Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína
2 de agosto de 2015
El uso de microarrays de proteínas que contienen casi toda la S. cerevisiae proteoma se sondeó para un rápido interrogatorio imparcial de miles de interacciones proteína-proteína en paralelo. Este método puede ser utilizado para la molécula de proteína pequeña, modificación postraduccional, y otros ensayos en alto rendimiento.
El objetivo general de este procedimiento es identificar las interacciones entre proteínas y proteínas dentro de un proteoma determinado de una manera paralela e imparcial, lo que no es posible con otras tecnologías. Esto se logra mediante la hibridación y el marcado con epítopos de la proteína de interés con una biblioteca de proteínas funcionales de longitud completa altamente purificada depositada en un plano de coordenadas en la superficie de un portaobjetos de microscopio. Una vez que la proteína ha alcanzado el equilibrio con cada una de sus respectivas proteínas objetivo en la matriz, la fracción no unida se lava y las interacciones de la proteína se detectan con un anticuerpo monoclonal contra el epítopo conjugado con una fracción fluorescente utilizando un escáner de micromatriz estándar.
Las imágenes resultantes se entrelazan con información sobre la intensidad de cada característica con respecto a la proteína unida y la señal fluorescente. Esta información se extrapola con la ayuda del software de análisis de microarrays para generar una lista de valores de intensidad para cada característica del array. La información sobre el par proteína-proteína que interactúa se puede exportar al software de análisis bioinformático posterior para puntuar los datos específicos de la característica e identificar las interacciones proteicas entre la proteína de interés y las proteínas en el microarray.
Los datos brutos de intensidad de la señal se compilan en dos o más micromatrices de proteínas para tener en cuenta la variación entre ensayos e intraensayos, y los datos se normalizan para puntuar cada una de las interacciones. El resultado genera una lista objetivo de proteínas que interactúan, que se puede utilizar para guiar la interrogación posterior de las interacciones entre proteínas y proteínas. El microarray de proteínas funcionales in vivo se desarrolló en el laboratorio de Michael Snyder hace más de 15 años.
Desde entonces, ha habido muchas aplicaciones exitosas de esta tecnología debido a su versatilidad y ensayos proteómicos bioquímicos. Esta técnica facilita el estudio de las interacciones proteicas y las redes de señalización modulares, así como la conectividad alternativa y las cascadas de señalización previamente conocidas. Para cultivar y purificar las sondas de quinasa de fusión V cinco, utilice la cepa de levadura recién rayada Y 2 58 que contiene una placa de proteína de fusión V cinco, la levadura en uracilo completo sintético, agar dextrosa al 2%, y crezca a 30 grados centígrados durante tres días a partir de cultivo congelado. Inocular cultivos iniciadores de una sola colonia y crecer durante la noche en uracilo completo sintético.
2% dextrosa en una plataforma o rueda temblorosa a 30 grados centígrados. A la mañana siguiente, inocule 400 mililitros de un uracilo sintético completo. Cultivo de rafinosa al 2% con suficiente cultivo iniciador para lograr una densidad óptica final de 600 nanómetros o un DO 600 de 0,1.
Cultive los inóculos hasta un OD 600 de 0,6, luego induzca la expresión del constructo de fusión de V cinco quinasas agregando suficiente extracto de levadura tres x. Pep tone suplementado con 6% de galactosa para diluir el medio de inducción por un factor de tres o una concentración final de galactosa de 2%Inducir células a 30 grados centígrados durante seis horas en una plataforma de agitación. Utilice un matraz erlenmeyer de dos litros para asegurar una aireación adecuada.
Coseche las células haciendo girar 400 mililitros de la suspensión celular a 1000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Lave las celdas una vez con 50 mililitros de tampón PBS helado y transfiéralas a un tubo cónico de 50 mililitros. Lave el pellet nuevamente en solución salina tamponada con fosfato helado o tampón A PBS y transfiéralo a dos tubos de tapa a presión de mililitros para lisis.
Después de hacer girar las células a 20.000 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados, retire el tampón con una pipeta y coloque los tubos en hielo. Licíe las células con perlas de circonio de 0,5 milímetros en un volumen de uno a uno a uno de gránulos de células para perlas de lisis de PBS, tampón. A continuación, agite la mezcla tres veces utilizando una plataforma de agitación durante intervalos de dos minutos a cuatro grados centígrados.
Centrifugar el lisado a 20.000 veces, G en un micro fugo de mesa durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el lisado clarificado a un tubo que contenga aproximadamente 100 microlitros de resina de afinidad de níquel prelavada e incube en un nutato durante dos horas a cuatro grados centígrados. Para capturar la histamina, seis x marcadas con V cinco pellets de proteína de fusión la resina utilizando una centrífuga de mesa durante cinco minutos a 1000 veces G y cuatro grados Celsius después de la eliminación del sobrenadante.
Lave la resina con tampón de lavado durante 10 minutos a cuatro grados centígrados en el mutador. Repita el lavado dos veces más con tampón de lavado nuevo. Eluir las proteínas con dos volúmenes de 100 microlitros de 200 milimolares ole.
Agregue glicerol hasta una concentración final del 30% de las muestras y almacene a menos 80 grados Celsius hasta que se use en el ensayo. Para detectar interacciones. Diluir el anticuerpo conjugado V cinco fluoro cuatro a 260 nanogramos por mililitro en la sonda, tamponar y mezclar bien agitando.
A continuación, diluya la sonda de proteína de fusión V five en un rango de concentración de cinco a 500 microgramos por mililitro. A continuación, retire los microarrays de proteínas del congelador y llévelos a cuatro grados centígrados en el refrigerador justo antes de usarlos. Agregue el tampón de bloqueo directamente al soporte de portaobjetos que contiene los microarrays de proteínas y cubra la parte superior con paraforma para evitar fugas.
Bloquea las matrices en el búfer de bloqueo durante una hora agitándolas a 50 RP en un escenario a cuatro grados centígrados. Después del bloqueo, transfiera las matrices a una cámara humidificada, embaldosada a cuatro grados centígrados y agregue 90 microlitros de sonda diluida directamente a la superficie de la matriz. Superponga los arreglos con un deslizador elevador elevado e incube sin agitar en la cámara humidificada a cuatro grados centígrados durante una hora y media Después de la incubación, agregue el portaobjetos a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga suficiente tampón de sonda preenfriado para envolver completamente el portaobjetos, permitiendo que el deslizamiento del elevador se deslice suavemente fuera del microconjunto de proteínas.
Lave las matrices tres veces durante un minuto cada una en tres tubos cónicos. Aplique la solución de anticuerpos directamente a la matriz inmediatamente después de completar el lavado y superponga con el deslizamiento del elevador borrado. Al igual que antes, incube las matrices durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la cámara humidificada.
Realice el mismo paso de lavado que antes y centrifugue en un tubo cónico de 15 mililitros a 800 veces G en una centrífuga de mesa durante cinco minutos. A temperatura ambiente, seque al aire las matrices en un portaobjetos en la oscuridad durante 30 minutos antes de escanear la matriz a 647 nanómetros. En este experimento, se investigó la actividad de unión de TDA uno V cinco.
Los microarrays de proteínas de levadura detectados por duplicado con aproximadamente 4.200 proteínas de fusión GST de longitud completa se incubaron con el control de vector vacío o con TDA uno V cinco sondas. Los paneles insertados comparan la región idéntica en ambas matrices. De particular interés es RIM 11, que curiosamente también ha sido identificado como un objetivo fosforilado de TDA uno en un estudio publicado anteriormente.
Una vez que se han identificado los objetivos, se pueden probar la actividad bioquímica y funcional in vivo. Si está viendo este vídeo, debería tener una mejor comprensión de cómo utilizar los microarrays de proteínas funcionales como medio para identificar las interacciones de proteínas candidatas para su posterior validación e interrogación in vivo.
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Visión general
Este estudio presenta un método para identificar interacciones proteína-proteína dentro de un proteoma utilizando microarrays de proteínas. El enfoque permite la interrogación rápida y sin sesgos de miles de interacciones en paralelo, lo cual no es factible con las tecnologías tradicionales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Proteómica
Antecedentes
- Las interacciones proteína-proteína son cruciales para comprender los procesos celulares.
- Los métodos tradicionales para estudiar estas interacciones pueden ser limitados en alcance.
- Los microarrays de proteínas ofrecen una alternativa de alto rendimiento.
- Esta técnica utiliza una biblioteca de proteínas funcionales completa.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método para la identificación sin sesgos de interacciones proteicas.
- Utilizar microarrays de proteínas para ensayos de alto rendimiento.
- Facilitar el análisis bioinformático posterior de los datos de interacción.
Métodos utilizados
- Hibridación de proteínas con epítopo marcado con una biblioteca de proteínas en un portaobjetos de microscopio.
- Lavado de proteínas no unidas después de alcanzar el equilibrio.
- Detección de proteínas unidas usando anticuerpos monoclonales conjugados a marcadores fluorescentes.
- Análisis de señales fluorescentes para generar datos de interacción.
Principales resultados
- Identificación exitosa de interacciones proteína-proteína de manera de alto rendimiento.
- Generación de valores de intensidad correspondientes a cada interacción.
- Exportación de datos de interacción para un análisis bioinformático adicional.
- Demostración de la aplicabilidad del método a varios ensayos.
Conclusiones
- El método proporciona una plataforma robusta para estudiar interacciones proteicas.
- Mejora la capacidad para ensayos biológicos de alto rendimiento.
- Este enfoque puede adaptarse para varios tipos de interacciones moleculares.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction mapping is a critical early step in target validation and mechanistic de-risking for biopharma discovery programs. High-density functional protein microarrays enable unbiased, proteome-wide screening to identify direct binding partners, supporting hypothesis generation and pathway elucidation. This approach enhances predictive confidence in target selection by providing quantitative interaction data prior to costly downstream validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping direct protein-protein interactions across a functional proteome.
- Operational Value: Provides a parallel, unbiased platform to identify binding partners without prior bias toward known pathways.
- Predictive Value: Generates high-confidence interaction datasets that inform target prioritization and pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated protein libraries for reproducible screening campaigns using purified kinase probes.
- Operational Value: Standardizes hybridization and detection workflows to ensure assay consistency across replicates.
- Scalability: Supports screening of ~4,200 full-length proteins in duplicate, enabling robust statistical analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Identifies candidate interactions for downstream in vivo functional validation in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies signaling network connectivity by detecting both known and novel interaction partners.
- Pathway Alignment: Supports biomarker discovery by linking kinase activity to phosphorylated substrates in cellular contexts.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting target identification through proteome-wide interaction screening before lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by revealing direct binding partners of kinases or other proteins of interest.
- Screening: Enables assay-ready protein microarrays with blocked surfaces and standardized hybridization conditions.
- Analytics: Generates normalized intensity values from duplicate arrays to score interactions and account for technical variation.
- Translational Research: Connects microarray hits to in vivo validation through follow-up functional assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteome screening platform applicable to multiple kinases or protein families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct, quantitative measurement of protein-protein interactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized purification, hybridization, washing, and detection steps.
- Strategic Value: Reduces biological risk in target selection by providing early interaction landscape data.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by highlighting interaction networks relevant to disease mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast protein expression, affinity purification, and microarray handling.
- Dependent on access to high-density protein microarray slides and fluorescence scanning instrumentation.
- Necessitates standardization of blocking, hybridization, and antibody probing conditions across batches.
- Involves optimization of kinase probe concentration and incubation times for specific targets.
- Limited to soluble, functional proteins that maintain activity post-purification and array immobilization.
