Name: En tiempo real Ensayos de citotoxicidad en sangre entera humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprende a medir la citotoxicidad de células cancerosas en sangre entera humana con resolución de célula única. Este método utiliza matrices celulares, anticuerpos anti-CD20 y microscopía de fluorescencia para evaluar eficacia de fármacos.

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Agradecemos programa IMAT Instituto Nacional del Cáncer del NIH para la financiación de este trabajo [R33 CA174616-01A1].

1. Preparación de la célula de destino <ol><li> Mantener (por ejemplo, células de linfoma. Raji) células diana en medio de crecimiento (RPMI 1640 medio de cultivo, con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (FBS), L-glutamina 4 nM, y 500 IU / ml de penicilina / estreptomicina) a 37 ° C en un incubador de CO2 al 5%. </li><li> Centrifugar la muestra para sedimentar las células diana en un tubo de 15 ml. Tiempo de centrifugación varía con los diferentes tipos de células; centrifugar durante 3 minutos a 468 xg para las células Raji. </li><li> Primera aspirar las burbujas formadas en la superficie del sobrenadante, y extraer todo el sobrenadante. </li><li> Añadir 10 ml de PBS al tubo. Vuelva a suspender las células pipeteando la solución hacia arriba y abajo varias veces para romper el grupo de células. </li><li> Centrifugar la muestra durante 3 min a 468 x g. </li><li> Aspirar las burbujas formadas en la superficie del sobrenadante, y extraer todo el sobrenadante. </li></ol> 2. Preparación de células microarrays <ol><li> Ola unión de células btain 96 kits de placa así o diapositivas individuales conjunto de células 8 cámara así (véase la tabla de materiales / reactivos). </li><li> Aplicar 1,2 l de la Activador al reactivo de ADN del kit. Tapar el frasco, invertirlo, y agitar suavemente para mezclar la solución. </li><li> Deje que la solución para reaccionar durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Aplicar la solución mixta al sedimento de células diana (en el tubo de 15 ml). </li><li> Añadir colorantes verdes citosólicas de fluorescencia a una concentración final de 500 nM. </li><li> Se incuban las células diana con la solución mezclada y el colorante durante 30 min a TA en un agitador orbital. </li><li> Lavar las células dos veces con 5 ml de PBS, y resuspender las células en 10 ml de medios de crecimiento. </li><li> Aplicar 100 l de la solución de la etapa 2.7 a cada pocillo. Contar el número de células utilizando un hemocitómetro. Hacer seguro que el número de células oscilan entre 5 × 10 4 a 1 x 10 6 células por pocillo. </li><li> Después de 10-15 minutos de incubación a temperatura ambiente, lavar suavemente las muestras dos veces con 200-300 medios de crecimiento mu l para eliminar cualquier célula no unidas. NOTA: Alrededor de 5-10 l medio de crecimiento permanece en cada pocillo después del lavado. </li></ol> 3. Sangre Total Ensayos de citotoxicidad <ol><li> Añadir 180 l de sangre entera humana a cada pocillo de muestra. </li><li> Obtener solución de anticuerpo anti-CD20 a 5 mg / ml, y llevar a cabo una dilución en serie para hacer 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 mg / ml de solución de anticuerpo anti-CD20 en tubos de 1,5 ml. Añadir 20 l de cada concentración de anticuerpo anti-CD20 a cada pocillo de muestra haciendo triplicado. </li><li> Añadir yoduro de propidio a una concentración final de 500 nM a cada pocillo. </li><li> Incubar la placa resultante a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 16 horas. </li><li> Imagen de las células en las diapositivas o placas de 96 pocillos con un sistema de imagen automática con magnificación de 8X. </li><li> Utilice el programa de conteo de células del sistema de imagen automática para cuantificar los resultados. NOTA: El software del sistema de imagen automática ofrece sencillapaso a paso las operaciones para el recuento celular. El protocolo de uso de este software se puede encontrar en el sitio web del proveedor. </li><li> Seleccione [Revisión de los resultados] en la página principal del software. </li><li> Seleccione [el archivo guardado para las muestras]. </li><li> Primera puerta FITC intensidad media&gt; 50, entonces la puerta TxRed intensidad media&gt; 20. </li><li> Seleccione [Información general Plate]. </li><li> Seleccione [Tablas de exportación]. NOTA: La fórmula muerte celular porcentaje del programa se muestra a continuación: Asesinato% célula diana = (# de células teñidas tanto verde y rojo / # de células teñidas en verde) * 100% </li></ol>

<ol><li>Hutchinson, L., Kirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+drug+attrition+rates--where+are+we+going+wrong%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">High drug attrition rates--where are we going wrong.</a> Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).</li>
<li>Moreno, L., Pearson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attrition+rates+be+reduced+in+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Informa+healthcare%22%5BJournal%5D)">Attrition rates be reduced in cancer drug discovery.</a> Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).</li>
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<li>Suntharalingam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+storm+in+a+phase+1+trial+of+the+anti-CD28+monoclonal+antibody+TGN1412%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412.</a> N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).</li>
<li>Eastwood, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+TGN1412+trial+failure+explained+by+species+differences+in+CD28+expression+on+CD4%2B+effector+memory+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells.</a> Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).</li>
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<li>Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+of+the+lytic+action+of+immune+lymphoid+cells+on+51-Cr-labelled+allogeneic+target+cells+in+vitro%3B+inhibition+by+isoantibody+and+by+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs.</a> Immunology. 14, 181-196 (1968).</li>
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<li>Toriello, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microfluidic+bioprocessor+for+single-cell+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).</li>
<li>Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-barcode+directed+capture+and+electrochemical+metabolic+analysis+of+single+mammalian+cells+on+a+microelectrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array.</a> Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).</li>
<li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+trends+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Novel trends in high-throughput screening.</a> Current opinion in pharmacology. 9, 580(2009).</li>
<li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).</li>
<li>Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+for+high-content+screening+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis for high-content screening and analysis.</a> J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).</li>
<li>Sundberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+ultra-high-throughput+screening%3A+solution-+and+cell-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 47(2000).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine+is+more+than+genomic+medicine%3A+confusion+over+terminology+impedes+progress+towards+personalized+healthcare%5BTitle%5D)+AND+%22PERS+MED%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare.</a> PERS MED. 9, 85(2012).</li>
</ol>

Autores no tienen intereses financieros en competencia.

WCA es una crítica en herramienta de detección anti-cáncer vitro con células sola resolución 12/16, idealmente utilizado después de exámenes objetivos tradicionales, como los CDC y ensayos de ADCC 11.09, y antes de los ensayos con animales preclínicos. Actualmente, los ensayos de cribado diana primaria tales como CDC o ensayos de ADCC se llevan a cabo todos en un medio simplificados o un sistema tampón. Sin embargo, los fármacos candidatos que muestran eficacia en estos sistema ta...

Los avances recientes en la industria farmacéutica han llevado a un mayor interés en la realización de las identificaciones específicas de anticuerpos de células tumorales y los tratamientos de cáncer personalizadas; sin embargo, varios obstáculos se encuentran en el proceso. Sólo el 5% de los agentes que tienen actividad contra el cáncer en fase de desarrollo preclínico tienen licencia después de mostrar eficacia suficiente en fase de prueba II-III 1,2. Las estrategias preclínicos (tanto in vitro como in vivo) son subóptimas como muchos ejemplos han demostrado que los fármacos antitumorales comportan de manera diferente en humanos y en animales de laboratorio, principalmente debido a sus diferentes componentes de la sangre 3-5. Para hacer frente a la necesidad de una plataforma de cribado de fármacos antitumorales y para proporcionar un punto de control antes de los experimentos costosa animales y ensayos clínicos, se propone un ensayo de citotoxicidad de sangre entera humana (WCA) para evaluar la eficacia del fármaco antitumoral en un entorno biológico más relevante. Laensayo de citotoxicidad de sangre entera se puede utilizar para evaluar la respuesta de las células individuales a los anticuerpos y otros candidatos a fármacos en sangre completa humana. El WCA es desarrollado por la incorporación de la tecnología de alto rendimiento de posicionamiento celular con alto rendimiento y alto contenido de imágenes 6. Mediante la utilización de un sistema de imagen automático, el número de ambas células vivas y muertas se puede determinar con un alto grado de precisión. Debido al hecho de que las células diana se inmovilizan en el mismo plano focal, WCA es capaz de proporcionar análisis de citotoxicidad cuantitativa en tiempo real sin la eliminación de las células rojas de la sangre. Por otra parte, el sistema de imagen automática ofrece varias ventajas, tales como que sólo las células diana que han alcanzado los criterios especificados (por ejemplo., Células marcadas con fluorescencia, y la morfología celular) están cerradas y procesados. Además, permite la producción de 144 placas por día. En consecuencia, esta capacidad de imagen y rendimiento permite correr de alta contenido y experimentos de alto rendimiento al mismo tiempo. Mediante la combinación de WCA y el sistema de formación de imágenes automatizado, de alto rendimiento análisis de la citotoxicidad de células cuantitativa puede lograrse en un entorno más biológica relevante.

<table><tbody><tr><td>Accesorio de celda Kits de placas de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Adheren</td><td>AP9601</td><td></td></tr><tr><td>Suspensión Matriz de celda única Corredera de cámara de 8 pocillos</td><td>Adheren</td><td>SS0801</td><td></td></tr><tr><td>Adherente Matriz de celda única Portaobjetos de 8 pocillos</td><td>Adheren</td><td>SS0802</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular de linfoma CD20 +</td> <td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Células Raji</td></tr><tr><td>Línea celular de linfoma CD20-ATCC</td><td></td> <td>CRL-8083</td><td>MC/CAR</td></tr><tr><td>RPMI 1640 con L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo</td><td>SH30070.01HI</td><td></td></tr><tr><td>Peni/Estreptococo</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Colorante citosólico</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>Cell Tracker Green</td></tr><tr><td>Rituxan (Biosimilar)&nbsp;</td><td>Eureka Therapeutics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sangre entera humana</td><td>Allcells</td><td>WB001</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Sistema automático de imágenes</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>Contactar Proveedor</td><td>Cell Reporter</td></tr><tr><td>Programa de recuento celular</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>Contactar Proveedor</td><td>Cell Reporter</td></tr></tbody></table>

en tiempo real ensayos de citotoxicidad en sangre entera humana

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A sangre entera citotoxicidad ensayo basado en células en vivo (WCA) que permite el acceso a la información temporal de la citotoxicidad de las células en general se desarrolla con alto rendimiento de la tecnología de posicionamiento celular. Las poblaciones de células tumorales están dirigidas en primer lugar a la inmovilización preprogramados en un formato de matriz, y se marcaron con tintes verdes citosólicas fluorescentes. Después de la formación de conjunto de células, se añaden fármacos de anticuerpos en combinación con sangre humana entera. A continuación se añade yoduro de propidio (PI) para evaluar la muerte celular. El conjunto de células se analizaron con un sistema de imagen automático. Mientras tinte citosólica etiquetas de las poblaciones de células tumorales específicas, PI etiquetas de las poblaciones de células tumorales muertas. Por lo tanto, el porcentaje de muerte de células cancerosas diana se puede cuantificar mediante el cálculo del número de células supervivientes dirigidas al número de células diana muertas. Con este método, los investigadores son capaces de acceder dependiente del tiempo y la información de la citotoxicidad celular dependiente de la dosis. Sorprendentemente, ni radio peligrososse utilizan productos químicos. El WCA que aquí se presenta ha sido probado con el linfoma, la leucemia, y las líneas celulares de tumores sólidos. Por lo tanto, WCA permite a los investigadores para evaluar la eficacia del fármaco en una condición muy relevante ex vivo.

Anti-CD20 anticuerpos y células de linfoma (células Raji y MC / CAR) fueron elegidos como un sistema modelo para demostrar el ensayo de citotoxicidad de sangre (WCA) 7,8. Células Raji tenido alto número de copias de CD20 en la superficie celular, mientras que las células MC / CAR tenían bajo número de copias de CD20 en su membrana. Células diana se tiñeron primero verde con tintes verdes citosólicas fluorescencia y dispuestos en la placa de 96 pocillos. 10000 - 50000 células de linfoma diana se inmovilizan en...

El ensayo de citotoxicidad de sangre entera (WCA) es un ensayo de citotoxicidad desarrollado mediante la incorporación de alto rendimiento de la tecnología de posicionamiento celular con microscopía de fluorescencia y de procesamiento de imágenes automatizado. Aquí se describe cómo las células de linfoma tratados con un anticuerpo anti-CD20 se pueden analizar en tiempo real en toda la sangre humana para proporcionar un análisis de citotoxicidad celular cuantitativa.

En tiempo real Ensayos de citotoxicidad en sangre entera humana

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

El objetivo de este procedimiento es medir la citotoxicidad de las células cancerosas diana en la sangre entera humana con resolución de una sola célula. En primer lugar, se genera una matriz de células cancerosas objetivo. Se añade sangre entera humana al conjunto de células y se aplican fármacos como los anticuerpos. A continuación, las células se incuban con un colorante de viabilidad celular, como propidio, yoduro, y se utilizan imágenes de alto rendimiento para medir el número de células cancerosas diana muertas teñidas de rojo, lo que en última instancia proporciona eficacia en la citotoxicidad del fármaco.La principal ventaja de esta tecnología sobre el método existente, como el ensayo de LDH y cromo, es que la destrucción de células cancerosas se puede realizar en sangre completa humana con capacidad de imagen. Este método puede evaluar la citotoxicidad de los anticuerpos in vitro antes del estudio en animales Comience por la obtención de la unión celular 96. Kits de placas de pocillos o portaobjetos de cámara de ocho pocillos de tasa de celda única, aquí, se utilizará la placa de 96 pocillos.Aplique 1,2 microlitros del activador en el tubo que contiene el reactivo de ADN d

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El ensayo de liberación de cromo, un ensayo común para la detección de la actividad de células T citotóxicas, tiene varias limitaciones. El uso de células T CD8 específicas de antígeno y la línea tumoral de cáncer de mama humano, SKBR3, en el presente artículo, un enfoque basado en impedancia se examinó por la capacidad de detección de muerte celular.

La determinación óptima de la actividad citotóxica de las células T específicas Her2Neu CD8 Humanos comparando el Ensayo de liberación de Cr51 al Sistema xCELLigence

Este video muestra un método para monitorear la actividad de las células CAR-T contra células cancerosas a través de mediciones de impedancia eléctrica en tiempo real. El seguimiento de los cambios en la impedancia evalúa la eficacia de las células CAR-T en la inducción de la citólisis de las células cancerosas, proporcionando información sobre sus capacidades citotóxicas.

Un ensayo de citólisis in vitro en tiempo real para evaluar la potencia de las células CAR-T

Se describe una sola célula de alto rendimiento de ensayo para medir la citotoxicidad de las células T cuando se incuba con las células diana tumorales. Este método emplea una matriz densa, elastómero de sub-nanolitros pozos (~ 100.000 pozos / matriz) para confinar espacialmente las células T y las células diana en proporciones definidas, y está acoplado a la microscopía de fluorescencia para monitorizar efector-diana conjugación y posterior apoptosis.

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Este protocolo describe un ensayo de citotoxicidad sensible basado en células. Al enumerar la disminución de la frecuencia de linfocitos T CD4+ diana vivos en presencia de un número cada vez mayor de linfocitos T CD8+ efectores, este ensayo permite la evaluación directa de la actividad citolítica de los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno.

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Este trabajo describe un flujo de trabajo avanzado para la determinación precisa y rápida del recuento de células NK (Natural Killer) y la citotoxicidad de las células NK en muestras de sangre humana.

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Describimos un sistema de ensayo cuantitativo de citolisis in vitro en tiempo real para evaluar la potencia de las células T del receptor de antígeno quimérico dirigidas a células tumorales líquidas y sólidas. Este protocolo se puede ampliar para evaluar otras células efector inmune, así como tratamientos combinados.

Un ensayo de potencia en tiempo real para células T receptores de antígeno quimérico dirigido a células cancerosas sólidas y hematológicas

El protocolo describe un ensayo rápido, de alto rendimiento, confiable, económico e imparcial para determinar eficientemente la viabilidad celular. Este ensayo es particularmente útil cuando las mitocondrias de las células han sido dañadas, lo que interfiere con otros ensayos. El ensayo utiliza el conteo automatizado de células manchadas con dos tintes nucleares: Hoechst 33342 y yoduro de propidium.

Un ensayo automatizado de tinción nuclear diferencial para la determinación precisa de la citotoxicidad mitoca

Los inmunoensayos basados en sangre total proporcionan una herramienta fácil y eficiente en recursos para analizar la inmunidad específica del antígeno con fines de diagnóstico e investigación. Este artículo proporciona un protocolo optimizado basado en sangre total con coestimulación dual para un análisis exhaustivo de la inmunidad del huésped a patógenos fúngicos y virales, incluida una versión de bajo volumen para pacientes pediátricos y animales pequeños.

Ensayo de sangre total con coestimulación dual para el análisis específico de antígenos de la inmunidad del huésped a patógenos fúngicos y virales

Aquí, describimos un método para crear gotas de doble emulsión que encapsulan una célula T y una célula diana cancerosa para examinar la muerte celular a nivel de una sola célula. Este método permite la cuantificación dual de las moléculas citotóxicas y la apoptosis de las células diana dentro de una gran población de células T.

Ensayo de citotoxicidad basado en gotas para evaluar las células T receptoras de antígenos quiméricos a nivel de una sola célula

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo estandarizado in vitro. para la medición consistente de la citotoxicidad natural, mediada por receptores de antígenos quiméricos y dependiente de anticuerpos en células humanas natural killer mediante imagen de células vivas y citometría de flujo.

Cuantificación de la citotoxicidad de células NK potenciada por receptores de antígenos quiméricos y anticuerpos terapéuticos mediante imagen de células vivas y citometría de flujo

Aprende a medir la citotoxicidad de células cancerosas en sangre entera humana con resolución de célula única. Este método utiliza matrices celulares, anticuerpos anti-CD20 y microscopía de fluorescencia para evaluar eficacia de fármacos.

En tiempo real Ensayos de citotoxicidad en sangre entera humana

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