Un In Vitro Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la transformación única de la microglía en células GLO en presencia de la toxina ciclina. Esto se logra mediante el recubrimiento primero de los cubreobjetos con proteínas de la matriz extracelular. En el segundo paso, las células gliales se siembran en los cubreobjetos y, a continuación, se administran perlas de ciclina y látex a los cultivos.

En el paso final, las células se tiñen mediante inmunoquímica. En última instancia, los efectos de la ciclina sobre la nucleación y la capacidad fagocítica de las células microgliales pueden evaluarse mediante microscopía inmunofluorescente. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso de líneas celulares microgliales, es que el uso de cultivos gliales primarios imita las interacciones hipotéticas entre los astrocitos I y la microglía en cerebros de individuos con leucodistrofia de células vacías GLO o GLD, lo que demuestra que el procedimiento será KO Claycomb, un estudiante graduado de mi laboratorio.

Para preparar la matriz extracelular o los cubreobjetos recubiertos de ECM, primero remoje los cubreobjetos circulares con ácido clorhídrico estéril en una placa de Petri estéril. Después de 30 minutos, lave los cubreobjetos tres veces con agua estéril y luego sumérjalos en etanol al 95% durante al menos 20 minutos. Después de dejar que los cubreobjetos se sequen al aire, agregue de 150 a 250 microlitros de materiales de recubrimiento de proteínas ECM diluidos en una hoja de paraforma distribuyendo las gotas para que los cubreobjetos no se superpongan después de la colocación.

A continuación, use pinzas para colocar suavemente un cubreobjetos en cada gota y luego coloque el paraforme dentro de una campana de cultivo celular con la faja cerrada después de cuatro a seis horas, coloque los cubreobjetos con el lado recubierto de ECM hacia arriba en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos. A continuación, lave cada pocillo con PB S3 estéril varias veces y guarde los cubreobjetos a cuatro grados centígrados. Para preparar las células gliales para la colocación en los cubreobjetos, aspire los medios de los cultivos de células gliales y, a continuación, lave suavemente las monocapas tres veces con 10 mililitros de PBS estéril.

Separe las células con ocho a 10 mililitros de tripsina EDTA después de cinco a 10 minutos. A 37 grados centígrados, agregue 20 mililitros de medio completo al matraz para detener la reacción. A continuación, transfiera la suspensión de células a un tubo cónico de 50 mililitros y gire las células durante 10 minutos.

A 300 Gs y temperatura ambiente, use un P 1000 para resuspender suavemente el paladar en dos mililitros de medio fresco y completo. Después de contar, diluya las células a aproximadamente una vez 10 a la quinta celdas por mililitro. Ahora coloque 500 microlitros de las celdas en cada uno de los cubreobjetos recubiertos de ECM.

Agregue medios completos frescos adicionales a cada pocillo y luego incube la placa a 37 grados centígrados durante tres a cinco días. Una vez que las células hayan alcanzado la confluencia deseada, agregue ciclina recién preparada a cada pocillo y agite suavemente la placa de cultivo para mezclar. Después de una semana de tratamiento con ciclina, recoja los medios y fije las células en 500 microlitros de formaldehído frío al 4% por pocillo a temperatura ambiente.

A continuación, lave cada pocillo tres veces con PBS y guarde los platos a cuatro grados centígrados. Para visualizar las células GLO mediante inmunocitoquímica, primero reemplace el PBS con tampón de bloqueo e incube las células a temperatura ambiente. Después de una hora, incubar las células en antisueros primarios contra el marcador de microglía IO uno durante al menos una hora a temperatura ambiente, y luego lavar cada pocillo tres veces en PBS durante cinco minutos.

Después de incubar las células con el anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia adecuado, contratiñe las células con DAPI para identificar los núcleos. Luego, después de lavar las células como se acaba de demostrar, use el medio de montaje para montar cada cubreobjetos en portaobjetos de microscopio individuales y visualice los portaobjetos en un microscopio fluorescente para el análisis visual y cuantitativo. Para evaluar la actividad fagocítica de la microglía tratada con ciclina después del tratamiento con ciclina, pero antes de la fijación, agregue perlas de látex marcadas con FITC a cada cultivo de células G OID de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Después de 48 horas, fije las células en PFA como se acaba de demostrar y, a continuación, procese las células para la inmunoquímica como se muestra. Por último, evaluar el número de microglías positivas para IBO que se colocalizan con las perlas marcadas con fluorescencia mediante microscopía inmunoquímica de fluorescencia. La tinción de la microglía mediante IO one junto con una contratinción nuclear permite la identificación de células multinucleadas redondeadas de gran tamaño.

Tenga en cuenta que en muchos casos, el aumento bruto del tamaño del núcleo refleja el estado multinucleado de estas células como se observa en esta imagen, el tratamiento con ciclina también evoca una activación generalizada de la microglía que se puede medir mediante un aumento en la actividad ácida PHA de la microglía mononucleada, así como de las células GLO multinucleadas. Como se observa en esta imagen representativa, los perfiles de PHA ácidamente activos de la microglía IBO una positiva se pueden identificar fácilmente durante el cocultivo con células progenitoras de oligodendrocitos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la GLD, ya que la formación de estas células multinucleadas en respuesta al tratamiento con ciclinas es una característica definitoria de la neuropatología de la GLD y la contribución de estas células a esta patología no se ha explorado de esta manera anteriormente.