Name: Un In Vitro Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprende la transformación de microglía en células globoides usando cultivos primarios y ciclinas para estudiar la leucodistrofia de Krabbe. Este modelo in vitro ayuda a comprender la fisiopatología celular.

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Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple (RG 5001-A-3 a S.J.C.), los Institutos Nacionales de Salud (NS065808 a E.R.B.; NS078392 a S.J.C.), fondos iniciales del Centro de Salud de UConn (a SJC) y el Fondo de la Familia Kim (UCHC en apoyo de K.I.C.).

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Política de Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio establecidos por la Oficina de Laboratorio Animal Welfare (NIH) y sólo con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Connecticut Health Center. 1 Preparación de mezcla de culturas gliales <ol><li> Esterilice todos los instrumentos antes de su uso. Añadir 3 ml de solución enfriada con hielo estéril salina equilibrada de Hank (HBSS) que no contiene cationes (Mg2 + o Ca2 +) a tres estériles 60 mm placas de Petri mantenidas en hielo para mantener frío. </li><li> Aislar las cortezas de postnatales crías de ratón P0-P2, como se describió previamente 17,18. NOTA: las estructuras subcorticales, como el hipocampo, no están incluidos en estas culturas. </li><li> Retire con cuidado las meninges y luego transferir las cortezas aisladas al fresco HBSS y disociar los tejidos enzimáticamente, usando un nekit de disección de tejido ural de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Placa de las células en frascos estériles T-175 e incubar durante la noche en medios de comunicación [medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS) que contiene 1x penicilina / estreptomicina]. </li><li> Vuelva a colocar todos los medios de comunicación al día siguiente con medio fresco. Continuar incubar culturas, con cambios regulares de los medios de comunicación, por aproximadamente 3 semanas o hasta que se establezca una monocapa celular. NOTA: Esta monocapa estará compuesto por astrocitos y microglia con un aproximadamente 10: 1 19. </li></ol> 2. globoides inducción celular en cultivos mixtos gliales <ol><li> Preparar los cubreobjetos ECM-revestido. <ol><li> Remojar cubreobjetos circulares con 1 N de ácido estéril clorhídrico (HCl) en una placa de Petri estéril durante 30 min. Lavar 3x cubreobjetos con agua estéril y luego sumergirse en EtOH al 95% durante al menos 20 min. y luego dejar que se seque al aire. </li><li> Coloque las gotas de matr extracelular diluidomateriales ix (ECM) de recubrimiento proteína en una hoja de Parafilm (por ejemplo, 150-250 l / gotita de laminina 10 mg / ml disuelto en solución tampón de fosfato estéril [PBS]). Distribuir las gotas para que cubreobjetos no tocar cuando se coloca en estas gotitas. Coloque con cuidado cada cubreobjetos secos sobre una gotita con fórceps. </li><li> Deja los cubreobjetos sobre las gotas para aprox. 4-6 horas dentro de la campana de cultivo con la hoja cerrada. </li><li> Coloque el cubreobjetos recubiertos (ECM ECM laterales recubiertos de arriba) en cada uno de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Lavar cada pocillo con PBS estéril 3x y mantener a 4 ° C hasta que se necesite. </li></ol></li><li> Preparación de células gliales para Plating en cubreobjetos. <ol><li> Aspirar los medios de comunicación de las culturas gliales y lavar suavemente los 3x monocapa gliales con 10 ml de PBS estéril. A continuación, agregue ml de solución de tripsina-EDTA 8-10 a la T-175, y se incuba durante 5-10 minutos a 37 ° C. </li><li> Cuando la mayoría de la monocapa se ha separado, añadir 20 ml de medio completoal matraz para detener la tripsinización. Recoger los medios que contienen las células separadas en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar durante 10 min a 300 xg a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento, y luego volver a suspender las células en 2 ml de medio completo fresco pipeteando suavemente la solución con una pipeta P1000. </li><li> Determinar el número de células usando un hemocitómetro y luego volver a suspender las células en medio completo a la densidad deseada (por ejemplo, 10 5 células / ml). Placa de las células sobre los cubreobjetos recubiertos con ECM (por ejemplo, 500 l en cada pocillo de la placa de 24 pocillos). Añadir medio completo fresco adicional a cada pocillo durante 3-5 días de incubación a 37 ° C, o hasta que las células crecen hasta la confluencia visual deseado. </li></ol></li><li> El tratamiento con psicosina. <ol><li> Reconstituir el psicosina a una concentración de reserva (108,3 mM) en dimetilsulfóxido (DMSO). Diluir esta población en EtOH al 100% para hacer una reserva de trabajo que puede eln ser añadido en cada pocillo de placa de 24 pocillos para conseguir una concentración final de 10 mM. </li><li> En el momento de añadir el psicosina, agitar suavemente la placa de cultivo para mezclar el psicosina en medios de cultivo. Complementar la psicosina añadiendo el equivalente de 10 mM cada dos días durante una semana. </li></ol></li><li> Después de 7 días de tratamiento psicosina, recoger los medios de comunicación y de pipeta 500 l de frío 4% de paraformaldehído (PFA) en cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min para fijar las células. A continuación, lavar cada pocillo 3 veces con PBS y luego mantener las placas a 4 ° C hasta su procesamiento para inmunocitoquímica (ver más abajo). NOTA: medios de cultivo celular puede ser recogido para enzimático o ensayo ELISA en este punto, si se desea. </li></ol> 3. inmunocitoquímica (CPI) para visualizar las células globosas <ol><li> Reemplazar PBS con tampón de bloqueo [PBS + 0,3% Tween-20 + 5% de suero normal de cabra (NGS)], e incubar las células durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> EnCubate las células fijadas en antisueros primaria contra Iba-1 [(1: 1000) diluido en PBS + 0,3% Tween-20 + 2% NGS] durante al menos 1 hora a temperatura ambiente, luego lavar cada pocillo con PBS 3x 5 min / lavar. </li><li> Añadir el anticuerpo secundario conjugado de fluorescencia correspondiente para identificar el anticuerpo etiquetado y la contra-tinción primaria con 4 &#39;, 6-diamino-2-fenilindol (DAPI, 1: 1000) para identificar los núcleos. Incubar en solución de anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente y lavar con PBS 3x 5 min. </li><li> Montar cada cubreobjetos a portaobjetos de microscopio utilizando un medio de montaje. Ver diapositivas en un microscopio de fluorescencia para los análisis visuales y cuantitativos. </li></ol> 4. Análisis y caracterización de las células en cultivo primario globoid <ol><li> Utilice los siguientes tres criterios morfológicos para identificar una célula globosas en la cultura: <ol><li> Identificar células globoides utilizando microscopía de fluorescencia, mediante el etiquetado immunopositive para el marcador microglial, Iba-1 +. </li><li> Identificarcélulas globoides como polinucleadas (es decir, que contienen dos o más núcleos positivos DAPI). </li><li> Identificar células globoides por una morfología redondeada distinta de la apariencia altamente ramificado de descansar células microgliales. NOTA: Las células también pueden ser recogidas para análisis de marcadores de la superficie celular y cuantificación por citometría de flujo de estos cultivos. </li></ol></li><li> La medición de la activación de la microglía fagocítica y células globoides <ol><li> Para evaluar la actividad fagocítica de microglia psicosina tratados, añadir perlas de látex marcadas con FITC a los pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir perlas de látex fluorescentes conjugados 48 horas antes de la fijación con PFA. Fijar las células tratadas con los granos (como se mencionó en la sección 2.4), y el proceso para inmunocitoquímica (como se describe en la sección 3). </li><li> Seleccionar anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado de modo que no se superponen los espectros de emisión de fluorescencia de las perlas de fluoróforo marcado. </li><li> Analyze los perfiles phagocytotic de Iba-1 + microglia mediante la identificación de las células que co-localizar con las cuentas marcadas con fluorescencia. NOTA: psicosina se activará microglia. Perlas fagocitados serán identificados dentro de Iba-1 + células mononucleadas y multinucleadas en esta configuración cultura. </li></ol></li></ol> 5. inducción de células globosas de cultivos purificados microgliales NOTA: Un enfoque alternativo para descifrar la señalización intercelular entre el astrocitos y microglia es otra ventaja de este modelo de células in vitro globoid en. La purificación de las células microgliales primarias para replating o co-cultivo se puede lograr mediante su propiedad menor adhesión en la cultura, tal como se describe en los siguientes pasos (ver Sección 5.2). <ol><li> Reunir los medios de comunicación de los confluentes mezcla de culturas gliales en 50 ml tubo cónico y mantenerla a 37 ° C en la incubadora. </li><li> Aislamiento Microglial de mezcla de culturas gliales primarios.<ol><li> Después de extraer el soporte de un frasco mixta confluente T175 cultura glial, añadir medios temblorosas cálidos [consistentes en medio completo + 25 mM de 4 (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) + 25 mM de bicarbonato de sodio (Sigma)]. Agitar los frascos de 3-4 horas en un agitador orbital a 100 rpm (37 ° C). Recoge los medios de estos matraces sacudidos en 50 ml tubos cónicos. NOTA: Este material debe incluir la microglia menos adherente de los frascos. </li><li> Haga girar los medios de comunicación a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 2 ml de los medios de comunicación de los astrocitos acondicionado (recogido en el paso 5.1). </li><li> Establecer el número de células adquirida usando un hemocitómetro y luego la placa de las células microgliales en cubreobjetos sustrato recubierto (ver sección 2.1) para inmunocitoquímica, o placa sobre placas de pocillos adherencia ultrabajo para la futura colección de células globoides para co-cultivo con otros tipos de células, tales como oligodendrocitos (como descRibed en la siguiente sección). NOTA: Una vez adherido la microglia se puede tratar con psicosina (10 M) como se describe anteriormente (ver sección 2.3). </li></ol></li><li> Co-cultivo con oligodendrocitos primarios para el análisis de citotoxicidad. NOTA: Colección de psicosina tratados con microglia de las placas de adherencia bajas para co-cultivo posterior en cultivos primarios de oligodendrocitos o células progenitoras de oligodendrocitos, se puede utilizar para examinar el potencial función citotóxica de estas células globosas-como in vitro. <ol><li> Desarrollar cultivos de oligodendrocitos primarios utilizando métodos establecidos 18,20. Para recoger la microglia psicosina tratados, pipetear suavemente para desprender las células poco adherentes desde el fondo de los pocillos. Recoger las células, centrifugar a 300 xg durante 10 min, y luego resuspender cuidadosamente en medio de diferenciación de oligodendrocitos [compuesto por los medios de comunicación Neurobasal, L-glutamina (1x), B-27 suplemento (1x), y triyodotironina (T3, 10 ng / ml )]. </li><li> Contar el número de células utilizando un hemocitómetro y luego sembrar las microglia en el cultivo de oligodendrocitos a 1 x 10 5 células / ml, resultando en un aproximado 1: 2 relación microglia / oligodendrocitos. Incubar como un co-cultivo por hasta 3 días. </li><li> Fijar las células para inmunocitoquímica (ver sección 2.4). Reunir los medios de cultivo celular para ELISA o análisis químicos según sea necesario. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El protocolo descrito en el presente documento proporciona un nuevo sistema modelo para estudiar el desarrollo y la caracterización funcional de microglia activadas y células globoides. Antes de trabajo por Im et al. utilizando una línea celular HEK293 proporciona un modelo para el desarrollo del presente protocolo para el estudio de la formación de células globosas 21. También es importante señalar que las células globoides derivados en el modelo se diferencian de las células globoides nativos ident...

Leucodistrofia de células globoides (GLD), también conocida como enfermedad de Krabbe, es una enfermedad desmielinizante fatal resultante de la pérdida de mutaciones de función en el galatocerebrosidase (GALC) gen 1. La forma más frecuente de GLD es la variante infantil, que se caracteriza por un inicio en la primera infancia y se caracteriza por un curso clínico agresivo del motor y el deterioro cognitivo que conduce a la muerte prematura a menudo antes de los cinco años de edad 2,3. Las pruebas genéticas se utiliza para verificar el diagnóstico de GLD 4. Neuropatología de GLD revela desmielinización generalizada, atrofia neuronal, astrogliosis y presencia de microglia multi-nucleadas llena de sangre llamadas células globoides 5-7. La identificación de células globoides, que a menudo contienen inclusiones tubulous en su citoplasma, ha sido una característica definitoria de GLD durante los últimos 97 años, aunque la función específica de estas células conspicuos ha permanecido esquivo. La participación de los no-Myelginarios gliales (astrocitos y microglia) en la patogénesis de GLD ha sido considerado una respuesta secundaria a la profunda desmielinización en esta enfermedad 8. Curiosamente, la primera descripción de esta enfermedad, hecho por Knud Krabbe en 1916 5, la formación informado de los fagocitos multinucleadas que contienen restos de lípidos que se han llamado &#39;globoides células&#39; y son una característica definitoria de esta enfermedad. Células globosas son el rasgo distintivo de GLD patología, aunque su papel en GLD mucho tiempo se ha ignorado. Curiosamente, estas células se encuentran entre los primeros cambios característicos en el tejido del SNC de GLD. Esta falta de conocimiento puede haber sido debido a la suposición de que la formación de los fagocitos multinucleadas, llamadas células gigantes en otras enfermedades, se considera típicamente como consecuencia de la patología y no una fuerza impulsora patogénico inicial 9. Por lo tanto, ha habido pocos estudios que investigan el mecanismo por el whicélulas globoides ch se forman a partir de los fagocitos, particularmente en el SNC de GLD. El procedimiento descrito en este informe se centra en la importancia de la formación de células globosas en el SNC y nuestra demostración previa de que multinucleación inducida psicosina de microglia in vitro y estas células mostraron niveles más altos de actividad fagocítica. Consistente con estas observaciones, las células globoides en los cerebros twitcher frecuentemente contienen restos PAS positivo, lo que sugiere altos niveles de actividad fagocítica. Células globosas también se encuentran para ser immunopositive de ferritina (un marcador de microglia) 10, KP-1 / CD68 (un marcador de monocitos), y algunos son también positivas para vimentina (una proteína intermedia de filamento y el marcador de astrocitos y microglia activada) 11, HLA-DRa (un receptor de la superficie MHCII), y TNF-α 7, y Iba-1 (una proteína de unión de calcio utilizado para identificar microglia) 12. Sobre la base de esta colección de marcadores, las células globoides originan a partir de microglia que se desarrollanun fenotipo único. A pesar de su singularidad, la función y la contribución de los GC a GLD patogénesis específica ha sido pasado por alto. Células globosas se han pensado para ser una consecuencia secundaria de la desmielinización crónica. Sin embargo, estudios anteriores que examinaron la asociación temporal de células globoides a la patología de la materia blanca del GLD han identificado la presencia de células globoides a finales de embriones para el periodo posnatal temprana; tiempos anteriores apoptosis de los oligodendrocitos y desmielinización abierta 13. Por lo tanto, la secuencia temporal de desarrollo de la neuropatología en GLD sugiere que las células globoides se forman antes de desmielinización en esta enfermedad 14. Esto condujo a la hipótesis de que la formación temprana de células globoides en GLD puede representar un acontecimiento patogénico definir en lugar de una respuesta reactiva secundaria a daño de oligodendrocitos 15. Además, la desregulación de la actividad microglial en GLD se ha considerado un factor limitar la eficacia a largo plazo de las terapias de células madre hematopeotic para el tratamiento de esta enfermedad 16. Por lo tanto, se espera que la investigación de las funciones celulares y la regulación de la microglia y células globoides, en respuesta a psicosina para proporcionar nuevos conocimientos en la patogénesis de GLD. Hasta hace poco, la falta de un modelo apropiado para estudiar la formación de células globosas había limitado la comprensión de la función precisa y la contribución de estas células a la patología de GLD. En estudios recientes, se determinó que las células globoides-como se pueden formar en respuesta directa a psicosina, una toxina de lípidos patógena que se acumula en GLD. Encontramos que la microglia, pero no los macrófagos, se activan y se transforman en células globoides en cultivos gliales primarios en respuesta a psicosina 15. Esta transformación en células globoides se encontró que es mediado por la proteasa extracelular, metaloproteinasa de matriz (MMP) -3 15. Más recientemente, hemoshan ampliado estos hallazgos y determinó que las células de la microglia y globoides psicosina activado desarrollados en este sistema modelo in vitro en son potencialmente tóxicos para los oligodendrocitos y las células progenitoras de oligodendrocitos. Por lo tanto, cuando se considera en el contexto de GLD, la acumulación temprana de psicosina y la formación de células globoides anteriores a la desmielinización apoyaría un papel primario y posiblemente patógena emergente para la microglia en esta enfermedad. Proponemos que el estudio de la formación de células globosas revelará nueva información acerca de la patogénesis de la División de Asuntos Jurídicos, que contribuirá a nuestra comprensión de esta enfermedad. Por otra parte, este nuevo modelo celular de GLD puede proporcionar un nuevo formato de la que nuevos enfoques terapéuticos para abordar los cambios patológicos en la enfermedad podrían ser probados. Por lo tanto, en este informe se proporciona un protocolo detallado para el desarrollo in vitro de células globoides inducida psicosina-de cultivos primarios de células gliales no mielinizantes.

<table><tbody><tr><td>Hank' s solución salina equilibrada (HBSS) que no contiene cationes (Mg2+ y Ca2+).</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Kit de disociación de tejido neural</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &#956; m filtro de celdas</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s solución salina equilibrada (HBSS) que contiene cationes (Mg2+ y Ca2+).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA Tecnologías</td><td>de la vida</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psychosine</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Microscopía electrónica Science</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal de cabra (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor conjugado antisera</td><td>Life Technologies</td><td>Varios</td><td></td></tr><tr><td>medios de montaje</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo fagocítico</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

un in vitro modelo para el estudio del celular fisiopatología en globoides leucodistrofia celular

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

La función precisa de la microglia multi-nucleado, llamadas células globoides, que son únicamente abundantes en el sistema nervioso central de leucodistrofia de células globoides (GLD) no está clara. Esta brecha en el conocimiento se ha visto obstaculizado por la falta de un adecuado modelo in vitro para el estudio. Aquí se describe un sistema de cultivo glial murino primaria en el que el tratamiento con resultados psicosina en multinucleación de microglia se asemejan a las células globoides característicos encontrados en GLD. El uso de este novedoso sistema, se definieron las condiciones y modos de análisis para el estudio de las células globoides. El uso potencial de este sistema modelo fue validado en nuestro estudio anterior, que identificó un posible papel de metaloproteinasas de matriz (MMP) -3 en GLD. Este novedoso sistema in vitro puede ser un modelo útil para estudiar la formación y función, sino también el potencial manipulación terapéutica, de estas células únicas.

Este protocolo, como está escrito, se espera que tome aproximadamente 36 días para completar de principio a fin (Ver Figura 1: Esquema de flujo de trabajo experimental). Ha sido nuestra experiencia que el desarrollo de células globosas-como "en este sistema de cultivo primario es a la vez fiable y reproducible: la formación de células multinucleadas en respuesta a psicosina se observó consistentemente con 7 días de tratamiento. La tinción inmunocitoquímica de microglia utili...

Las células globoides son una característica patológica definitoria de la enfermedad de Krabbe, una leucodistrofia que actualmente carece de una terapia efectiva a largo plazo. Hemos desarrollado un modelo de cultivo celular para estudiar la biología innata y el potencial patogénico de la microglía activada y su transformación en células globoides.

Un In Vitro Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la transformación única de la microglía en células GLO en presencia de la toxina ciclina. Esto se logra mediante el recubrimiento primero de los cubreobjetos con proteínas de la matriz extracelular. En el segundo paso, las células gliales se siembran en los cubreobjetos y, a continuación, se administran perlas de ciclina y látex a los cultivos.En el paso final, las células se tiñen mediante inmunoquímica. En última instancia, los efectos de la ciclina sobre la nucleación y la capacidad fagocítica de las células microgliales pueden evaluarse mediante microscopía inmunofluorescente. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso de líneas celulares microgliales, es que el uso de cultivos gliales primarios imita las interacciones hipotéticas entre los astrocitos I y la microglía en cerebros de individuos con leucodistrofia de células vacías GLO o GLD, lo que demuestra que el procedimiento será KO Claycomb, un estudiante graduado de mi laboratorio.Para preparar la matriz extracelular o los cubreobjetos recubiertos de ECM, primero remoje los cubreobjetos circulares con ácido clorhídrico estéril en una placa de Petri estéril. Después de 30 minutos, lave los cubreobjetos tres veces con agua estéril y luego sumérjalos en etanol al 95% durante al menos 20 minutos. Después de dejar que los cubreobjetos se sequen al aire, agregue de 150 a 250 microlitros de materiales de recubrimiento de proteínas ECM diluidos en una hoja de paraforma distribuyendo las gotas para que los cubreobjetos no se superpongan después de la colocación.A continuación, use pinzas para colocar suavemente un cubreobjetos en cada gota y luego coloque el paraforme dentro de una campana de cultivo celular con la faja cerrada después de cuatro a seis horas, coloque los cubreobjetos con el lado recubierto de ECM hacia arriba en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos. A continuación, lave cada pocillo con PB S3 estéril varias veces y guarde los cubreobjetos a cuatro grados centígrados. Para preparar las células gliales para la colocación en los cubreobjetos, aspire los medios de los cultivos de células gliales y, a continuación, lave suavemente las monocapas tres veces con 10 mililitros de PBS estéril.Separe las células con ocho a 10 mililitros de tripsina EDTA después de cinco a 10 minutos. A 37 grados centígrados, agregue 20 mililitros de medio completo al matraz para detener la reacción. A continuación, transfiera la suspensión de células a un tubo cónico de 50 mililitros y gire las células durante 10 minutos.A 300 Gs y temperatura ambiente, use un P 1000 para resuspender suavemente el paladar en dos mililitros de medio fresco y completo. Después de contar, diluya las células a aproximadamente una vez 10 a la quinta celdas por mililitro. Ahora coloque 500 microlitros de las celdas en cada uno de los cubreobjetos recubiertos de ECM.Agregue medios completos frescos adicionales a cada pocillo y luego incube la placa a 37 grados centígrados durante tres a cinco días. Una vez que las células hayan alcanzado la confluencia deseada, agregue ciclina recién preparada a cada pocillo y agite suavemente la placa de cultivo para mezclar. Después de una semana de tratamiento con ciclina, recoja los medios y fije las células en 500 microlitros de formaldehído frío al 4% por pocillo a temperatura ambiente.A continuación, lave cada pocillo tres veces con PBS y guarde los platos a cuatro grados centígrados. Para visualizar las células GLO mediante inmunocitoquímica, primero reemplace el PBS con tampón de bloqueo e incube las células a temperatura ambiente. Después de una hora, incubar las células en antisueros primarios contra el marcador de microglía IO uno durante al menos una hora a temperatura ambiente, y luego lavar cada pocillo tres veces en PBS durante cinco minutos.Después de incubar las células con el anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia adecuado, contratiñe las células con DAPI para identificar los núcleos. Luego, después de lavar las células como se acaba de demostrar, use el medio de montaje para montar cada cubreobjetos en portaobjetos de microscopio individuales y visualice los portaobjetos en un microscopio fluorescente para el análisis visual y cuantitativo. Para evaluar la actividad fagocítica de la microglía tratada con ciclina después del tratamiento con ciclina, pero antes de la fijación, agregue perlas de látex marcadas con FITC a cada cultivo de células G OID de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Después de 48 horas, fije las células en PFA como se acaba de demostrar y, a continuación, procese las células para la inmunoquímica como se muestra. Por último, evaluar el número de microglías positivas para IBO que se colocalizan con las perlas marcadas con fluorescencia mediante microscopía inmunoquímica de fluorescencia. La tinción de la microglía mediante IO one junto con una contratinción nuclear permite la identificación de células multinucleadas redondeadas de gran tamaño.Tenga en cuenta que en muchos casos, el aumento bruto del tamaño del núcleo refleja el estado multinucleado de estas células como se observa en esta imagen, el tratamiento con ciclina también evoca una activación generalizada de la microglía que se puede medir mediante un aumento en la actividad ácida PHA de la microglía mononucleada, así como de las células GLO multinucleadas. Como se observa en esta imagen representativa, los perfiles de PHA ácidamente activos de la microglía IBO una positiva se pueden identificar fácilmente durante el cocultivo con células progenitoras de oligodendrocitos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la GLD, ya que la formación de estas células multinucleadas en respuesta al tratamiento con ciclinas es una característica definitoria de la neuropatología de la GLD y la contribución de estas células a esta patología no se ha explorado de esta manera anteriormente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo describe la derivación de gliales Precursores restringidos de fetales médulas espinales y mantuvieron in vitro ya sea para el trasplante o para el estudio de linaje oligodendrocíticos.

Derivación de los precursores gliales restringidas de los ratones E13

El video muestra un protocolo para diferenciar células precursoras de oligodendrocitos (OPC) en oligodendrocitos e inducir mielinización en un cocultivo con neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG). Las OPC se transducen con vectores lentivirales que codifican una proteína de señalización que regula la mielinización. Las OPC transducidas se cocultivan con neuronas DRG para evaluar la diferenciación en oligodendrocitos y la mielinización inducida por proteínas de señalización.

Ensayo de mielinización inducida por transducción in vitro para células precursoras de oligodendrocitos

A continuación, presentamos un enfoque sistemático para desarrollar fisiológicamente relevante, sensible y...

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

Los astrocitos fenotípicamente salvajes y las células madre neurales recolectadas de ratones modificados con alelos oncogénicos condicionales floxados y transformados a través de la recombinación mediada por Cre viral se pueden utilizar para modelar la patogénesis del astrocitoma in vitro e in vivo mediante la inyección ortotópica de células transformadas en cerebros de compañeros de camada singénicos e inmunocompetentes.

Modelado astrocitoma Patogénesis In Vitro Y En Vivo Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

Aquí presentamos protocolos que ofrecen una base flexible y estratégica para manipular viralmente células precursoras de oligodendrocitos para sobreexpresar proteínas de interés con el fin de interrogar específicamente su papel en oligodendrocitos a través del modelo in vitro de mielinización del sistema nervioso central.

Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para In Vitro Ensayos de mielinización

Para abordar los mecanismos de desmielinización y apoptosis neuronal en lesiones corticales de trastornos inflamatorios desmielinizantes, se utilizan diferentes modelos animales. Aquí describimos un enfoque ex vivo mediante el uso de células T CD8+ específicas de oligodendrocitos en cortes de cerebro, lo que resulta en la muerte oligodendroglial y neuronal. Se discuten las posibles aplicaciones y limitaciones del modelo.

Una Ex vivo Modelo de un ataque de células T Oligodendrocyte dirigida en Rebanadas cerebral agudo

En este protocolo, se presentan los procedimientos para establecer modelos de distrofia miotónica de mioblastos 1, incluyendo el mantenimiento optimizado C2C12 celular, transfección de genes / transducción, y la diferenciación de los miocitos.

Modelado de la distrofia miotónica 1 en las células C2C12 mioblastos

El objetivo de esta técnica es preparar una cultura altamente enriquecida de primarias motoneuronas (MNs) de murine de la médula espinal. Para evaluar las consecuencias de las mutaciones que causan enfermedades de MN, Describimos aquí el aislamiento de estos aislados MNs y su transfección por magnetofection.

Modelado enfermedad del Charcot-Marie-diente In Vitro por transferencia primaria Motoneurons de ratón

Los organoides cerebrales sirven como un modelo valioso para los estudios de encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica y episodios similares a accidentes cerebrovasculares (MELAS), ofreciendo información sobre su fisiopatología subyacente y proporcionando una plataforma para la detección de fármacos. Los organoides derivados de líneas celulares con diferentes niveles de heteroplasmia de genes causantes de enfermedades exhiben diferencias fenotípicas significativas.

Modelado de enfermedades mitocondriales utilizando organoides cerebrales: un enfoque en la encefalomiopatía mitocondrial, la acidosis láctica y los episodios similares a accidentes cerebrovasculares

Las ataxias espinocerebelosas de poliglutamina son causadas por expansiones CAG que producen proteínas propensas a la agregación. Este protocolo describe la producción vectorial, la entrega estereotaxica y el análisis de inclusiones y pérdida de marcadores neuronales, proporcionando una plataforma controlada para investigar mecanismos y evaluar terapias dirigidas para enfermedades neurodegenerativas.

Patología estriatal inducida por lentivirales como modelo preclínico de ataxias poliglutaminas, espinocerebelosas

Aprende la transformación de microglía en células globoides usando cultivos primarios y ciclinas para estudiar la leucodistrofia de Krabbe. Este modelo in vitro ayuda a comprender la fisiopatología celular.

Un In Vitro Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular

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