Name: Generación de transgénicos Hydra Por microinyección de embriones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende a generar líneas transgénicas de Hydra mediante microinyección de ADN plasmídico en embriones tempranos. Este método establece líneas estables para estudiar función génica y dinámica celular.

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Este trabajo fue apoyado por una Harold y Leila Y. Mathers G. Premio a HL y una subvención del NIH (R24 GM080527) a RESCEJ era un Postdoctoral Fellow NRSA (NIH F32GM9037222) y actualmente es apoyado por un Premio al Desarrollo Científico Mentored Investigación de la Nacional Instituto del Envejecimiento (K01AG04435). Nos gustaría agradecer a los revisores por sus valiosos comentarios.

1 Preparación de ADN plásmido, agujas, y platos de inyección <ol><li> Preparar el ADN de plásmido usando un kit Maxi de alta velocidad o Midi y se concentra el ADN a 2,5 mg / ml utilizando la precipitación con etanol. El sedimento de ADN se debe disolver en agua desionizada libre de nucleasa. Almacene el ADN en 10-20 alícuotas a -20 ° C. (Véase el cuadro 1 complementario para obtener una lista de vectores disponibles) </li><li> Hacer un plato de inyección utilizando agarosa para construir un canal para la celebración de los embriones en una placa de 100 x 15 mm de Petri. <ol><li> Colocar un portaobjetos de microscopio de vidrio 75 x 50 en una placa de 100 x 15 mm Petri en un ángulo. Vierta aproximadamente 50 ml de 2% de agarosa fundido en un medio de Hydra 24 en la placa de Petri. Alternativamente, se vierte la agarosa en el plato primero y flotar un &quot;Mold Microinyección Fish&quot; en la parte superior. </li><li> Después de la agarosa se ha solidificado, retirar el portaobjetos de vidrio o el molde. Si se ha utilizado un portaobjetos de vidrio, cortar el exceso de agarosa con un bla de afeitarde para formar una pared. Verter medio Hydra en el plato y utilizar inmediatamente o almacenarlo a 4 ° C hasta que se necesite. Nota: los platos de inyección pueden ser reutilizados si se almacenan a 4 ° C entre usos. </li></ol></li><li> Tire las agujas de capilares de vidrio borosilicato con un filamento en el extractor de micropipeta usando las siguientes condiciones: calor 525, tire 75, velocidad 100, tiempo 50. Tienda las agujas de comprimirlos en una estrecha franja de tierra batida en un plato de Petri de manera que sean mantenida en paralelo a la parte inferior del plato. </li><li> Para preparar la solución de inyección, combinar 3 l de solución de ADN de plásmido de 2,5 mg / ml con 2 l de 10% de fenol rojo. Vortex la solución brevemente y luego girar por 10 min a velocidad máxima en una microcentrífuga para eliminar las partículas que pueden obstruir la aguja. </li><li> Bajo un microscopio de disección, corte la aguja unos pocos milímetros de la punta con fórceps para crear una pequeña abertura. Nota: Hay una cierta flexibilidad en el tamaño adecuado de la aperturaing porque la presión se puede ajustar en el paso 3.3 para acomodar esta variación. </li><li> Coloque la placa de Petri de modo que se mantiene la aguja en una posición vertical con la punta hacia abajo. Cargar la aguja con aproximadamente 0,5 l de solución de inyección con la pipeta el líquido en el extremo posterior de la aguja. Permitir que la acción capilar para tirar de la solución en la punta de la aguja. </li></ol> 2 Preparación de embriones para inyección <ol><li> Sobre una base diaria escanear el cultivo de la cepa Hydra AEP para los pólipos producen huevos. Reunir estos pólipos y déjelos a un lado en una placa de cultivo separado. Observar estos pólipos cada pocas horas durante el día para controlar el progreso de la formación del huevo. Cuando los huevos se rompen a través del ectodermo y se sientan en un anillo de células ectodérmicas retraídos que están listos para inyección 25. Coloque estos pólipos en un plato con varios Hydra que tienen testículos durante al menos 1 hora antes de la inyección para permitir la fertilización. Hydra &lt;/ Em&gt; machos lanzará esperma sin ninguna manipulación especial. </li><li> Si las hembras se encuentran en la colonia AEP con los huevos completamente formados, que son aproximadamente 400 micras de diámetro 25, o de 1 a embriones en estadio de 8 células, también recoger estos para inyección. Inmediatamente inyectar embriones que han comenzado escisión. Nota: No es posible establecer la diferencia entre los huevos completamente formadas y cigotos unicelulares, por lo tanto estas deben ser incubadas con los machos antes de la inyección. </li><li> Antes de la inyección, eliminar la mayor parte del tejido parental encima y por debajo del embrión usando un escalpelo con una cuchilla # 15. Dejar sólo el embrión con un pequeño trozo de la columna cuerpo adjunto, que se utiliza para manipular el embrión con pinzas si es necesario. Nota: El tejido que se diseca lejos del embrión regenerará y debe ser guardado para asegurar que las mujeres permanecen en la colonia Hydra. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur, mover el plato de embriones para inyección, disponiéndolos en paralelo a la pared de laa través de agarosa. </li></ol> 3. microinyección de ADN plásmido <ol><li> Monte el microinyector en un soporte magnético que se sienta en una placa de hierro. Montar el soporte de inyección, que es la parte de la microinyector que mantiene la aguja, en un micromanipulador joystick. Monte el manipulador joystick a la plancha de hierro, con un soporte magnético. Coloque esta todo el conjunto-en el lado derecho de un microscopio de disección y colocar el soporte de inyección de modo que sea visible en el campo de observación. </li><li> Coloque el plato de la inyección con embriones bajo el microscopio de disección, orientada de tal manera que la pared vertical de la cubeta de agarosa está a la izquierda. Insertar la aguja en el soporte de inyección y bajar la punta de la aguja en el medio Hydra en el plato. </li><li> Girar lentamente el pomo de la jeringa en la dirección de las agujas del reloj hasta que el aceite mineral se llena la parte superior de la aguja y un flujo constante de solución de inyección se observa que sale de la aguja en el hidrun medio. Si la corriente es demasiado fuerte, reduzca la presión girando la perilla a la izquierda. Practicar este paso para obtener de forma rutinaria una presión adecuada, que depende del tamaño de la abertura de la aguja (es decir, cómo se recorta la aguja en el paso 1.5). Nota: Si la corriente es demasiado fuerte, el embrión no sobrevivió a la inyección. </li><li> Mientras observa a través del microscopio de disección, mover el plato de inyección de manera que el primer embrión está en el centro del campo. Mover la aguja de modo que está en contacto con ese embrión. Utilice el micromanipulador para perforar el embrión con la aguja. Nota: La pared vertical de la cubeta de agarosa mantendrá el embrión sea empujado a un lado por la aguja. </li><li> Deje que la solución inyectable fluya hacia el embrión 1 o 2 segundos y luego retire la aguja rápidamente. Si el embrión tiene más de una celda, inyectar cada célula individual. El uso de fórceps para reorientar el embrión para alinear la siguiente celda con la punta de la aguja. </li><li> Después de la primera embryse inyecta o, mover el plato para que la próxima embrión se encuentra en la posición de inyección y repita el procedimiento; continuará hasta que se hayan inyectado todos los embriones. </li></ol> 4. El cultivo y la eclosión de embriones <ol><li> Mover todos los embriones inyectados en un plato con algunos Hydra que tienen testículos (esto es para asegurar que todos los embriones son fertilizados). Incubar los embriones en una incubadora a 18 °, mientras continúan la embriogénesis. </li><li> Una vez que se alcanza la etapa de cutícula, mover cada embrión inyectado a un pozo individual de una placa de 24 pocillos con medio lleno Hydra. </li><li> Incubar los embriones inyectados durante 2 semanas en la oscuridad a 18 ° C. </li><li> Después del periodo de incubación de 2 semana, comprobar cada embrión inyectado bajo la lupa. Tenga en cuenta los casos en los que el embrión cutícula etapa ha desprendido de la pequeña muestra de tejido de los padres y el tejido de los padres ha regeneradas. Eliminar este pólipo regenerado inmediatamente de modo que no es mistaken de una nueva cría. </li><li> Mueva el plato de embriones inyectados bajo una luz del acuario a RT. Compruebe los platos cada día y recoger las crías. Nuevas crías serán blancas porque el típico color rosa de pólipos Hydra viene de la Artemia que comen. </li><li> Observar las crías bajo un microscopio de fluorescencia para detectar la expresión del transgén. </li></ol>

<ol><li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li>
<li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li>
<li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li>
<li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li>
<li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li>
<li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li>
<li>David, C. N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li>
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<li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology+%28Jena%29%22%5BJournal%5D)">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li>
<li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li>
<li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li>
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<li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li>
<li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li>
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<li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8(2009).</li>
<li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li>
<li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li>
<li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+an+early+branching+metazoan%2C+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li>
<li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686(2010).</li>
<li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li>
<li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li>
<li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643(2012).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).</li>
<li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Hydra reproduce asexualmente rutinariamente, pero requiere de estímulos ambientales para comenzar gametos productores. Estos estímulos no están bien definidas-para la mayoría de las especies Hydra y pueden diferir de cepa a cepa. Un obstáculo significativo a la producción de transgénicos Hydra es la obtención de embriones sobre una base regular, ya que puede resultar difícil en un entorno de laboratorio para inducir Hydra para convertirse sexual. La cepa AEP 25, sin embargo...

Hydra se ha utilizado para estudiar la regeneración, la formación de patrones, y las células madre para unos 250 años 2 Hydra tiene un plan de cuerpo simple que consiste en tres linajes celulares:. Epitelio ectodérmico, endodérmico epitelial y intersticial. El cuerpo tubular está formado por la ectodérmico y endodérmico linajes epiteliales, cada uno de los cuales es una sola capa de células. Todas las células epiteliales en la columna de la carrocería son mitótico. Cuando las células epiteliales se desplazan en las extremidades 3, la cabeza (boca y tentáculos) en el extremo oral o el pie (disco basal) en el extremo aboral, que detención en la fase G2 del ciclo celular y cambiar el destino celular 4. Las células del linaje intersticial residen dentro de los intersticios entre las células epiteliales. Este linaje es apoyado por las células madre multipotentes que se encuentran en la capa epitelial ectodérmica de la columna de cuerpo 5. Las células madre intersticiales dan lugar a tres cel somáticatipos l (nervios, células de la glándula, y nematocytes) y las células germinales 6,7. Como miembro del filo Cnidaria, el grupo hermano de todos los bilaterales, Hydra puede arrojar luz sobre los procesos biológicos fundamentales compartidos entre los animales multicelulares. Hasta hace poco, estos esfuerzos fueron obstaculizados por la falta de métodos fiables para la perturbación de la función génica. Sin embargo, con el desarrollo de la metodología transgénico 1, ahora somos capaces de sacar el máximo provecho de Hydra para obtener una mejor comprensión de los mecanismos básicos comunes a los animales multicelulares, como la función de células madre, la regeneración y el patrón. Líneas transgénicas Hydra son establecidos por inyección de plásmido de ADN en embriones, lo que resulta en la integración aleatoria y de expresión quimérico en una frecuencia sustancial de las crías. Una línea con expresión uniforme en un linaje particular puede ser establecida por la propagación asexual. La capacidad de propagar clonalmente transgENIC Hydra líneas es una ventaja sobre la mayoría de los modelos animales, que puede ser propagada sólo por reproducción sexual. Además, las células transgénicas se pueden rastrear fácilmente in vivo debido a la transparencia del animal y la ausencia de proteínas fluorescentes endógenos 8. En los siete años transcurridos desde las primeras líneas transgénicas Hydra fueron hechas 1, dichas líneas se han utilizado para una variedad de aplicaciones. La expresión de proteínas fluorescentes en diferentes tipos de células ha permitido rastrear el movimiento celular, observar los cambios en la forma de la célula, y la pista destino celular, tanto en condiciones de tipo salvaje y después de la perturbación química 1,5,9-12. Además, la expresión de diferentes proteínas fluorescentes en los diversos linajes permite el aislamiento de FACS de poblaciones celulares específicas. Esta técnica ha sido utilizada para la secuenciación de ARNm específicos de células madre y linaje específico de pequeños RNAs 13,14. Mientras que el promotor deuno de los dos genes de actina Hydra se ha utilizado más ampliamente, unos pocos de tipo celular promotores específicos han sido identificados y se utiliza para controlar la expresión de GFP en transgénicos Hydra 9,11,15,16. En el futuro, promotores específicos de tipo celular permitirá para la observación y la recogida de cualquier tipo de célula específico. Además, un enfoque transgénico se utilizó con éxito para definir los elementos reguladores que actúan en cis del promotor Wnt3 17. El desarrollo de métodos transgénicos en Hydra proporciona un enfoque robusto para probar la función de los genes por la expresión ectópica, la sobreexpresión, y caída. Los animales transgénicos se han hecho que expresan proteínas fluorescentemente marcadas con el fin de examinar la función y localización celular 18-20. Además, la expresión de ARN horquillas en el 3&#39;UTR de un transgén GFP lleva a desmontables de genes diana 21,22. En estos enfoques se requiere para identificar las buenas prácticas agrariasy rastrear el tejido transgénico durante la creación de la línea transgénica. Sin embargo, es probable que en algunos casos la molécula de GFP podría interferir con la función de la proteína etiquetada. Un estudio reciente demuestra que los genes Hydra pueden ser dispuestos en una configuración operón, es decir, se hacen polycistronic transcripciones, que luego son separados por trans-empalmados Además líder y traducido por separado 23. Mediante la colocación de un gen que codifica una proteína o un ARN de horquilla en la posición aguas arriba de un operón y un gen de proteína fluorescente en la posición aguas abajo, se puede realizar un seguimiento de tejido transgénico sin tener que etiquetar el gen que codifica la proteína o ARN de horquilla. Este método se ha utilizado para expresar una horquilla de ARN en una configuración operón con DsRed2 a fin de lograr gen desmontables 14.

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra Strain</td><td></td><td></td><td>Correo electrónico: Celina Juliano en celina.juliano@yale.edu o Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>Maxi Kit de Alta Velocidad</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Placas de Petri</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 mm Portaobjetos de Microscopio de Vidrio Sigma</td><td></td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Microinyección Molde</td><td>de Pescado IBI Scientific</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato con filamento</td><td>Instrumento Sutter BF100-50-10</td><td></td><td>Diámetro exterior: 1,0 mm, diámetro interior: 0,50 mm, 10 cm de longitud</td></tr><tr><td>Tirador de micropipetas Flamígero/Marrón</td><td>Instrumento Sutter P-97</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rojo Fenol</td><td>Pinzas de joyero Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr>, <tr><td>Durmont #5</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí #15</td><td>Fisher</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Soporte Magnético</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de hierro</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de transgénicos hydra por microinyección de embriones

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Como miembro del filo Cnidaria, el grupo hermano de todos los bilaterianos, Hydra puede arrojar luz sobre los procesos biológicos fundamentales compartidos entre los animales multicelulares. Hydra se utiliza como modelo para el estudio de la regeneración, la formación de patrones y las células madre. Sin embargo, los esfuerzos de investigación se han visto obstaculizados por la falta de un método fiable para las perturbaciones genéticas con el fin de estudiar la función molecular. El desarrollo de métodos transgénicos ha revitalizado el estudio de la biología de la hidra 1. La hidra transgénica permite el seguimiento de células vivas, la clasificación para producir poblaciones de células puras para el análisis bioquímico, la manipulación de la función génica mediante la eliminación y la sobreexpresión, y el análisis de la función del promotor. El ADN plasmídico inyectado en embriones en etapa temprana se integra aleatoriamente en el genoma en una etapa temprana del desarrollo. Esto da lugar a crías que expresan transgenes en parches de tejido en uno o más de los tres linajes (epitelial ectodérmico, epitelial endodérmico o intersticial). La tasa de éxito de obtener una cría con tejido transgénico es de entre el 10% y el 20%. La propagación asexual de la cría transgénica se utiliza para establecer una línea transgénica uniforme en un linaje particular. Generar Hydra transgénico es sorprendentemente simple y robusto, y aquí describimos un protocolo que se puede implementar fácilmente a bajo costo.

El establecimiento de líneas transgénicas de Hydra Alimente las crías transgénicas cada 2-3 días con nauplios de Artemia. Las crías a veces no comen por un día o dos después de la eclosión. Algunas de las nuevas crías nunca van a comer, y por lo tanto no va a sobrevivir. Si la cría es transgénica ya sea en el ectodérmica (Figura 1A) o tejido epitelial endodérmico, permitir que el animal brote y recoger los brotes que tienen el tejido más transgénicos (...

Stably transgénica Hydra se fabrica mediante microinyección de ADN plasmídico en embriones, seguida de integración genómica aleatoria y propagación asexual para establecer una línea uniforme. Las hidras transgénicas se utilizan para rastrear los movimientos de las células, sobreexpresar genes, estudiar la función de los promotores o reducir la expresión génica mediante ARNi.

Generación de transgénicos Hydra Por microinyección de embriones

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

El objetivo general de este procedimiento es microinyectar ADN plasmático en embriones de hidra para producir líneas transgénicas. Esto se logra preparando primero una solución de ADN plasmático y cargándola en una aguja de inyección. A continuación, la solución de ADN plasmático se inyecta en embriones de hidra entre las etapas de una y ocho células.Luego se permite que los embriones de hidra se desarrollen y eclosionen y se seleccionan los juveniles con tejido transgénico. El paso final es producir una línea transgénica uniforme por gemación asexual del animal transgénico original. En última instancia, la microscopía de fluorescencia se utiliza para visualizar la expresión transgénica en hidra.Este método fue diseñado para investigadores que desean hacer hidrolíneas transgénicas a bajo costo, permitiendo así una aplicación más amplia de esta tecnología útil, tanto para los investigadores hidrológicos actuales, como para aquellos que recién quieren comenzar a utilizar este modelo. La hidra transgénica se utiliza para estudiar la dinámica de los tejidos, la localización de proteínas, la función génica por knockdown y sobreexpresión, y también la función promotora. Después de preparar el ADN plasmático de acuerdo con el protocolo de texto, prepare un plato de inyección colocando primero un microscopio de vidrio de 75 por 50.Deslice en una placa de Petri de 100 por 15 milímetros en ángulo, disuelva 2%agros en 50 mililitros de medio hydra. Deja que se enfríe. Luego viértalo en la placa de Petri Después de que el agro se haya solidificado, retire la corredera de vidrio y, con la cuchilla de afeitar, corte el exceso de agros para formar una pared.Luego, vierta inmediatamente el medio hydra en el plato y úselo inmediatamente o guárdelo a cuatro grados centígrados hasta que lo necesite. Para preparar la solución de inyección, combine tres microlitros de 2,5 miligramos por mililitro de solución de ADN plasmático con dos microlitros de solución de rojo de fenol al 10%. Agite la solución brevemente y luego gírela durante 10 minutos a máxima velocidad en una microcentrífuga para eliminar cualquier partícula que pueda obstruir la aguja bajo un microscopio de disección.Use pinzas para sujetar la aguja a unos milímetros de la punta para crear una pequeña abertura. Oriente la placa de Petri que contiene la aguja de modo que la aguja quede en posición vertical con la punta hacia abajo. A continuación, pipetee aproximadamente 0,5 microlitros de solución inyectable en el extremo posterior de la aguja.Para preparar los embriones para la inyección, comience escaneando una hidra, un cultivo de cepa EP en busca de pólipos que produzcan óvulos. Recoja estos pólipos y transfiéralos a una placa de cultivo separada. Observe estos pólipos cada pocas horas durante el día para controlar el progreso de la formación de huevos.Cuando los huevos atraviesan el ectodermo y se asientan en un anillo de células dérmicas retraídas, están listos para la inyección. Coloque los pólipos que tienen huevos listos para la inyección en un plato con varias hidras que tienen testículos durante al menos una hora antes de la inyección para permitir la fertilización si las hembras se encuentran en una colonia EP con huevos completamente formados o embriones en etapa de una a ocho células. También recójalos para inyectarlos antes de la inyección. Use un bisturí con una hoja número 15 para eliminar la mayor parte del tejido parental por encima y por debajo de los embriones que han comenzado a dividirse, dejándolos con solo una pequeña pieza de la columna corporal del padre adherida.Guarde el tejido diseccionado en el medio Hydra, ya que se regenerará y asegurará que las hembras permanezcan en la colonia de hidra. Utilice una pipeta de pasto para transferir los embriones escindidos a una placa de inyección, colocándolos paralelos a la pared del comedero agrícola. Para preparar el micro inyector montado en un soporte magnético que se asienta sobre una placa de hierro.Monte el soporte de inyección, que es parte del microinyector que sostiene la aguja en un manipulador de joystick microm. Con un soporte magnético, monte el manipulador de joystick en la placa de hierro. A continuación, coloque toda la configuración en el lado derecho de un microscopio de disección y coloque el soporte de inyección de forma que sea visible en el campo de observación.Coloque la placa de inyección con embriones bajo el microscopio de disección orientado de tal manera que la pared vertical del canal de agros quede hacia la izquierda. Inserte la aguja en el soporte de inyección y baje la punta de la aguja en el medio hydra en el plato. A continuación, gire lentamente la perilla de la jeringa en el sentido de las agujas del reloj hasta que el aceite mineral llene la parte superior de la aguja y se observe un flujo constante de solución inyectable que sale de la aguja hacia el medio hidra.Si el chorro es demasiado fuerte, baje la presión girando la perilla en sentido contrario a las agujas del reloj. Centre un embrión en el campo de visión y mueva la aguja para que toque el embrión. A continuación, utilice el manipulador de microm para perforar el embrión con la aguja y permitir que la solución inyectable fluya hacia el embrión durante uno o dos segundos antes de retirar rápidamente la aguja.Si el embrión tiene más de una célula, inyecte cada célula individualmente. Continúe hasta que se hayan inyectado todos los embriones. Una vez inyectados todos los embriones, se transfieren a una placa con unos pocos Hydra, un pólipo EP que tienen testículos y se incuban a 18 grados centígrados mientras continúan en fase embriogénica.Cuando los embriones alcancen la etapa de cutícula, mueva cada embrión a un pocillo de una placa de 24 pocillos llena de medio hidra e incube durante dos semanas en la oscuridad a 18 grados centígrados. Luego, bajo un microscopio de disección, observe cada embrión para ver si se desprende del pequeño trozo de tejido parental y la regeneración de ese tejido. Si está presente, retírelo inmediatamente para que no se confunda con una nueva cría.Después de revisar cada embrión, mueva el plato bajo la luz de un acuario a temperatura ambiente. Revise los platos todos los días y recoja las crías. Las nuevas crías serán de color blanco porque aún no han comido.Obsérvelos bajo un microscopio fluorescente para determinar la expresión de transgenes. Utiliza art napoli para alimentar a las crías transgénicas cada dos o tres días. Cuando las crías que son transgénicas en el tejido epitelial electrodérmico o endodérmico producen brotes, se evalúa su expresión de transgén.Aquí se muestra una cría con expresión quimérica de un rojo Ds, dos transgenes bajo el control de un promotor de actina y un parche de células epiteliales ectodérmicas. La gemación continua del animal puede producir una línea con expresión uniforme del transgén en el linaje epitelial electrodérmico o endodérmico. Como se ve aquí, la cría original ahora está produciendo dos nuevos brotes.La yema etiquetada con un asterisco, no tiene tejido transgénico y se utilizó como animal fundador de una línea de control que es genéticamente idéntica a la línea transgénica, excepto por la presencia del transgén. Este animal es la primera yema con tejido transgénico producida a partir de la cría original. A través de estos experimentos utilizando transgenes que no tienen impacto en la función biológica, se establecieron líneas celulares epiteliales uniformes a partir de aproximadamente el 30% de las hidras que eclosionan con tejido epitelial transgénico.Una línea electrodérmica uniforme, como se ve aquí, se establece con un 33 a 50% menos de frecuencia que una línea endodérmica. Por lo tanto, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer líneas hidráulicas transgénicas, lo que se sumará al repertorio de estudios funcionales que puede hacer con este modelo.

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Investigación

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Biología

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En Expression in ovo de microARN en ventral del polluelo Midbrain

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el seguimiento en directo de la retina progenitores WT individuales en los antecedentes genéticos distintos permite la evaluación de la contribución de la señalización no autónomo celular durante la neurogénesis. Aquí, una combinación de gen desmontables, la generación de quimera a través de la transferencia de embriones y la imagen de lapso de tiempo confocal in vivo se utilizó para este propósito.

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

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Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

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