Expresión de proteínas recombinantes para la Biología Estructural en HEK 293F Suspensión Células: Un enfoque novedoso y accesible

El objetivo general del siguiente vídeo es demostrar una técnica sencilla y asequible para producir un buen rendimiento de proteínas o complejos proteicos utilizando un sistema de expresión de mamíferos. Esto se logra mediante el cultivo de células HEC 2 93 F en suspensión en una incubadora de agitación humidificada con una atmósfera mantenida al 5% de dióxido de carbono. Como segundo paso, las células se transfectan transitoriamente con uno o más plásmidos de alta expresión de número de copias.

Utilizando el agente de transfección polietileno EIN o PEI, las células se dejaron crecer durante 48 horas antes de la cosecha. A continuación, se realiza la purificación de proteínas utilizando resina de afinidad, seguida de filtración en gel para purificar el complejo proteico de interés con el fin de realizar estudios estructurales y funcionales. En última instancia, este sistema de expresión asequible y simple de mamíferos permite la expresión y purificación de proteínas y complejos de proteínas que son difíciles de expresar en las células bacterianas.

La principal ventaja de este enfoque es su conveniencia y versatilidad para la expresión de complejos proteicos. Es casi tan fácil como producir proteínas en bacterias, especialmente porque puede mezclar y combinar vectores de expresión de proteínas. El método se puede utilizar inicialmente a pequeña escala para probar la expresión de compresas de proteínas, pero es fácilmente escalable para producir un buen rendimiento de compresas de proteínas Para estudios estructurales y funcionales, la clave del éxito es mantener las células en un estado saludable, libres de bacterias o infecciones por levaduras.

Ya que los antibióticos en los medios de comunicación reducen en gran medida la producción de proteínas. Para comenzar, retire un vial criogénico que contenga un mililitro de células HEC 2 9 3 F a una densidad de 20 millones de células por mililitro del nitrógeno líquido y descongele rápidamente en un baño de agua a 37 grados Celsius. Rompa los grumos pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces y pipetee todo el contenido en un matraz cónico de cultivo de células de 250 mililitros que contiene 34 mililitros de medios precalentados.

Coloque el cultivo en una incubadora de agitación orbital humidificada a 37 grados Celsius, 120 RPM y 5% de dióxido de carbono después de 48 horas. Comprobar la viabilidad de la célula mediante azul triano. La tinción de la viabilidad celular normal en esta etapa es de aproximadamente el 70% cuando las células habrán alcanzado un recuento de aproximadamente 1 millón de células por mililitro.

Masajéelas hasta un recuento final de 0,35 millones de células por mililitro en un matraz cónico de cultivo de células de 250 mililitros que contenga 60 mililitros de medios precalentados, continúe masajeando las células cada 48 horas o cuando alcancen aproximadamente 2 millones de células por mililitro. Aquí se muestra una muestra de células HEC 2 9 3 F con tinción de azul de Trian a 2,3 millones de células por mililitro de un stock listo para ser sembrado para la transfección. Las células solo deben estar presentes como células individuales o en división. Si las células crecen demasiado, formarán grandes grupos y tendrán una viabilidad muy baja, como se muestra en esta imagen.

Si las células están formando grupos, estos pueden romperse mediante un vórtice vigoroso durante 25 segundos. Para comenzar, los cultivos a gran escala siembran las células a medio millón de células por mililitro en un volumen final de 300 mililitros en cada botella de rodillo de un litro. Incubar durante 24 horas en un agitador orbital humidificado a 37 grados centígrados, 135 RPM y 5% de dióxido de carbono hasta que las células alcancen una densidad de 1 millón de células por mililitro.

A continuación, pipetee un total de 300 microgramos de ADN esterilizado por filtrar 30 mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS y vórtice vigorosamente durante tres segundos. Luego agregue 1,2 mililitros de 0,5 miligramos por mililitro. Filtre el PEI esterilizado a la solución de PB SDNA y al vórtice vigorosamente durante tres segundos adicionales.

Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de añadir la mezcla a las celdas siguientes a la cuna. La transfección incuba las células en una incubadora de agitación orbital humidificada durante 48 horas más a 37 grados centígrados, 135 RPM y 5% de dióxido de carbono después de 48 horas. Recoja proteínas intracelulares centrifugando células a 3000 veces G durante cinco minutos.

Si el pellet de celda no es para uso inmediato, se puede almacenar a menos 80 grados centígrados. Este protocolo está optimizado para la purificación de complejos proteicos del núcleo en los que una de las proteínas tiene una etiqueta bandera. Para comenzar la purificación resus, suspenda la paleta de células en aproximadamente 40 mililitros de lisis preenfriada, tampón por litro de cultivo, utilizando una combinación de pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces, y un homogeneizador de vidrio sonicato durante tres ciclos de 15 segundos en 15 segundos de apagado.

A continuación, centrifuga tus 108.000 veces G durante 25 minutos a cuatro grados centígrados y conserva el natante supino. A continuación, equilibre 1,2 mililitros de resina aros empaquetada Anti-Flag por litro de cultivo lavando tres veces con tampón de equilibrio de resina para incubar el supinado, que representa el extracto de célula completa con la resina de afinidad en uno o más tubos de centrífuga de 50 mililitros que giran suavemente durante 30 a 120 minutos de cuatro grados Celsius después de la centrífuga de incubación a 3000 veces G durante un minuto a cuatro grados Celsius. Después de desechar el supinato, transfiera la resina a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y lave con un total de 45 mililitros de tampón preenfriado, una centrífuga antes y luego deseche el lavado y la centrifugación repetidos supinatos con tampón con alto contenido de sal, seguido de un tampón de baja sal y un tampón de escisión TEV.

Asegúrate de que cada lavado sea suficiente para volver a suspender completamente la resina, pero no más. A continuación, recoja una muestra de resina de 10 microlitros y dilúyala en un volumen de tampón de carga de proteínas dos veces superior para su análisis y represente la muestra de proteína unida. No utilices agentes reductores, ya que liberarán el anticuerpo de la resina.

A continuación, vuelva a suspender la resina en 10 mililitros de tampón de escisión TEV preenfriado a aproximadamente 40 microgramos de proteasa TEV por litro de cultivo original y mezcle invirtiendo el tubo varias veces. Los niveles de proteasa TEV se pueden optimizar de acuerdo con la cantidad de proteína expresada. Reemplace la atmósfera del tubo con gas nitrógeno al 100% para evitar la oxidación de las proteínas antes de rotar suavemente durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente.

Centrifugar la muestra a 3000 veces G durante 10 minutos, luego transferir el supinato a un filtro ultracentrífugo con un corte de peso molecular apropiado y concentrar hasta 500 microlitros. Recoja una muestra de 10 microlitros de la proteína concentrada y diluya en un volumen de tampón de carga de proteína dos veces para su análisis. Esta muestra representa la muestra de eluido TEV.

A continuación, recoge una muestra de 10 microlitros de la resina y dilúyela en un volumen de tampón de carga de proteínas dos veces. Esta muestra representa la muestra de resina posterior a TEV. El siguiente paso es hacer pasar la proteína a través de una columna de exclusión de tamaño y se debe utilizar una matriz de filtración de gel adecuada de acuerdo con el tamaño del complejo de interés.

En este caso, hemos utilizado una columna de cromatografía de exclusión de tamaño S 200 de 10 por 300 milímetros A para equiparar la columna de cromatografía de exclusión de tamaño con tampón de filtración en gel. Filtre la proteína a través de un filtro de 0,22 micras y cargue la muestra en la columna. Proceda a recoger las fracciones a medida que se desprenden de la columna.

Como paso final, realice la electroféresis en gel de poliacrilamida SDS o la página SDS en las muestras recolectadas, así como las fracciones de filtración de gel, histona DS SLA uno o HD uno supresor de silenciamiento defectuoso tres o SDS tres y syn tres, un dominio de interacción HDAC o syn tres, A HID forma un complejo turny estable. La purificación de afinidad del complejo de turny se puede observar a través de la página SDS. Aquí se muestra el complejo purificado producido por la cuna, seccionando dos litros de celdas.

El carril de proteínas unidas muestra el complejo unido a la resina de afinidad. Después de la digestión de TEV, la etiqueta presente en el seno tres A HID se escinde y se alude al complejo. La resina que se muestra aquí es un cromatograma del complejo proteico purificado mediante una columna de cromatografía de exclusión de tamaño S 200 de 10 por 300 milímetros.

Obsérvese que el complejo puro elude cerca del volumen vacío porque forma un dímero en solución. Finalmente, el análisis de la página SDS revela la proteína purificada en las fracciones de filtración en gel. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar, mantener y controlar las células HEC de dos y tres aplicaciones cultivadas en suspensión, así como cómo afinizar, purificar y concentrar su proteína.

Las células sanas complejas serán esenciales para el éxito de los experimentos, así que asegúrese de que crezcan y se mantengan en sus condiciones y paso regularmente. No se deje desanimar por el cultivo de tejidos. Es fácil para los biólogos estructurales expresar y purificar grandes cantidades de proteínas y complejos de proteínas de células de mamíferos.