La inmunodetección de la membrana externa proteínas por Citometría de Flujo de mitocondrias aisladas

El objetivo general de este procedimiento es inmunomarcar proteínas de interés en la membrana mitocondrial del RE con un anticuerpo de su elección y analizarlas simultáneamente con la función mitocondrial. Esto se logra recolectando primero el tejido de interés, como el cerebro, la médula espinal o el hígado, de una rata. El segundo paso es aislar las mitocondrias del tejido, en este caso la médula espinal.

La médula espinal se homogeneiza con una danza. El homogeneizador y otros orgánulos y los restos del día celular se eliminan a través de una serie de pasos de centrifugación hasta que se logra un paladar mitocondrial crudo, la mielina, un contaminante importante del tejido nervioso central, se elimina mezclando mitocondrias con una solución de preparación y centrifusión al 12% de Opti, una vez más. A continuación, las mitocondrias aisladas se marcan con un anticuerpo primario de elección, seguido de un anticuerpo secundario conjugado con un flúor.

El paso final es añadir tintes fluorescentes para confirmar la identidad mitocondrial o más bien los parámetros funcionales. En última instancia, la citometría de flujo se utiliza para mostrar la abundancia relativa de las membranas altas mitocondriales a lo largo de la fisiología normal o la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía, es que permite un alto rendimiento y una rápida cuantificación de miles de mitocondrias individuales.

Los animales utilizados en este estudio fueron tratados en estricta conformidad con un protocolo aprobado por el Comité Institucional C-R-C-H-U-M para la protección de los animales, que sigue los estándares nacionales descritos por el Consejo Canadiense de Cuidado Animal del Aire. Para comenzar este procedimiento, coloque una médula espinal intacta entera que se recolectó de una rata en un homogeneizador de vidrio de cinco mililitros que contiene cinco volúmenes de tampón de homogeneización. Coloque el homogeneizador de vidrio en hielo y homogeneice el tejido a mano hasta que no queden trozos más grandes de tejido, lo que tomará aproximadamente ocho golpes.

Transfiera el homogeneizado a dos o tres tubos de microcentrífuga y centrifuga a 1, 300 veces G durante 10 minutos de cuatro grados centígrados a continuación pipetea el sobrenadante S en un tubo de ultracentrífuga de cinco mililitros. Agregue 750 microlitros de tampón de homogeneización al pellet y vuelva a suspender suavemente el pellet. A continuación, centrifugar la suspensión y volver a suspender el pellet.

Dos veces más para eliminar los residuos pequeños, coloque todos los sobrenadantes en el mismo tubo de ultracentrífuga de cinco mililitros y luego coloque los tubos en un rotor de ultracentrífuga. Equipado con cubos oscilantes, centrifugar los tubos a 17.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Una vez finalizada la centrifugación, guarde el sobrenadante para su posterior procesamiento si la fracción citosólica es de interés.

A continuación, resus suspende el pellet, que es la fracción mitocondrial cruda en cuatro mililitros de tampón de homogeneización que contiene 50 milimolares de centrífuga de cloruro de potasio. El pellet resuspendido a 17.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados en un rotor de cubo oscilante, luego desecha el supinato y vuelve a suspender suavemente el pellet en 800 microlitros de tampón de homogeneización en un nuevo tubo de ultracentrífuga de cinco mililitros a exactamente 800 microlitros del pellet resuspendido. A continuación, pipetee 200 microlitros de iod dal a los 800 microlitros del pellet resuspendido para crear una concentración final del 12% iod Dal.

Mezcle el contenido del tubo suave pero completamente con una pipeta P 1000 y luego centrifugue a 17.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados en un rotor de cubo oscilante, aspire la capa de mielina en la parte superior del tubo y deseche el supinato con cuidado, ya que la paleta puede estar suelta. Resus suspende el pellet en cuatro mililitros de tampón de homogeneización. A continuación, centrifuga tu ganancia a 17.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados en un rotor de cubo oscilante.

Deseche el supinado y resus. Suspender el pellet en cuatro mililitros de tampón de homogeneización. A continuación, repita la centrifugación de nuevo y retire el agente supino reus.

Doble el pellet final en 100 a 200 microlitros de tampón de homogeneización y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Determine la cantidad de proteína en cada muestra utilizando un ensayo de cuantificación de proteínas estándar, como el ensayo de ácido biónico o BCA. Al preparar las muestras para la cuantificación, diluya las muestras y la curva estándar en sulfato de sodio al 2% para asegurar una solubilización adecuada de las mitocondrias.

Para cada mezcla de tinción que se vaya a probar, pipetee 25 microgramos de las mitocondrias aisladas en un tubo microcéntrico de 1,7 mililitros. Asegúrese de incluir una muestra sin teñir en cada experimento, así como un control de isotipo adecuado para cada anticuerpo probado: centrifugar cada muestra a 17.000 veces G durante dos minutos a cuatro grados centígrados en una microcentrífuga de sobremesa. A continuación, retire el supinato y vuelva a suspender las mitocondrias aisladas en 50 microlitros de tampón mitocondrial.

Suplementado con un 10% de BSA libre de ácidos grasos, incubar la solución durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y luego agregar 20 microgramos del anticuerpo primario por mililitro de solución. Incubar las mitocondrias aisladas con el anticuerpo primario durante 30 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar el anticuerpo no unido, centrifugar cada muestra y desechar el nadante supino. A continuación, vuelva a suspender suavemente el pellet en 200 microlitros de tampón mitocondrial y luego repita el paso de centrifugación, deseche el nadante supino y vuelva a suspender el pellet en 50 microlitros de tampón mitocondrial.

Añadir 0,5 microgramos del anticuerpo secundario por mililitro de muestra. A continuación, incubar las muestras durante 30 minutos a cuatro grados centígrados, protegidas de la luz. Una vez finalizada la incubación, centrifugar cada muestra y desechar el supinato que contiene el anticuerpo secundario no unido. Reese.

Suspenda el pellet en 200 microlitros de tampón mitocondrial y centrifugue la muestra. Otra vez. A continuación, retire el supinato y Reese. Suspenda el pellet en 500 microlitros de tampón de mitocondrias para asegurarse de que los eventos observados son de hecho mitocondrias.

Tiña la muestra con un tinte fluorescente específico de las mitocondrias, como el MIT tracker green de Vitrogen durante 15 minutos en la oscuridad. Si no es necesaria una tinción adicional para investigar otros parámetros funcionales, transfiera la muestra etiquetada a un tubo adecuado para cargarla en un citómetro de flujo. Mantenga las muestras en hielo y proceda a un citómetro de flujo para su adquisición para verificar que las mitocondrias aisladas tienen un potencial transmembrana intacto, tiña las mitocondrias con 100 nanomolares tetraethyl rod domine methyl éster durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad como control para la tinción con tetraethyl rod domine.

Éster metílico Tiñe las mitocondrias aisladas con éster metílico de varilla de tetraetilo domine de 100 nanomolares en presencia de cianuro de carbonilo de 100 micromolares m clorofenol HydroOne. Este producto químico es un desacoplamiento mitocondrial y despolarizará las mitocondrias para verificar que las mitocondrias aisladas produzcan superóxido, tiñan las mitocondrias con un indicador de superóxido apropiado, como mitosis, calcetines rojos de vitrógeno durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad como control de la producción de superóxido mitocondrial. Permanezca en las mitocondrias aisladas con colorante en presencia de 10 micromolares antimicina.

Una antimicina A es un inhibidor del complejo tres de la cadena respiratoria y aumentará la producción de superóxido mitocondrial antes de que comience la adquisición. Configure el instrumento como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, mezcle las muestras golpeando suavemente el tubo, pero sin hacer vórtices.

Comience a recopilar los eventos iniciales a baja presión durante la compuerta. Asegúrate de controlar la población total. A continuación, ajuste los voltajes de los histogramas en consecuencia.

El pico de la muestra no teñida suele corresponder a la segunda década. Luego, una vez que se hayan establecido las compuertas y se estén procesando las muestras, cambie la presión a citometría de alto flujo. El análisis de las preparaciones de la médula espinal identificó que el 94% de los eventos fueron positivos para el colorante específico de las mitocondrias.

En este experimento, el 30% de los eventos positivos de las mitocondrias se marcaron con un anticuerpo específico para la fusión MIT dos, que es una proteína implicada en la fusión de la membrana externa de las mitocondrias. El análisis del potencial transmembrana mitocondrial utilizando éster metílico de tetraetilo rumina encontró que el 95% de las mitocondrias aisladas tienen un potencial transmembrana intacto. Se demostró que esta tinción es específica, ya que se observó una disminución significativa en la tinción cuando se realizó en presencia de una mitocondria mitocondrial no funcional: se encontró que las mitocondrias producen una cantidad basal de óxido de SUP medida utilizando un tinte permeable a la membrana.

Eso se convierte en una reacción fluorescente de P con óxido de SUP. El tratamiento de las mitocondrias con antimicina a da como resultado un aumento aproximado del 10% en la producción de superóxido una vez dominado. Esta técnica se puede realizar en seis o siete horas si se realiza correctamente.