+monospecific+monoclonal+antibodies+using+a+human+proteome+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293, 2101-2105 (2001).</li>
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<li>Gelperin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).</li>
<li>Fasolo, J., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).</li>
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<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El protocolo presentado se realizó originalmente con 85 proteínas únicas fusión quinasa-V5 de proteínas de levadura para comparar la actividad de unión a través de familias distintas y relacionadas de quinasas de proteínas de levadura que resulta en la identificación de nuevas redes de interacción quinasa in vivo 1. Como la tecnología de perfiles proteómicos emergentes, el desarrollo de alto rendimiento (HTP) proyección de proteomas utilizando microarrays de proteínas confiado en bibliotecas de pépti...

La necesidad de realizar análisis globales de bioquímica de proteínas y la actividad in vivo de unión se ha traducido en el desarrollo de nuevos métodos para perfiles de interacciones proteína-proteína (IBP) y las modificaciones post-traduccionales de proteomas enteros 1,3-8. Microarrays de proteínas se fabrican como los microarrays de proteínas funcionales utilizando proteínas funcionales de larga duración 4-6,8,9 o microarrays de proteínas que contienen anticuerpos analíticos 10,11. Están diseñados para contener una alta densidad de proteínas dispuestas en portaobjetos de microscopio con una variedad de químicas de superficie para facilitar una variedad de condiciones experimentales requeridas para la realización de bioquímica amplio análisis 12. Nitrocelulosa y de superficie aldehído químicas para la unión química a través de métodos de fijación de lisina o de afinidad tales como toboganes quelatos de níquel para la fijación de proteínas etiquetadas-Su y el glutatión para la fijación de afinidad entre otros 13. </p&gt; El uso de microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína requiere acceso a una biblioteca de alta calidad de proteína funcional 14. S. cerevisiae es susceptible de producir tal una biblioteca a través de la vinculación de la afinidad alta copia etiquetados construcciones de proteínas con alto rendimiento técnicas de purificación cromatográfica. La gran mayoría de genoma de la levadura ha sido secuenciado y casi todo el proteoma puede ser expresada a partir de un plásmido de alta copia para la purificación y análisis bioquímicos 12. Una vez que se obtienen las proteínas y dispuestas en formato de 384 pocillos, que se imprimen en un portaobjetos de microscopio que permite un rápido análisis bioquímico multi-paramétrico paralelo e interrogatorio bioinformático 8,14-16. Microarrays de proteínas se han utilizado para ensayos enzimáticos y de las interacciones con proteínas, lípidos, moléculas pequeñas, y ácidos nucleicos, entre muchas otras aplicaciones. La accesibilidad de las proteínas en la superficie del proteomaarrays los hacen susceptibles a diferentes tipos de detección analítica, incluyendo inmune afinidad, resonancia de plasmón superficial, la fluorescencia y muchas otras técnicas. Además, permite un control preciso de la condición experimental donde podría ser difícil de hacer en vivo. El objetivo de este protocolo es demostrar el uso apropiado de los microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína. Esta aplicación permite el análisis bioquímico paralelo de alto rendimiento de las actividades de unión a proteínas utilizando un analito altamente purificada (proteína) de interés. Un C-terminal (carboxi-terminal) etiquetada proteína cebo V5-fusión de interés se produce a partir de un plásmido de alta copia en una cepa de levadura optimizado para la purificación de proteínas. Marcado C-terminal asegura que la proteína de longitud completa se ha traducido. La proteína utilizada en este estudio es Tda1-V5 proteína de fusión de cinasa, que se purificó usando resina de afinidad de níquel a través de una etiqueta His6X. La construc fusión Tda1-V5t se purifica a través de elución serial usando un gradiente de imidazol para eluir la fracción más altamente enriquecido para su uso en el ensayo.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri</td><td>VWR</td><td>NC-10747</td><td>o comparable</td></tr><tr><td>Extracto de levadura Bacto</td><td>Difco</td><td>0217-17</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>Difco</td><td>0118-17</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Rafinosa</td><td>Sigma</td><td>R0514</td><td></td></tr><tr><td>Galactosa</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Sc-Ura Medios de entrega</td><td>MP Bio</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo pequeños</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer grande</td><td>Centrífuga VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr>Rotor <td></td><td></td><td></td><td>JA-10</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (500 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo Falcon (50 ml)</td><td>VWR/Fisher</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tablets</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Tubos (tubo de rosca de 2 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Machine</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td> Zircon Beads BioSpec 11079105 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol (pH = 7.4)</td><td>Sigma</td><td>I5513&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel Completo de Inhibidores (Libre de EDTA)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la fosfatasa 1</td><td>sigma</td><td>P2850</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A1852&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitación (30 &deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Resina de afinidad de níquel</td><td>Life Technologies</td><td>R901-01</td><td></td></tr><tr><td>G25 columna</td><td>GE ciencias de la vida</td><td>27-5325-01 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Gel (NuPage)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal V5</td><td>Life Technologies</td><td>R960-25</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 Etiquetado anticuerpo monoclonal V5</td><td>Life Technologies</td><td>451098</td><td></td></tr><tr><td>Microarrays de proteínas Kit</td><td>Life Technologies</td><td>PAH0525013</td><td></td></tr><tr><td>Genepix Scanner</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lifter Slips</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/</td></tr> <tr><td>tampón de lisis: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM de NaCl, 50 mM de imidazol (pH 7,4), cóctel completo de inhibidores de proteasas &ndash; Cóctel 1 de inhibidor de fosfatasa sin EDTA, 1 mM PMSF&nbsp; (añadir justo antes de usar)</td><td></td><td></td><td>Añadir los reactivos a 1x PBS (0,01 M de tampón de fosfato, 0,0027 M de cloruro de potasio, 0,137 M de cloruro de sodio; pH 7,4) para obtener el volumen deseado de solución de lisis</td></tr><tr><td>Tampón de bloqueo: 1% albúmina sérica bovina (BSA), 0,1% Tween-20</td><td></td><td></td><td>Añada los reactivos a 1x PBS para obtener el volumen deseado de tampón</td></tr> <tr><td>de bloqueoTampón de sonda: 2 mM MgCl2, 0,5 mM TDT, 0,05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 &mu; M ATP (para quinasas), 1% BSA</td><td></td><td></td><td>Agregue el reactivo a 1x PBS para obtener el volumen deseado de tampón de sonda</td></tr><tr><td>Tampón de lavado: 0,1% Triton X-100, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de DTT, 50 mM de imidazol (pH 7,4), 2 mM de MgCl2</td><td></td><td></td><td>Agregue el reactivo a 1x PBS para obtener el volumen deseado de tampón</td></tr> <tr><td>de sondaTampón de elución: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 &ndash; 500 mM de imidazol (pH 7,4), cóctel completo de inhibidores de la proteasa &ndash; Cóctel de inhibidor de fosfatasa sin EDTA 1, 1 mM PMSF (añadir justo antes de usar)</td><td></td><td></td><td>Antes de comenzar, es importante tener en cuenta el gradiente de concentración de imidazol (50 &ndash; 500 mM) y crear tubos separados para cada concentración (es aconsejable crear el intervalo utilizando incrementos de 50 mM). Añadir el reactivo a 1x PBS para obtener el volumen deseado de tampón de sonda</td></tr><tr><td>3x YEP +6% galactosa: Disolver 30 g de extracto de levadura y 60 g de peptona en 700 ml de H2O, y autoclave. Añadir 300 ml de filtro esterilizado al 20% galactosa (peso/vol)</td><td></td><td></td><td>&nbsp; La galactosa no debe esterilizarse en autoclave</td></tr></tbody></table>

sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

De alta densidad de microarrays de proteínas funcionales que contienen ~ 4200 proteínas de levadura recombinantes se examinan las interacciones proteína-proteína quinasa utilizando una proteína de fusión purificada por afinidad levadura quinasa que contiene una etiqueta V5-epítopo para leer-out. Quinasa purificada se obtiene mediante cultivo de una cepa de levadura optimizado para la producción de proteínas de copia alto que alberga un plásmido que contiene una fusión de quinasa-V5 construir bajo un promotor inducible GAL. La levadura se cultiva en medios de comunicación restrictiva con una fuente de carbono neutral durante 6 horas seguido de inducción con 2% de galactosa. A continuación, el cultivo se recoge y se purifica usando quinasa de afinidad estándar técnicas cromatográficas para obtener una proteína quinasa altamente purificada para su uso en el ensayo. La quinasa purificada se diluye con tampón de quinasa a un rango apropiado para el ensayo y los microarrays de proteínas están bloqueados antes de la hibridación con el microarray de proteínas. Después de la hibridación, los arreglos se probaron con antib V5 monoclonalody para identificar proteínas unidas por la proteína quinasa-V5. Por último, las matrices se escanean con un escáner de microarrays estándar, y los datos se extrajeron para el análisis de la informática aguas abajo 1,2 para determinar una alta confianza conjunto de interacciones de proteínas para la validación de aguas abajo en vivo.

Se observó la actividad de interacción proteína-proteína usando un lector de chip estándar para evaluar la fusión de la proteína quinasa Tda1-V5 constructo como una proteína de cebo contra una levadura de microarrays proteína funcional que contiene aproximadamente 4.200 única S. las proteínas de fusión GST cerevisiae. Además de interrogación con el software Genepix reveló una multitud de eventos de diferentes intensidades de unión. La afinidad se mide a partir de la intensidad graduada de la señal deri...

El uso de microarrays de proteínas que contienen casi toda la S. cerevisiae proteoma se sondeó para un rápido interrogatorio imparcial de miles de interacciones proteína-proteína en paralelo. Este método puede ser utilizado para la molécula de proteína pequeña, modificación postraduccional, y otros ensayos en alto rendimiento.

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar las interacciones entre proteínas y proteínas dentro de un proteoma determinado de una manera paralela e imparcial, lo que no es posible con otras tecnologías. Esto se logra mediante la hibridación y el marcado con epítopos de la proteína de interés con una biblioteca de proteínas funcionales de longitud completa altamente purificada depositada en un plano de coordenadas en la superficie de un portaobjetos de microscopio. Una vez que la proteína ha alcanzado el equilibrio con cada una de sus respectivas proteínas objetivo en la matriz, la fracción no unida se lava y las interacciones de la proteína se detectan con un anticuerpo monoclonal contra el epítopo conjugado con una fracción fluorescente utilizando un escáner de micromatriz estándar.Las imágenes resultantes se entrelazan con información sobre la intensidad de cada característica con respecto a la proteína unida y la señal fluorescente. Esta información se extrapola con la ayuda del software de análisis de microarrays para generar una lista de valores de intensidad para cada característica del array. La información sobre el par proteína-proteína que interactúa se puede

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra los experimentos con el posterior análisis de las interacciones proteína-proteína mediante el uso de micro-modelado de superficies. El enfoque ofrece la posibilidad de detectar las interacciones de proteínas en las células vivas y combina una alta capacidad de rendimiento con la posibilidad de extraer información cuantitativa.

En vivo-La detección de interacciones proteína-proteína en la Micro-patrón superficies

En este estudio, se describe un protocolo mejorado para una micromatriz anticuerpo multiplexado de alto rendimiento con el método de detección de lectina que se puede utilizar en perfiles de glicosilación de proteínas específicas. Este protocolo incluye nuevos reactivos fiables y reduce significativamente el tiempo, el coste y los requisitos de equipos de laboratorio, en comparación con el procedimiento anterior.

Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

Este video muestra una técnica que utiliza péptidos biotinilados que penetran en las células para detectar interacciones intracelulares proteína-proteína. Los péptidos que penetran en las células facilitan que el péptido conjugado entre en una célula y se una específicamente a sus proteínas que interactúan. La biotina, después de unirse a la avidina, permite la purificación del complejo de proteínas que interactúan a partir de un lisado celular.

Sonda de péptido biotinilado que penetra en las células para detectar interacciones proteína-proteína

Experimentos de inmunoprecipitación SILAC representan un poderoso medio para descubrir nueva proteína: proteína interacciones. Al permitir la cuantificación relativa precisa de la abundancia de proteínas tanto en el control y las muestras de ensayo, verdaderos interacciones se puede distinguir fácilmente de los contaminantes experimentales, y las interacciones de baja afinidad conservada a través del uso de condiciones de tampón menos estrictos.

Identificación de proteínas compañeros de interacción en células de mamífero utilizando SILAC-inmunoprecipitación cuantitativos Proteómica

El cribado de matrices de péptidos es un ensayo de alto rendimiento para identificar los sitios de interacción proteína-proteína. Esto permite mapear múltiples interacciones de una proteína diana y puede servir como método para identificar sitios para inhibidores que se dirigen a una proteína. Aquí describimos un protocolo para el cribado y análisis de matrices de péptidos.

La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

Las proteínas interactúan entre sí y estas interacciones determinan en gran medida sus funciones. Los socios de interacción de proteínas se pueden identificar a alto rendimiento in vivo utilizando un ensayo de aptitud de levadura basado en el ensayo de complementación de fragmentos de proteínas de dihidrofolato reductasa (DHFR-PCA).

Genoma toda la Proteína-proteína interacción Screening por Complementación de ensayo de proteínas-fragmento (PCA) en las células vivas

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Aquí, presentamos un protocolo de pantalla proteína extracelular microarrays para la identificación de las interacciones receptor-ligando novela en alto rendimiento. También se describe un método para mejorar la detección de interacciones proteína-proteína transitorias mediante el uso de complejos de proteína-microbead.

Tecnología de microarrays de proteínas extracelulares para detección de alto rendimiento de las interacciones ligando-Receptor de baja afinidad

Las proteínas de dominio J de Cognate cooperan con el acompañante Hsp70 para ayudar en una miríada de procesos biológicos que van desde el plegado de proteínas hasta la degradación. Aquí, describimos un ensayo de ligadura de proximidad in situ, que permite el seguimiento de estas máquinas de chaperone formadas transitoriamente en células bacterianas, levaduras y humanas.

Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

Aquí, presentamos un protocolo para permitir la captura e identificación de interacciones proteína-proteína específicas de la enfermedad de células y tejidos nativos utilizando sondas químicas y espectrometría de masas. Los conjuntos de datos de interacción resultantes se analizan a través de una plataforma web dedicada para revelar disfunciones dinámicas de la red y alteraciones de la vía relacionadas con la enfermedad.

Mapeo de interacciones proteína-proteína disfuncionales en la enfermedad

Aprende a identificar interacciones proteína-proteína mediante microarrays de proteínas funcionales de alta densidad. Este método permite el análisis paralelo de miles de interacciones en proteomas completos.

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

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