Generación de Enterobacter Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis

El objetivo general del siguiente experimento es producir TRO de una cepa bacteriana de tipo silvestre que crezca en un medio de sales mínimas suplementado con glucosa. Esto se logra transformando una zona transpo en la cepa huésped de tipo salvaje para obtener una población de bacterias resistentes a la micina de cannabis con transposición aleatoria en los insertos. Los transformantes Next se criban mediante un recubrimiento de réplica, que identifica las TRO que crecen en un medio rico, pero no logran crecer en sales mínimas, medio suplementado con glucosa.

A continuación, genómicamente, el ADN del mutante se digiere, se liga y se transforma en e. coli para obtener un plásmido que contenga el transposón flanqueado en cada extremo por segmentos del gen interrumpido. Se obtienen resultados que muestran la identidad putativa del gen interrumpido basándose en la secuenciación del ADN y el análisis de la herramienta básica de búsqueda de alineamiento local. El transposón utilizado en esta técnica tiene un origen de replicación, un gen resistente a la kanamicina y extremos en mosaico.

Para la unión de proteínas transpuestas. Carece de gen de proteína transpuesta y, por lo tanto, tenemos que agregar este gen de transposición con el fragmento de ADN del transposón, y luego el complejo entre el ADN del transposón y la proteína se electropora en el huésped. Las principales ventajas de la electroporación son la eliminación de la necesidad de transducción o conjugación.

La falta de un gen transpuesto generalmente produce inserciones estables y la presencia de un origen de replicación y un gen de resistencia CIN permiten una fácil identificación del gen mutado, que se recupera como un plásmido recombinante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología microbiana, como la identificación de genes necesarios para la biosíntesis de aminoácidos, ácidos nucleicos y vitaminas. Tuve la idea de este método por primera vez cuando estaba buscando genes de resistencia a metales en especies de enterobacter YSU y decidí incorporarlo a un laboratorio de fisiología microbiana que estaba desarrollando para electroporar células competentes utilizando un cultivo nocturno de especies de enterobacter.

YSU prepara una dilución de uno a 20 en medio LB fresco e incuba a 30 grados Celsius y 120 RPM a un OD 600 entre 0.4 y 0.6. Cuando las células hayan alcanzado la densidad adecuada, enfríelas en hielo durante cinco minutos y luego centrifugue a cuatro grados centígrados y 7.000 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y use un volumen igual de agua helada para Resus.

Suspender las células centrífugas a cuatro grados centígrados y 7.000 Gs durante cinco minutos. Después de repetir el lavado, deseche el sobrenadante y con agua helada vuelva a suspender las células en un volumen igual al volumen de la célula pellet. A continuación, agregue 0,5 microlitros de la zona transpo a 40 microlitros de celdas.

A continuación, coloque la mezcla de la zona de transpo de la celda en un veterinario de electroporación helado y golpee la mezcla hasta el fondo del Q Vet para amortiguar las células a 25 micro phs, 200 ohmios y 2,5 kilovoltios. Agregue inmediatamente 960 microlitros de medio SOC esterilizado con filtro mezclado pipeteando hacia arriba y hacia abajo antes de transferir las células a un tubo de microfuga estéril de 1,5 mililitros. Incubar las células a 30 grados centígrados y 120 RPM durante 45 a 60 minutos.

Luego esparce 100 microlitros de células en una placa de agar de lata LB antes de incubar la placa durante la noche a 30 grados Celsius para rechinar los transformantes. Pega una rejilla a la tapa de una placa de Petri vacía de 100 por 15 milímetros. Dibuje una línea en la parte inferior de una placa de agar de lata LB y use un pequeño trozo de cinta adhesiva para anclarla a la tapa rejicular de modo que la rejilla sea visible a través de la barrena con un palillo de dientes estéril.

Elija un solo transformador y colóquelo en el centro de un cuadrado en la cuadrícula, localice otro transformador en un cuadrado adyacente y continúe hasta que el plato esté lleno. Luego incubarlo durante la noche a 30 grados centígrados. Esta es la placa maestra para cada placa que se cuadriculó.

Haga una pila de tres placas de barrena nuevas numeradas del uno al tres. El número uno para LB puede, el número dos para M nueve. Y el número tres para LB puede secar las placas boca abajo durante la noche a 37 grados centígrados antes de usarlas.

Después de dibujar una línea en la parte superior de cada placa como se demostró anteriormente, use etanol al 70% para limpiar la herramienta de recubrimiento de réplica y coloque un cuadrado de veltin estéril encima antes de sujetar el cuadrado de veltin. A continuación, alinee la línea de la placa maestra con una línea dibujada en la abrazadera y coloque la placa encima del cuadrado veltin. Aplique una presión suave para transferir las bacterias de la placa al cuadrado veltin.

A continuación, alinea la línea dibujada en la placa número uno con la línea de la abrazadera y colócala encima del cuadrado veltin. Aplique una presión suave para transferir las bacterias del cuadrado veltin al plato. Retire la placa número uno.

Deseche el cuadrado adolescente de terciopelo en un vaso de precipitados con agua y coloque un cuadrado de terciopelo estéril limpio en la herramienta de enchapado de réplica. Como antes, alinee la línea en la placa número uno con la línea en la abrazadera y colóquela encima del nuevo cuadrado de terciopelo. Aplique una presión suave para transferir las bacterias de la placa número uno al cuadrado de terciopelo.

Retire la placa número uno, alinee la línea dibujada en la placa número dos con una línea en la abrazadera y colóquela encima del cuadrado de terciopelo. Aplique una presión suave para transferir las bacterias del cuadrado de terciopelo al plato número dos, retire el plato número dos después de repetir el proceso para el plato número tres, incube los platos durante la noche a 30 grados centígrados. Las colonias que crecen en ambas placas de lata LB pero no crecen en placas M nueve se consideran tesoros.

Elija TRO del plato número uno y escúbralo en un plato de lata LB nuevo. Después de incubar durante la noche, elija tres colonias de la placa de rayas y colóquelas en una placa de lata LB fresca al día siguiente. Localice las colonias de la placa recién rayada en una placa de rejilla de lata LB y use esta placa para repetir la réplica del recubrimiento como se acaba de demostrar.

Llevar a cabo el rescate genético. Use una colonia mutante aislada para cultivar una libra de tres mililitros. Puede cultivar durante la noche a 30 grados centígrados.

A continuación, utilice un kit de purificación de ADN genómico disponible en el mercado para purificar el ADN de un mililitro de cultivo a 0,025 unidades de BFUC, una endonucleasa de restricción, a 14 microlitros de un microgramo por microlitro de ADN genómico en una reacción de 20 microlitros en hielo. Luego incube la reacción a 37 grados Celsius durante 25 minutos antes de transferirla a 80 grados Celsius durante 20 minutos. Para inactivar la enzima, analice tres microlitros del ADN parcialmente digerido en un gel 0.8% AROS.

A continuación, agregue 800 unidades de T 4 ADN ligasa a 15 microlitros de ADN genómico parcialmente digerido en una reacción de 500 microlitros e incube la reacción a cuatro grados centígrados durante la noche del día siguiente. Precipitar el ADN ligado añadiendo 50 microlitros de acetato de sodio de tres molares pH 5,5 y un mililitro de etanol al 95% incubar a 20 grados centígrados negativos durante 20 minutos. Micro fuga del ADN a cuatro grados centígrados y 13.500 Gs durante 10 minutos.

Vierta de los lugares supernat, siete 70%etanol para lavar la pellet. Sécalo en un concentrador centrífugo al vacío y utiliza 10 microlitros de agua libre de nucleasas. Para resuspender el ADN: Utilice cuatro microlitros de ADN resuspendido para transformar por electroporación la cepa de E. coli, ECD 100 DPIR o ECD 100 DPIR uno, 16 inocular cinco mililitros de LB lata de medio con una sola colonia.

Cultívelo a 37 grados centígrados y 120 RPM durante la noche. Al día siguiente, después de purificar el ADN de todo el cultivo, use Joe one para digerir 14 microlitros del plásmido. Analice 10 microlitros del plásmido no digerido y digerido en un gel de agarro al 0,8%.

Después de secuenciar el plásmido, busque la secuencia cinco primos GA, G-A-C-A-G tres primos, que son los últimos siete pares de bases de la transposición y serán seguidos por la secuencia para el gen interrumpido. Utilice el blasto para determinar la posible función del gen interrumpido. Una electroporación exitosa produjo varios miles de transformantes, cada uno con al menos una transposición en el inserto de esta figura.

Los cuadrados negros muestran dos colonias que crecieron en la placa de lata LB, pero no en la placa mediana mínima M nine. Estas TRO probablemente contenían interrupciones en los genes involucrados en la síntesis de un aminoácido, un ácido nucleico o una vitamina, que se encuentran todos en lb, pero no en M nine, medio mínimo. Las otras 86 colonias no tuvieron una interrupción en un gen que es necesario para el crecimiento en M nine.

Medio mínimo como se ve aquí, el ADN genómico parcialmente digerido de una TRO aislada va desde más de 10 kilobases hasta menos de 0,5 kilobases de tamaño. El plásmido rescatado consiste en el transposón de dos kilobases más el ADN del huésped flanqueante. Esta figura muestra el resultado de una explosión para un plásmido que se aisló de un tro.

La secuencia interrumpida es similar a un gen enterobacter cloy para la atemotasa, que está involucrada en la biosíntesis de L tirosina, L fenilalanina y L triptófano debido a múltiples etapas de crecimiento durante la noche. Esta técnica se puede completar en 10 u 11 días si se realiza correctamente. Mientras se hace la réplica de pla, es importante recordar que no se deben manchar las placas, y se puede prevenir utilizando placas secas y no moviendo las placas una vez que se han colocado en el cuadrado veltin.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la clonación o los experimentos de complementación para verificar la función del gen identificado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar TRO utilizando la mutagénesis de transposones y cómo identificar tentativamente los genes mutados.