Proteína Aislamiento del desarrollo embrionario del corazón del ratón Válvula Región
23 de septiembre de 2014
El análisis de la expresión de proteínas en válvulas de ratones embrionarios jóvenes se ha visto obstaculizado por el limitado tejido disponible. Este manuscrito proporciona un protocolo para la preparación de proteínas a partir de regiones de válvulas de ratón embrionarias en desarrollo para el análisis de Western blot.
El objetivo general de este procedimiento es aislar y extraer proteínas de las válvulas cardíacas embrionarias. Esto se logra aislando primero un embrión de una rata embarazada. En el segundo paso, se disecciona el corazón del embrión y luego se recogen las válvulas cardíacas en el paso final.
El tejido se lisa y la muestra de proteína resultante se prepara para su posterior análisis. En última instancia, el análisis de BLO occidental se puede utilizar para evaluar los niveles de expresión de proteínas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de disección son difíciles de aprender debido a la forma pequeña y compacta del corazón en desarrollo.
En el día embrionario deseado de desarrollo, use etanol al 70% para esterilizar el abdomen de la hembra embarazada. A continuación, levante la piel y el músculo de la parte inferior del abdomen y aléjelo de los órganos internos, y diseccione la cavidad abdominal inferior para permitir el acceso al cuerno uterino. A continuación, sujete el cuello uterino con pinzas y corte con cuidado el mimo hasta las puntas.
A continuación, levante el cuerno uterino cortando cualquier tejido conectivo que mantenga el cuerno en su lugar, y complete la extracción cortando la unión del cuerno uterino con el uct. Coloque el cuerno uterino disecado en una placa de Petri que contenga tampón tris frío de 0,1 molares y enjuague según sea necesario. Luego corte el cuerno uterino.
Abrir a lo largo para exponer los sacos embrionarios. Para exponer un embrión, se debe abrir un saco embrionario en la unión de la placenta y el embrión, y cortar los vasos umbilicales para liberar al embrión. Coloque el embrión disecado en una segunda placa de Petri con tampón tris frío de 0,1 molares y devuelva la primera placa de Petri con los embriones restantes no disecados a hielo hasta la próxima disección embrionaria.
Después de la decapitación, coloque el embrión boca arriba y corte la pared torácica verticalmente a lo largo del costado de la caja torácica cerca de una cojera y horizontalmente por encima del diafragma. Para visualizar el corazón, abre la pared torácica. A continuación, sostenga las pinzas en lo alto a lo largo de los grandes vasos, levante el corazón y corte los vasos que se encuentran debajo.
A continuación, corte por encima de las pinzas para liberar el corazón. Si los vasos pulmonares permanecen sin cortar, extirpar los pulmones con el corazón antes de continuar en las etapas embrionarias descritas en este documento, la arteria pulmonar es ligeramente opaca. Después de identificar la arteria, córtela y retírela por encima del nivel de la válvula.
Ahora, corte justo debajo de la válvula pulmonar, evitando el miocardio ventricular ECD, y retire el exceso de tampón tris de la región de interés. Antes de colocar la válvula en un tubo de Einor que contiene dos microlitros de tampón de lisis como la arteria pulmonar, la aorta parecerá ser ligeramente opaca. Después de su identificación, corte justo debajo de la válvula aórtica.
De nuevo, evitando el miocardio ventricular trabeculado. Retire cualquier exceso de solución tri y luego transfiera la válvula al tubo de einor que contiene lisis, tampón y tejido de la arteria pulmonar. Una vez que se haya recolectado todo el tejido, coloque inmediatamente las muestras a menos 80 grados Celsius hasta que se acerque.
Úselo para la extracción de proteínas, descongele los tejidos recolectados en hielo y luego granule las muestras durante un minuto a 13, 100 G a cuatro grados Celsius. Compruebe el volumen de la muestra resultante y utilice un tampón de lisis para aumentar el volumen total hasta 40 microlitros. A continuación, añada cinco milímetros de perlas de acero inoxidable para interrumpir y homogeneizar las muestras en un lir durante dos a cuatro minutos a 50 hercios, según las instrucciones del fabricante.
Después de la homogeneización, centrifugar los tubos brevemente y transferir las muestras a nuevos tubos, dejando atrás los residuos insolubles para su posterior análisis experimental. Utilizando esta técnica de preparación, se puede detectar smad 1 5 8 fosforilado en regiones de válvulas aórticas individuales de embriones E 13.5. Por ejemplo, la proteína aislada de una sola región de la válvula es suficiente para detectar una banda p smad débil con la intensidad de la señal aumentando proporcionalmente al número de regiones de la válvula que se agrupan.
Es importante destacar que la proporción de p smad beta actina permanece claramente constante en los diferentes tamaños de muestra debido a los bajos niveles de proteína disponibles, el mismo blot no se puede eliminar y volver a probar para el smad total. Sin embargo, un blot separado que muestra smad one total y beta actin exhibe el mismo patrón de expresión. Estas regiones valvulares están casi totalmente desprovistas de miocardio ventricular contaminante utilizando esta técnica de preparación en combinación con muestras del ventrículo derecho, el marcador de miocardio ventricular, un NP no es detectable en las regiones de la válvula aórtica, mientras que este marcador se detecta fácilmente en el ventrículo.
Además, el marcador miocárdico ventricular de cadena ligera de miosina dos V también es fácilmente detectable en la muestra ventricular, pero apenas es detectable en las regiones de la válvula aórtica, lo que subraya la precisión de la disección posterior a esta disección. Se pueden realizar otros MES, como QPCR o RN AIC, para responder a preguntas adicionales, como qué genes posteriores se ven afectados durante los diferentes pasos del desarrollo.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para aislar y extraer proteínas de las válvulas cardíacas embrionarias en ratones. El método aborda los desafíos en el análisis de la expresión proteica debido a la disponibilidad limitada de tejido.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Investigación cardiovascular
Antecedentes
- El análisis de la expresión proteica en tejidos embrionarios suele estar limitado por el tamaño de la muestra.
- Comprender los niveles de proteínas en las válvulas cardíacas es fundamental para los estudios del desarrollo.
- El análisis por inmunotransferencia (Western blot) es una técnica común para evaluar la expresión proteica.
- La disección de tejidos pequeños, como los corazones embrionarios, puede ser técnicamente difícil.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la extracción de proteínas de las válvulas cardíacas de embriones de ratón.
- Facilitar el análisis por inmunotransferencia (western blot) para estudiar los niveles de expresión proteica.
- Mejorar la reproducibilidad y precisión en el análisis de proteínas a partir de muestras limitadas.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de embriones de ratones preñados.
- Diseción del corazón del embrión.
- Recolección de válvulas cardíacas para la extracción de proteínas.
- Lisis del tejido para preparar muestras proteicas para análisis.
Resultados principales
- Extracción exitosa de proteínas de las válvulas cardíacas embrionarias.
- Preparación de muestras adecuadas para análisis mediante blot de Western.
- Demuestra técnicas de disección para un aprendizaje efectivo.
- Evaluación de los niveles de expresión proteica en tejidos cardíacos en desarrollo.
Conclusiones
- El protocolo permite un estudio efectivo de la expresión proteica en válvulas cardíacas embrionarias.
- Los recursos visuales son esenciales para dominar las técnicas de disección.
- Este método puede impulsar la investigación en desarrollo cardíaco y campos relacionados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de proteínas a partir de tejidos embrionarios limitados permite la detección de la activación de vías de señalización en modelos de desarrollo temprano. Este enfoque facilita la validación de dianas al proporcionar datos semicuantitativos sobre proteínas fosforiladas procedentes de regiones valvulares microdiseccionadas y agrupadas. El método aborda un cuello de botella clave en la investigación preclínica, donde la escasez de muestras dificulta la desactivación mecanicista de dianas cardiovasculares.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en el desarrollo de las válvulas cardíacas mediante la detección de proteínas de señalización fosforiladas como pSmad1/5/8.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo reproducible para la extracción de proteínas de cuatro regiones de la válvula aórtica de ratón en E13.5, cada una con un rendimiento de ~1 µg de proteína.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos al permitir la evaluación semicuantitativa de la activación de rutas en sistemas embrionarios relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara muestras biológicas validadas para análisis posteriores por inmunotransferencia, lo que permite una evaluación confiable de compuestos en cribados fenotípicos.
- Valor operativo: Estandariza protocolos de lisis y homogenización utilizando un tampón basado en Tris con inhibidores de proteasas y tampón muestral con SDS para la desnaturalización.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en diferentes puntos temporales del desarrollo mediante la agrupación de tejidos para superar las limitaciones derivadas de bajos rendimientos proteicos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los datos de expresión proteica en fase de descubrimiento con la validación preclínica mediante proporciones consistentes de pSmad/β-actina en diferentes tamaños de muestra.
- Reducción de Ambigüedad Mecanística: Disminuye la incertidumbre en el acoplamiento al blanco al confirmar la exclusión del miocardio ventricular mediante la ausencia de los marcadores MYL2V y ANP en las regiones valvulares.
- Confianza Predictiva: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo al vincular los patrones de expresión proteica con las etapas del desarrollo utilizando controles internos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se encaja en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos iniciales, al proporcionar lecturas mecanicistas a partir de sistemas embrionarios relevantes para la enfermedad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la detección de proteínas de señalización fosforiladas en tejido valvular.
- Tamizaje: Proporciona muestras listas para ensayos mediante extracción estandarizada de proteínas, permitiendo resultados reproductibles en inmunotransferencia para el tamizaje de compuestos.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes mediante la intensidad del señal quimioluminiscente proporcional al tamaño del grupo proteico, lo que permite el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Mantiene la continuidad desde el descubrimiento embrionario hasta modelos preclínicos al preservar los patrones de expresión específicos de la vía, detectables en inmunotransferencias separadas para Smad total y β-actina.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad escalable para el aislamiento de proteínas en estudios cardiovasculares embrionarios, reduciendo el desarrollo redundante de protocolos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al permitir la detección de proteínas fosforiladas de baja abundancia procedentes de tejidos microdiseccionados.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante volúmenes definidos de lisis, homogenización basada en perlas y una preparación de muestras consistente para el inmunoblot.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del proyecto al reducir la ambigüedad mecanicista en la evaluación temprana de dianas cardiovasculares.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos semicuantitativos de activación de vías procedentes de regiones valvulares embrionarias.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microdisección de estructuras cardíacas embrionarias para aislar regiones valvulares sin contaminación del miocardio ventricular.
- Depende de instrumentación para la homogenización (lisador con perlas de acero inoxidable) y centrifugación a 13,100 × g para la clarificación de muestras.
- Necesita una estandarización entre equipos del volumen del tampón de lisis (volumen final de 40 µL) y del uso de inhibidores de proteasas para garantizar la consistencia de las muestras.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el protocolo a otros tejidos embrionarios o etapas de desarrollo distintas a las regiones de la válvula aórtica en E13.5.
- Incluye limitaciones prácticas, como la imposibilidad de cuantificar la proteína total mediante espectrofotometría debido al bajo rendimiento, lo que requiere confiar en análisis semicuantitativos por inmunotransferencia (western blot).
