De Alto Rendimiento La titulación de luciferasa que expresan virus recombinantes

El objetivo general del siguiente experimento es estimar los títulos virales de un virus marcado con luciferasa utilizando un método de cuantificación de alto rendimiento. Esto se logra transfiriendo el sobrenadante de las muestras que se van a valorar, así como una curva estándar viral a una línea celular permisiva para permitir la expresión de luciferasa. Como segundo paso, se puede añadir RESA zurin a las muestras originales, que se utilizarán para evaluar la viabilidad de las células.

A continuación, tras un tiempo de incubación adecuado, se añade luciferino a las células para cuantificar por luminiscencia. Los resultados muestran la cantidad de virus en la muestra en función de la expresión de luciferasa. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el tittering de placa, es que se puede procesar un gran número de muestras de forma rápida y simultánea.

Este método también puede extenderse a los virus que expresan luciferasa sin chasquido. Dado que no depende de la formación de placa, una lectura de la citotoxicidad celular se puede incorporar fácilmente al flujo de trabajo y puede ser útil en el contexto de un cribado de fármacos. La demostración del procedimiento estará a cargo de Vanessa Ramia y Colin, tres estudiantes graduados de mi laboratorio, que primero realizarán infecciones con VSP Delta 51 expresando luciferasa de luciérnaga en 96.

Bueno, los sobrenadantes de las placas de cultivo de tejidos de estas placas se valorarán después de un tiempo de incubación adecuado 24 horas antes de la titulación. Prepare una suspensión de células Vero a una concentración de 2,5 veces 10 a la quinta célula por mililitro en DMEM que contenga 10% de FBS 30 pilas milimolares y 1% de penicilina estreptomicina C, 2,5 veces 10 a la cuarta célula en 96. Placas de fondo plano sólido y bien blancas utilizando un dispensador de microplacas para preparar la suspensión de celdas, limpie un casete dispensador de microplacas enjuagando el tubo con 50 mililitros de agua estéril.

A continuación, llene las líneas del dispensador de microplacas con suspensión celular, permitiendo que fluyan cinco mililitros de la suspensión celular. Seleccione un programa que dispense 100 microlitros en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de paredes blancas, dispense y repita según sea necesario para placas adicionales. También siembre algunos pocillos en una placa inferior blanca clara de 96 pocillos para verificar la salud y la densidad de las células.

Cuando termine, vuelva a enjuagar las celdas en el recipiente original. Limpie el casete haciendo correr 50 mililitros de etanol al 70%, seguidos de 50 mililitros de agua tibia estéril a través del tubo. Después de esto, incube las células durante 24 horas a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5%.

Prepare una curva estándar de VSV Delta 51 en DMEM libre de suero de modo que la concentración final de unidades de plataforma por mililitro después de la transferencia a las células Vero sea la siguiente. Prepare 50 microlitros de cada concentración por placa de células Vero, más un 10% adicionalLa curva estándar se puede transferir a una placa de 96 pocillos de profundidad. A continuación, verifique las células Vero plateadas en la placa inferior transparente de 96 pocillos bajo un microscopio óptico para confirmar que las monocapas tienen al menos un 95% de transferencia trans confluente.

25 microlitros de sobrenadante de muestra en las células Vero asentadas en las placas de paredes blancas utilizando una pipeta multicanal de 12 canales a 25 microlitros de cada dilución de la curva estándar a las células Vero en las dos columnas designadas. Centrifugar las placas durante cinco minutos a 430 Gs a temperatura ambiente. A continuación, incubar las placas durante cinco horas a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5%.

En este punto, agregue zurin en una cantidad igual al 10% del volumen en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de muestras que contienen virus y células. Después de dos a cuatro horas, lea y registre la señal con un lector de placas de fluorescencia usando 530 a 560 para la excitación y 590 para el informe de emisión. Viabilidad celular de la muestra según la siguiente fórmula.

30 minutos antes del final de la incubación de cinco horas, prepare el Lucifer para obtener una solución de dos miligramos por mililitro en solución salina estéril tamponada con fosfato. Proteja la solución de la luz después del período de incubación de cinco horas a 25 microlitros de Lucifer en cada pocillo de células Vero en las placas sólidas blancas con un dispensador automático integrado en el luminómetro. Lea las placas con los siguientes parámetros.

Agite durante cinco segundos y espere 30 segundos. Lea la luminiscencia a un valor de exposición de corte de sensibilidad fija adecuado, luego registre y guarde la intensidad bioluminiscente cuantificada. Si se utilizó un dispensador automático para agregar luciferino, posar el luciferino y cebar las líneas con agua estéril o obtener resultados precisos, resuelva la regresión no lineal para generar una ecuación de colina a partir de las curvas estándar.

Aplique esta ecuación a las muestras tituladas para calcular las unidades de expresión viral. Aquí se muestran los resultados de una curva estándar típica de VSV Delta 51, o el análisis de regresión no lineal de parámetros generó un gráfico de granizo a partir del cual se pueden interpolar unidades formadoras de entrada desconocidas. Los títulos virales obtenidos por ensayo de placa estándar en células Vero se compararon con los títulos virales calculados de las mismas muestras.

Utilizando el ensayo de luciferasa de alto rendimiento, las muestras se originaron en un experimento en el que se utilizaron varios productos químicos para mejorar la replicación y propagación de las células VSV Delta 51 y 7 8 6 0. Aquí se muestra la correlación lineal entre los títulos y las unidades de expresión viral con una R cuadrada de 0,8083 y una puntuación R de Pearson de 0,899. Aquí se muestran los datos típicos de citotoxicidad celular obtenidos de un ensayo metabólico para 7, 8 6 0 células tratadas con productos químicos antes de la infección.

Con VSV Delta 51, se muestran las curvas estándar típicas obtenidas con el virus del herpes simple, el virus vaccinia y el virus adenoasociado, todos ellos expresando luciferasa de luciérnaga. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para realizar cribados de alto rendimiento de bibliotecas de compuestos en combinación con el virus de interés para generar títulos y datos de citotoxicidad. Al intentar este procedimiento, es importante recordar diluir correctamente la curva estándar, ya que esto es fundamental para interpolar las unidades de expresión viral.

No olvide que trabajar con virus vivos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como trabajar en un gabinete de seguridad biológica y usar el equipo de protección personal adecuado mientras se realiza este procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estimar los títulos virales utilizando un método de cuantificación de alto rendimiento basado en la expresión de una medición de transgén de luciferasa de bioluminiscencia en interpolación de unidades de expresión viral desconocidas. A partir de una muestra de curva estándar, la citotoxicidad puede determinarse simultáneamente mediante un ensayo de viabilidad adecuado.