Name: Generación de Enterobacter Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Aprende a generar mutantes auxótrofos de Enterobacter sp. YSU mediante mutagénesis con transposón. Este método permite identificar genes esenciales para el crecimiento en medio mínimo con glucosa mediante replicaplaca y secuenciación.

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El autor desea agradecer a todos mis estudiantes de pregrado de Investigación Independiente y todos mis estudiantes de posgrado Fisiología Microbiana que probaron mis ideas de mutagénesis de transposón durante los semestres de primavera 2010-2014. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de Youngstown.

1. La electroporación de células competentes 5,11 <ol><li> Diluir una O / N LB cultura de Enterobacter sp. YSU 1/20 en 50 ml de medio LB fresco y crecer con agitación a 120 rpm y 30 ° C a una OD (600 nm) entre 0,4 y 0,6. Opcionalmente, crecer otras cepas bacterianas a su temperatura de crecimiento óptima. </li><li> Chill las células en hielo durante 5 min y se centrifuga a 4 ° C y 7000 xg durante 5 min. </li><li> Descartar el sobrenadante, resuspender las células en 50 ml de agua enfriada con hielo estéril y se centrifuga a 4 ° C y 7000 xg durante 5 min. Repita este paso. </li><li> Descartar el sobrenadante y resuspender las células en un volumen de agua fría de hielo igual al volumen de sedimento de células. Para el almacenamiento a largo plazo, se lavan las células con 10 ml de hielo frío 10% (v / v) de glicerol, se resuspende en un volumen igual de pellets de hielo frío 10% (v / v) de glicerol, almacenar a -80 ° C, y descongelar en hielo antes de la electroporación. </li><li> Añadir 0,5 l de la transposome a 40 l delas células. La solución transposome disponible comercialmente se suministra a una concentración de DNA de 0,33 g / l. Aunque se recomienda 0,33 mg, 0,165 g de ADN es suficiente. </li><li> Coloque la mezcla de células / transposome en un hielo frío, 0,2 mm, cubeta de electroporación y toque la mezcla a la parte inferior de la cubeta. Choque de las células a 25 mF, 200 Ω y 2,5 kV. Para asegurarse de que las células permanecen refrigerados, almacenar las cubetas de electroporación en un congelador a -20ºC antes de su uso. </li><li> Inmediatamente, añadir 960 l de caldo de filtro esterilizado súper óptima con represión catabólica (SOC) medio. Mezclar pipeteando arriba y abajo y transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril. NOTA: Las células empiezan a morir después de la descarga, pero la sal en el medio SOC les permite recuperarse. Para economizar, no es necesario añadir transposome o al choque de las células de control negativo. Sólo tiene que añadir 960 l de medio SOC estéril a ella. </li><li> Se incuban las células a 30 ° C fo 45-60 min con agitación a 120 rpm. Esto proporciona tiempo para la transposome para recombinarse con el genoma del huésped y por las células para expresar resistencia a la kanamicina. </li><li> Corre 100 l de células en una placa de agar LB-kan y se incuba la placa de O / N a 30 ° C. Guarde la mezcla de transformación que queda en el refrigerador a 4 ° C. Corre cantidades adicionales en una fecha posterior hasta 2 semanas después de la electroporación inicial, si es necesario. </li></ol> 2. Gridding de transformantes <ol><li> Cinta de una rejilla a la tapa de un vacío de 100 x 15 mm plato de petri. Copiar una rejilla de &quot;Un Curso Corto en Genética Bacteriana&quot; 12. </li><li> Dibuje una línea en la parte inferior de una placa de agar LB-kan. Utilice un pequeño trozo de cinta para anclar a la tapa de cuadrícula de modo que la rejilla es visible a través del agar. Asegúrese de que la línea en la parte inferior de la placa está alineada con la parte superior, centro de la rejilla. El anclaje de la placa con cinta mantiene que se deslice, lo que permite incluso grillado. La línea facilita la identificación de colonias después de la réplica en placa. </li><li> Escoja un único transformante con un palillo de dientes estéril y detectar en el centro de una plaza en la parrilla. Sólo tiene que tocar la colonia y el lugar. No cavar el palillo de dientes en el agar. Para evitar la contaminación de la placa, manejar el palillo de dientes sólo en un extremo. </li><li> Detectar otro transformante en una casilla adyacente como en el paso 2.3. Cuando la placa está llena, se incuba O / N a 30 ° C. Este es el plato principal. </li></ol> 3. Réplica galjanoplastia para determinar el fenotipo auxotroph 12 <ol><li> Para cada placa que fue cuadriculada, hacer una pila de tres placas de agar frescas numeradas del uno al tres: una para LB-kan, dos para M-9-kan y tres para LB-kan. Secar las placas al revés, O / N, a 37 ° C antes de su uso. </li><li> Dibuje una línea en la parte superior de cada placa como en el paso 2.2. </li><li> Limpie la herramienta de réplica en placa con etanol al 70%, colocar un cuadrado de terciopelo estéril en la parte superior de la chapa réplica aol y sujetar la plaza pana abajo. Las manos están llenas de microbios, incluso después de lavarlas. Evitar la introducción de contaminación de microbios por el manejo de la plaza de la pana por los bordes. </li><li> Alinear la línea en el plato principal con una línea dibujada en la abrazadera y coloque la placa en la parte superior de la plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir las bacterias de la placa de la plaza de pana. Tenga cuidado de no manchar las bacterias. Retire la placa principal de la plaza de pana. </li><li> Alinear la línea trazada en la placa con el número uno de la línea en la pinza y colocarla en la parte superior de la plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir la bacteria de la plaza de la pana a la placa. Retire la placa de número uno. </li><li> Deseche la plaza de pana en un vaso de agua y colocar un cuadrado de terciopelo limpio, estéril en la herramienta de réplica en placas como en el paso 3.3. Este paso evita la sobre-inoculación que provoca el crecimiento de avance y resultados falsos positivos. </li><li> Alinear lalínea en la placa de número uno con la línea en la pinza y colocarla en la parte superior de la nueva plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir las bacterias de la placa de número uno a la plaza de pana. Retire la placa de número uno. </li><li> Alinear la línea trazada en la placa número dos con la línea en la pinza y colocarla en la parte superior de la plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir la bacteria de la plaza de la pana a la placa de número dos. Retire la placa de número dos. </li><li> Repita el paso 3.8 para la placa número tres. La tercera placa es un control para la transferencia completa de la placa maestra a las otras dos placas. Deseche la plaza de pana en un vaso de agua. Para volver a utilizar las plazas de pana, autoclave el vaso que contiene los cuadrados de pana contaminados, lavarlos, secarlos, envolverlos en papel de aluminio y volver a autoclave ellos. </li><li> Las placas se incuban a 30 ° CO / N. Las colonias que crecen en ambas placas de agar LB-kan pero no logran crecer en placas M-9-kan se considera que son auxótrofos ( <strong&gt; Figura 2). </li><li> Streak cabo auxotrofos de placa de número uno en una placa de agar LB-kan fresca, e incubar la placa a 30 ° CO / N. </li><li> Streak a cabo para el aislamiento de 3 colonias de la placa de racha en el paso 3.11 en una placa de LB-kan fresco. Incubar la placa a 30 ° CO / N. Esto asegura que el mutante está bien aislado. Dividir el plato en tres partes y la racha fuera cada colonia en una sección. </li><li> Colonias spot de las colonias con rayas a cabo derivadas de paso 3.12 en una placa de LB-kan fresca para formar una cuadrícula como en los pasos 2.1 a 2.4. Cada mutante está siendo re-probado por triplicado. </li><li> Replicar placa de nuevo como en los pasos 3.1 a 3.10 para confirmar el fenotipo auxótrofo. </li></ol> 4. Gen Rescate <ol><li> Cultivar un 3 ml O / N cultura de una colonia mutante aislado de la etapa 3.13 en medio LB-kan líquido a 30 ° C. Se purifica el ADN genómico a partir de 1 ml de cultivo usando un kit de purificación de ADN genómico disponibles comercialmente. </li><li> Configurar una mezcla de 0,025 UEndonucleasa de restricción BFU CI y 14 l de 1 mg / l de ADN genómico en una reacción de 20 l en hielo. Desde BFU CI corta el transposón en doce sitios diferentes, puede ser más eficaz utilizar la endonucleasa de restricción, Bfa I o Hae III, que corta el transposón en dos y tres sitios diferentes, respectivamente. </li><li> Incubar la reacción a 37 ° C durante 25 min y después a 80 ° C durante 20 min para inactivar la enzima. Analizar 3 l de la ADN parcialmente digerido en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 3). A exitosos resultados parciales de digestión en una mancha de por encima de 10 kb hacia abajo a la parte inferior del gel. </li><li> Ligar 15 l de ADN genómico parcialmente digerido usando 800 unidades de ADN ligasa de T4 en una reacción de 500 l. Incubar la reacción de O / N a 4 ° C. El volumen de reacción grande maximiza la ligación de fragmentos individuales a sí mismos y minimiza las interacciones entre dos o más fragmentos de ADN. </li><li> Precipitate el ADN se ligó mediante la adición de 50 l de acetato de sodio 3 M, pH 5,5, y 1 ml de etanol de 95% y la incubación a -20 ° C durante 20 min. </li><li> El ADN de microcentrífuga a 4 ° C y 13.500 xg durante 10 min, se lava el sedimento con etanol al 70%, se seca en un concentrador de vacío centrífuga, y resuspender en 10 l de agua libre de nucleasa. Alternativamente, el ADN puede ser secada al aire a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Utilice 4 l de ADN se volvió a suspender para transformar E. coli cepa pir ECD100D o ECD100D pir116 por electroporación como en la sección 1. El origen de replicación γ R6K requiere una cepa bacteriana con un gen pir a replicar 6. Los resultados cepa pir en los plásmidos de copia bajos, y la cepa pir116 contiene un gen mutante pir que resulta en plásmidos de copias elevados. Cada transformante contiene un nuevo plásmido con el transposón y una región del cromosoma interrumpida (Figura 1E). </li><li> Inoculcomió 5 ml de medio LB-kan con una sola colonia, crecer O / N con agitación a 120 rpm y 37 ° C, y purificar ADN plasmídico a partir de la cultura entera O / N utilizando un kit comercial. </li><li> 14 l de digerir el plásmido usando la endonucleasa de restricción Xho I. Asegúrese de que el volumen final de la reacción es de 20 l. Esta enzima reconoce un sitio en el centro del transposón en el extremo 5 &#39;del gen de resistencia a kanamicina. Analizar 10 l de la plásmido no digerido y digerido en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 3). El plásmido consiste en el ADN del huésped 2 transposón kb además de acompañamiento. </li></ol> 5. Secuenciación de ADN <ol><li> Secuenciar el plásmido usando un kit de secuenciación disponible comercialmente, cebadores que son homólogas a cada extremo del transposón, y un sistema de análisis de secuenciación capilar. Alternativamente, el plásmido puede ser enviado a una institución fuera para la secuenciación. </li><li> Utilice el patrón de peso molecular (escalera de 1 kb) enel gel para estimar el tamaño del plásmido. Luego, estimar el número de nanogramos (ng) de plásmido que se requiere para el 50 fmol. </li><li> Medir la concentración del ADN plásmido usando un espectrofotómetro a longitudes de onda de 260 nm (A 260) y 280 nm (A 280). Asegúrese de que la longitud del recorrido de la luz a través de la cubeta es de 1 cm. Determinar la concentración multiplicando la absorbancia a 260 nm por 50 ng / l. ADN plásmido de alta calidad tendrá una A 260 / A 280 ratio de entre 1,8 y 2,0. </li><li> El volumen de ADN requerida para cada reacción de secuenciación es el número de ng requerido para 50 fmol dividida por la concentración del plásmido. Mezclar el volumen del plásmido requerido con el agua para llevar el volumen total hasta 10 l. </li><li> Calentar la mezcla de ADN plásmido / agua a 96 ° C durante 1 min y luego enfriar a RT. </li><li> Añadir 8 l de mezcla maestra del equipo de secuenciación y 2 l de 1,6 M de uno de los cebadores de secuenciación. </li><li> Folbajo el protocolo del kit de secuenciación para el programa de termociclador y la limpieza de reacción. </li><li> Analizar cada muestra usando un sistema de análisis de ADN capilar. </li><li> Use un paquete de software disponible en el mercado para ver la secuencia de ADN. Búsqueda de la secuencia &quot;5&#39;-GAGACAG-3 &#39;,&quot; que es el último 7 pb del transposón (Figura 4). La secuencia antes del extremo 5 &#39;de este segmento 7 pb pertenece al transposón. La secuencia después del extremo 3 &#39;de este segmento 7 pb pertenece al gen interrumpido. </li><li> Determinar la posible función del gen interrumpido con el Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 Básica. Utilice la siguiente link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . Pegue la secuencia de la interrupcióngen ed en el cuadro de búsqueda, seleccione &quot;otros&quot; en virtud de la base de datos y haga clic en &quot;BLAST&quot; en la parte inferior de la página. Cuando el resultado aparece, desplácese hacia abajo la página para ver los resultados de la alineación (Figura 5). </li></ol>

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</ol>

El autor no tiene nada que revelar.

Transposón mutagénesis usando un transposome es una herramienta eficiente para generar auxotrofos en Enterobacter sp. YSU y otros tipos de bacterias Gram negativas y Gram positivas 3,4. El proceso se inició mediante la introducción del Tn 5 transposome -derivado en el huésped por electroporación. Para identificar colonias con insertos, la cepa no transformada objetivo tenía que ser sensibles a la kanamicina para seleccionar para el marcador de resistencia llevado por el transposón. Algunos a...

Prototrophic bacterias crecen en M-9 que contenían medio mínimo de sales glucosa (M-9) medio, la conversión de glucosa a través de vías centrales del metabolismo de carbono para generar precursores, tales como aminoácidos, ácidos nucleicos y vitaminas, para la biosíntesis de 1. M-9 medio contiene cloruro de amonio como fuente de nitrógeno, sodio y fosfato de potasio como un tampón y fuente de fósforo, sulfato de magnesio como una fuente de azufre y glucosa como fuente de carbono y energía. Luria-Bertani (LB) medio es rico en aminoácidos de triptona y en vitaminas y factores de crecimiento a partir de extracto de levadura. Es compatible con el crecimiento de los auxótrofos que no pueden sintetizar aminoácidos, vitaminas y otros factores de crecimiento necesarios para el crecimiento en medio M-9. Por lo tanto, prototrofos crecerán en LB y medio M-9, mientras que auxótrofos crecerán en medio LB, pero no en medio M-9. Mediante la introducción de mutaciones en una población prototrophic de bacterias y la identificación de genes mutados que causan fenotipos auxotróficas, es possible para obtener una mejor comprensión del metabolismo en una cepa bacteriana. Mutagénesis de transposón puede ser usado para identificar muchos de los genes necesarios para el crecimiento en glucosa en medio M-9. Los transposones se insertan aleatoriamente en el genoma huésped 2. Mediante la identificación de transformantes transposón en placas de agar LB y réplica en placas sobre placas de ellos M-9 de agar de medio, es posible para la detección de auxótrofos. Genes interrumpidos se identifican a través de rescate de genes. Este estudio utiliza un comercialmente disponible Tn 5 -derivado transposome que se suministra como una solución de un segmento de ADN transposón lineal mixto con la proteína transposasa. El segmento de ADN carece de un gen de la transposasa, pero contiene un gen de resistencia a la kanamicina, un origen de replicación γ R6K y dos motivos de mosaico que son secuencias de ADN para la transposasa de unión en cada extremo del segmento de 3,4. Dado que la proteína transposasa se añade directamente al ADN, el segmento de ADN solose define como el transposón, y el complejo de proteínas de ADN / transposasa se define como la transposome. El transposome se transformó por electroporación en un 5 kanamicina sensibles host (Figura 1A). Las colonias que crecen en placas de agar LB que contenían kanamicina (LB-kan) tienen inserciones de transposones (Figura 1B), y réplicas de chapado en transformantes que no crecen en M-9 placas de medio de agar que contiene kanamicina (M-9-kan) son auxótrofos (Figire 1C). El ADN genómico de un mutante es purificado y parcialmente digerido con la endonucleasa de restricción de corte 4-base, BFU CI (Figura 1D). El ADN ligado se transformó en una cepa de Escherichia coli (E. coli) que contiene el gen pir (Figura 1E). Este gen permite que el nuevo plásmido que contiene el transposón y región flanqueante cromosómico del huésped para replicarse en E. coli 6. El gen de resistencia a kanamicina sirve como comomarcador elegible para el nuevo plásmido. Por último, la secuenciación usando cebadores complementarios a cada extremo del transposón y Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 análisis de la secuencia resultante se usan para determinar la identidad de los genes interrumpidos. Esta estrategia de mutagénesis transposome ofrece tres ventajas 3. En primer lugar, ya que la proteína transposasa se une directamente a la transposón, la inserción no depende de la expresión del gen transposasa dentro del huésped. Una vez que el transposón se incorpora en el genoma huésped, la transposasa se degrada, impidiendo el movimiento adicional del transposón. Sin embargo, el movimiento adicional que no se puede evitar si el host posee un 5 Tn elemento transposicional endógeno. En segundo lugar, la introducción de la transposome por electroporación hace que sea posible su uso en una amplia variedad de huéspedes. También elimina la necesidad de introducir el transposón por conjugación bacteriana o por viinfección ral. Ambos procesos requieren la susceptibilidad del huésped. En tercer lugar, la inclusión del gen de resistencia a kanamicina y el origen de replicación R6K γ en el transposome hace que sea más fácil identificar el gen interrumpido. Regiones de tipo transposón interrumpida se pueden almacenar y se secuenciaron como plásmidos, lo que elimina la necesidad de utilizar la reacción en cadena inversa de la polimerasa (PCR) para la identificación de genes. El protocolo presentado en este video se describe cada paso por transposón mutagénesis de Enterobacter sp. YSU 9 usando un transposome de su introducción en las células bacterianas a la identificación del gen putativo se interrumpió. Además de los protocolos publicados previamente 3,4,10, se presentan métodos detallados para el uso de réplica en placa para detectar auxotrofos. Esta técnica de mutagénesis puede utilizarse para la investigación de otros fenotipos, tales como antibióticos y resistencias de metal, en diferentes tipos de bacterias, por identifying el número mínimo de genes necesarios para el crecimiento en condiciones de cultivo definidos en los estudios de biología sintética, o para la enseñanza de un componente de laboratorio de una genética o curso de fisiología microbiana.

<table><tbody><tr><td>EZ-Tn5 R6K&gamma; ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>TSM08KR</td><td></td></tr><tr><td>EC100D pir+ Epicentro electrocompetente de E. coli</td><td>(Illumina)</td><td>ECP09500</td><td>Capaz de replicar plásmidos con un origen de replicación R6K&gamma; a un número de copias</td></tr><tr><td>bajo EC100D pir-116 Epicentro electrocompetente de E. coli</td><td>(Illumina)</td><td>EC6P095H</td><td>Capaz de replicar plásmidos con un R6K&gamma; origen de replicación en un número de copia alto</td></tr><tr><td>5X M-9 Sales</td><td>Thermo Fisher</td><td>DF048517</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Broth</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J637-1KG</td><td>Los medios sólidos contenían 1,6% (p/v)</td></tr><tr><td>de sulfato de kanamicina de agar &nbsp;</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0408-25G</td><td>Cuando sea necesario, los medios contenían 50 &mu; g/ml sulfato de kanamicina</td></tr><tr><td>D-glucosa monohidrato</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J850-500G</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J859-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco, Inc.</td><td>X190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Caldo súper óptimo con represión de catabolito (SOC) medio</td><td></td><td></td><td>0,5% (p/v) de extracto de levadura, 2% (p/v) de triptona, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 20 mM MgSO4 y 20 mM de glucosa</td></tr><tr><td>BfuC I</td><td>NEB</td><td>R0636S</td><td>Digestión parcial de ADN genómico</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td>Digestión de plásmidos</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Amresco, Inc.</td><td>E476-1L</td><td>Para la disolución del ADN precipitado y las reacciones de endonucleasa de restricción</td></tr><tr><td>GenomeLab DTCS - Kit de inicio rápido</td><td>Beckman Coulter</td><td>608120</td><td>Secuenciación de ADN</td></tr><tr><td>Wizard Kit de purificación de ADN genómico</td><td>Promega</td><td>A1120A</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps Sistema de purificación de ADN</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>Purificación de plásmidos</td></tr><tr><td>Replica Plating Block</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-1</td><td></td></tr><tr><td>Cuadrados de terciopelo</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-2</td><td>Replica de recubrimiento</td></tr><tr><td>PetriStickers</td><td>Diversified Biotech</td><td>PSTK-1100</td><td>Rejilla para replicación de placas</td></tr><tr><td>de Petri Thermo</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II</td><td>BioRad</td><td></td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>Cubetas de electroporación &ndash; 2 mm</td><td>BioExpress</td><td>E-5010-2</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de vacío de ADN CentriVap</td><td>Labconco</td><td>7970010</td><td>Secado de ADN</td></tr><tr><td>Sistema de análisis de ADN CEQ 2000XL Beckman</td><td>Coulter</td><td></td><td>Secuenciación de ADN</td></tr><tr><td>Vector NTI Advance 11.5.0</td><td>Life Technologies</td><td>12605099</td><td>análisis de secuencias de ADN</td></tr></tbody></table>

generación de enterobacter sp. ysu auxótrofos usando transposón mutagénesis

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacterias crecen en M-9 mínimo de sales suplementado con glucosa (M-9) medio, que se utiliza como fuente de carbono y energía. Auxótrofos se pueden generar utilizando un transposome. El comercialmente disponible, Tn 5 transposome -derivado utilizado en este protocolo consiste en un segmento lineal de ADN que contiene un origen de replicación R6K γ, un gen para resistencia a la kanamicina y dos secuencias de mosaico extremos, que sirven como sitios de unión de transposasa. El transposome, siempre como un complejo de proteínas de ADN / transposasa, se introdujo por electroporación en la cepa prototrófica, Enterobacter sp. YSU, e incorpora al azar en el genoma de este host. Los transformantes son réplica en placas sobre agar Luria-Bertani placas que contenían kanamicina, (LB-kan) y en placas de agar M-9 medio que contiene kanamicina (M-9-kan). Los transformantes que crecen en placas de LB-kan pero no en placas M-9-kan se considera que son auxótrofos. Genómico purificadoADN de un auxótrofo se digiere parcialmente, se ligó y se transformó en un pir + Escherichia coli (E. coli) cepa. El origen de replicación R6Kγ permite que el plásmido se replica en pir + E. cepas de E. coli, y el marcador de resistencia a kanamicina permite la selección del plásmido. Cada transformante posee un nuevo plásmido que contiene el transposón flanqueado por la región cromosómica interrumpido. Secuenciación de Sanger y la Local Alignment Search Tool Básica (BLAST) sugieren una identidad supuesta del gen interrumpido. Hay tres ventajas de utilizar esta estrategia de mutagénesis transposome. En primer lugar, no se basa en la expresión de un gen de transposasa por el anfitrión. En segundo lugar, la transposome se introduce en el host de destino mediante electroporación, en vez de por conjugación o por transducción y por lo tanto es más eficiente. En tercer lugar, el origen de replicación R6Kγ hace que sea fácil de identificar la mutación geno que se recupera parcialmente en un plásmido recombinante. Esta técnica se puede utilizar para investigar los genes implicados en otras características de Enterobacter sp. YSU o de una variedad más amplia de cepas bacterianas.

Transformación de Enterobacter sp. YSU por electroporación con el transposome inició la inserción del genoma al azar en el genoma huésped (Figura 1A, B). Un electroporación éxito produjo varios miles de transformantes que crecieron en placas LB-kan. Para obtener 300-400, colonias por placa bien espaciadas, se ha optimizado la cantidad de transformación mezcla de propagación en cada placa de agar LB-kan. Cada transformante contenía al menos una inserción de transposón, pero no estaba claro si un...

Enterobacter sp. YSU crece en glucosa medio mínimo de sales. Auxótrofos se generan mediante la transformación con un transposome que se inserta aleatoriamente en el genoma huésped. Los mutantes se encuentran por réplica en placas de medio complejo a medio mínimo. Genes interrumpidos se identifican por el rescate y la secuenciación de genes.

Generación de Enterobacter Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

El objetivo general del siguiente experimento es producir TRO de una cepa bacteriana de tipo silvestre que crezca en un medio de sales mínimas suplementado con glucosa. Esto se logra transformando una zona transpo en la cepa huésped de tipo salvaje para obtener una población de bacterias resistentes a la micina de cannabis con transposición aleatoria en los insertos. Los transformantes Next se criban mediante un recubrimiento de réplica, que identifica las TRO que crecen en un medio rico, pero no logran crecer en sales mínimas, medio suplementado con glucosa.A continuación, genómicamente, el ADN del mutante se digiere, se liga y se transforma en e. coli para obtener un plásmido que contenga el transposón flanqueado en cada extremo por segmentos del gen interrumpido. Se obtienen resultados que muestran la identidad putativa del gen interrumpido basándose en la secuenciación del ADN y el análisis de la herramienta básica de búsqueda de alineamiento local. El transposón utilizado en esta técnica tiene un origen de replicación, un gen resistente a la kanamicina y extremos en mosaico.Para la unión de proteínas transpuestas. Carece de gen de proteína transpuesta y, por lo tanto, tenemos que agregar este gen de transposición con el fragmento de ADN del transposón, y luego el complejo entre el ADN del transposón y la proteína se electropora en el huésped. Las principales ventajas de la electroporación son la eliminación de la necesidad de transducción o conjugación.La falta de un gen transpuesto generalmente produce inserciones estables y la presencia de un origen de replicación y un gen de resistencia CIN permiten una fácil identificación del gen mutado, que se recupera como un plásmido recombinante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología microbiana, como la identificación de genes necesarios para la biosíntesis de aminoácidos, ácidos nucleicos y vitaminas. Tuve la idea de este método por primera vez cuando estaba buscando genes de resistencia a metales en especies de enterobacter YSU y decidí incorporarlo a un laboratorio de fisiología microbiana que estaba desarrollando para electroporar células competentes utilizando un cultivo nocturno de especies de enterobacter.YSU prepara una dilución de uno a 20 en medio LB fresco e incuba a 30 grados Celsius y 120 RPM a un OD 600 entre 0.4 y 0.6. Cuando las células hayan alcanzado la densidad adecuada, enfríelas en hielo durante cinco minutos y luego centrifugue a cuatro grados centígrados y 7.000 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y use un volumen igual de agua helada para Resus.Suspender las células centrífugas a cuatro grados centígrados y 7.000 Gs durante cinco minutos. Después de repetir el lavado, deseche el sobrenadante y con agua helada vuelva a suspender las células en un volumen igual al volumen de la célula pellet. A continuación, agregue 0,5 microlitros de la zona transpo a 40 microlitros de celdas.A continuación, coloque la mezcla de la zona de transpo de la celda en un veterinario de electroporación helado y golpee la mezcla hasta el fondo del Q Vet para amortiguar las células a 25 micro phs, 200 ohmios y 2,5 kilovoltios. Agregue inmediatamente 960 microlitros de medio SOC esterilizado con filtro mezclado pipeteando hacia arriba y hacia abajo antes de transferir las células a un tubo de microfuga estéril de 1,5 mililitros. Incubar las células a 30 grados centígrados y 120 RPM durante 45 a 60 minutos.Luego esparce 100 microlitros de células en una placa de agar de lata LB antes de incubar la placa durante la noche a 30 grados Celsius para rechinar los transformantes. Pega una rejilla a la tapa de una placa de Petri vacía de 100 por 15 milímetros. Dibuje una línea en la parte inferior de una placa de agar de lata LB y use un pequeño trozo de cinta adhesiva para anclarla a la tapa rejicular de modo que la rejilla sea visible a través de la barrena con un palillo de dientes estéril.Elija un solo transformador y colóquelo en el centro de un cuadrado en la cuadrícula, localice otro transformador en un cuadrado adyacente y continúe hasta que el plato esté lleno. Luego incubarlo durante la noche a 30 grados centígrados. Esta es la placa maestra para cada placa que se cuadriculó.Haga una pila de tres placas de barrena nuevas numeradas del uno al tres. El número uno para LB puede, el número dos para M nueve. Y el número tres para LB puede secar las placas boca abajo durante la noche a 37 grados centígrados antes de usarlas.Después de dibujar una línea en la parte superior de cada placa como se demostró anteriormente, use etanol al 70% para limpiar la herramienta de recubrimiento de réplica y coloque un cuadrado de veltin estéril encima antes de sujetar el cuadrado de veltin. A continuación, alinee la línea de la placa maestra con una línea dibujada en la abrazadera y coloque la placa encima del cuadrado veltin. Aplique una presión suave para transferir las bacterias de la placa al cuadrado veltin.A continuación, alinea la línea dibujada en la placa número uno con la línea de la abrazadera y colócala encima del cuadrado veltin. Aplique una presión suave para transferir las bacterias del cuadrado veltin al plato. Retire la placa número uno.Deseche el cuadrado adolescente de terciopelo en un vaso de precipitados con agua y coloque un cuadrado de terciopelo estéril limpio en la herramienta de enchapado de réplica. Como antes, alinee la línea en la placa número uno con la línea en la abrazadera y colóquela encima del nuevo cuadrado de terciopelo. Aplique una presión suave para transferir las bacterias de la placa número uno al cuadrado de terciopelo.Retire la placa número uno, alinee la línea dibujada en la placa número dos con una línea en la abrazadera y colóquela encima del cuadrado de terciopelo. Aplique una presión suave para transferir las bacterias del cuadrado de terciopelo al plato número dos, retire el plato número dos después de repetir el proceso para el plato número tres, incube los platos durante la noche a 30 grados centígrados. Las colonias que crecen en ambas placas de lata LB pero no crecen en placas M nueve se consideran tesoros.Elija TRO del plato número uno y escúbralo en un plato de lata LB nuevo. Después de incubar durante la noche, elija tres colonias de la placa de rayas y colóquelas en una placa de lata LB fresca al día siguiente. Localice las colonias de la placa recién rayada en una placa de rejilla de lata LB y use esta placa para repetir la réplica del recubrimiento como se acaba de demostrar.Llevar a cabo el rescate genético. Use una colonia mutante aislada para cultivar una libra de tres mililitros. Puede cultivar durante la noche a 30 grados centígrados.A continuación, utilice un kit de purificación de ADN genómico disponible en el mercado para purificar el ADN de un mililitro de cultivo a 0,025 unidades de BFUC, una endonucleasa de restricción, a 14 microlitros de un microgramo por microlitro de ADN genómico en una reacción de 20 microlitros en hielo. Luego incube la reacción a 37 grados Celsius durante 25 minutos antes de transferirla a 80 grados Celsius durante 20 minutos. Para inactivar la enzima, analice tres microlitros del ADN parcialmente digerido en un gel 0.8% AROS.A continuación, agregue 800 unidades de T 4 ADN ligasa a 15 microlitros de ADN genómico parcialmente digerido en una reacción de 500 microlitros e incube la reacción a cuatro grados centígrados durante la noche del día siguiente. Precipitar el ADN ligado añadiendo 50 microlitros de acetato de sodio de tres molares pH 5,5 y un mililitro de etanol al 95% incubar a 20 grados centígrados negativos durante 20 minutos. Micro fuga del ADN a cuatro grados centígrados y 13.500 Gs durante 10 minutos.Vierta de los lugares supernat, siete 70%etanol para lavar la pellet. Sécalo en un concentrador centrífugo al vacío y utiliza 10 microlitros de agua libre de nucleasas. Para resuspender el ADN: Utilice cuatro microlitros de ADN resuspendido para transformar por electroporación la cepa de E. coli, ECD 100 DPIR o ECD 100 DPIR uno, 16 inocular cinco mililitros de LB lata de medio con una sola colonia.Cultívelo a 37 grados centígrados y 120 RPM durante la noche. Al día siguiente, después de purificar el ADN de todo el cultivo, use Joe one para digerir 14 microlitros del plásmido. Analice 10 microlitros del plásmido no digerido y digerido en un gel de agarro al 0,8%.Después de secuenciar el plásmido, busque la secuencia cinco primos GA, G-A-C-A-G tres primos, que son los últimos siete pares de bases de la transposición y serán seguidos por la secuencia para el gen interrumpido. Utilice el blasto para determinar la posible función del gen interrumpido. Una electroporación exitosa produjo varios miles de transformantes, cada uno con al menos una transposición en el inserto de esta figura.Los cuadrados negros muestran dos colonias que crecieron en la placa de lata LB, pero no en la placa mediana mínima M nine. Estas TRO probablemente contenían interrupciones en los genes involucrados en la síntesis de un aminoácido, un ácido nucleico o una vitamina, que se encuentran todos en lb, pero no en M nine, medio mínimo. Las otras 86 colonias no tuvieron una interrupción en un gen que es necesario para el crecimiento en M nine.Medio mínimo como se ve aquí, el ADN genómico parcialmente digerido de una TRO aislada va desde más de 10 kilobases hasta menos de 0,5 kilobases de tamaño. El plásmido rescatado consiste en el transposón de dos kilobases más el ADN del huésped flanqueante. Esta figura muestra el resultado de una explosión para un plásmido que se aisló de un tro.La secuencia interrumpida es similar a un gen enterobacter cloy para la atemotasa, que está involucrada en la biosíntesis de L tirosina, L fenilalanina y L triptófano debido a múltiples etapas de crecimiento durante la noche. Esta técnica se puede completar en 10 u 11 días si se realiza correctamente. Mientras se hace la réplica de pla, es importante recordar que no se deben manchar las placas, y se puede prevenir utilizando placas secas y no moviendo las placas una vez que se han colocado en el cuadrado veltin.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la clonación o los experimentos de complementación para verificar la función del gen identificado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar TRO utilizando la mutagénesis de transposones y cómo identificar tentativamente los genes mutados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Sistemáticos ya gran escala sintéticos genéticos (gen-gen o epistasis) pantallas de interacción puede ser utilizado para explorar la redundancia genética y la vía de la diafonía. A continuación, se describe un alto rendimiento cuantitativo sintético tecnología de detección genética amplia, denominada eSGA que hemos desarrollado para la aclaración de las relaciones y explorar epistatic interacción en redes...

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Fuente: Kazi, M. I., et. al., Generación de bibliotecas de inserción de transposones en bacterias gramnegativas para secuenciación de alto rendimiento. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra la selección, cuantificación y preservación de bacterias receptoras Gram-negativas portadoras de inserciones de transposones basadas en la resistencia a la kanamicina.

Aislamiento de bacterias gramnegativas con inserciones de transposones genómicos

Aquí se describe un protocolo utilizando el navegante mutagénesis-mini Himar1 transposón mediada para generar una biblioteca de mutantes de inserción de alta densidad de la pantalla, aislar e identificar nuevos reguladores de alginato en el prototípico cepa PAO1 Pseudomonas aeruginosa.

Identificación de nuevos genes asociados con alginato producción en<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Uso de Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; La mutagénesis mediada por transposón Mariner

Coxiella burnetii es una bacteria intracelular gramnegativos obligado responsable de la fiebre Q enfermedad zoonótica. Aquí se describen los métodos para la generación de mutantes de transposón fluorescente Coxiella así como la identificación automatizada y el análisis de la internalización, la replicación y citotóxicos fenotipos resultantes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Aquí, el poder de una inserción al azar de un elemento de DNA no codificante mediada por transposones se utilizó para resolver su posición cromosómica óptima.

Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

Presentado aquí es un método simple para crear una biblioteca de inserción del transposón alta densidad en Escherichia coli o Shigella flexneri mediante Conjugación bacteriana. Este protocolo permite la creación de una colección de cientos de miles de mutantes únicos en bacterias por la inserción genómica al azar de un transposón.

Creación de un denso Transposon inserción biblioteca usando Conjugación bacteriana en cepas enterobacterianas tales como Escherichia Coli o Shigella flexneri

Aquí describimos una técnica que combina la mutagénesis de transposon con secuenciación de alto rendimiento para identificar y cuantificar a mutantes de transposon leptoespiral en tejidos después de un desafío de hámsters. Este protocolo puede utilizarse para mutantes de pantalla para la supervivencia y difusión en los animales y también se puede aplicar a estudios en vitro .

Alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de Leptospira interrogans Transposon inserción mutantes durante oro sirios Hamster infección

Infección por Pseudomonas aeruginosa causa una morbilidad significativa en hosts vulnerables. La biblioteca mutantes de inserción de transposones no redundante de p. aeruginosa cepa PA14, designados como establece PA14NR, facilita el análisis de la funcionalidad del gen en numerosos procesos. Presentamos es un protocolo para generar copias de alta calidad de la biblioteca mutante PA14NR establecido.

Replicación de la ordena, no redundante biblioteca de Pseudomonas aeruginosa cepa PA14 mutantes de inserción de transposones

La hemizigosidad recíproca a través de la secuenciación (RH-seq) es un nuevo y poderoso método para mapear la base genética de una diferencia de rasgos entre especies. Los grupos de hemizygotes son generados por la mutagénesis de la transposon y su estado físico es rastreado a través del crecimiento competitivo usando la secuenciación alta a lo largo de la secuenciación. El análisis de los datos resultantes identifica los genes subyacentes al rasgo.

Mapeo genético de las diferencias de termotolerancia entre especies de levadura Saccharomyces a través del análisis de hemizygosity recíproca en todo el genoma

Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

Aprende a generar mutantes auxótrofos de Enterobacter sp. YSU mediante mutagénesis con transposón. Este método permite identificar genes esenciales para el crecimiento en medio mínimo con glucosa mediante replicaplaca y secuenciación.

Generación de Enterobacter Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis

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