Name: Medición Espacial y Temporal Ca 2 + Las señales en plantas de Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprende a medir señales de calcio espaciales y temporales en Arabidopsis usando indicadores genéticamente codificados. Este método sensible permite visualizar respuestas celulares y de planta completa al estrés abiótico.

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Estamos agradecidos a B. Stevenson por su asistencia técnica y al Dr. Marc R. Knight por proporcionar la línea transgénica Aequorin. Este trabajo fue financiado por la subvención R01 de los Institutos Nacionales de Salud GM059138.

1. Aequorina Based Ca 2 + Imaging Uso del sistema FAS <ol><li> Preparar plántulas para imágenes de luminiscencia. Esterilizar semillas de plantas de Arabidopsis que expresan Aequorina con una solución de lejía al 10% que contiene 0,01% de Triton-100. Siembre las semillas estériles en un plato cuadrado (10 x 10 cm cuadrados caja de Petri con rejilla,) que contiene toda su fuerza MS (Murashige y Skoog Basal Sal Mezcla), 1% de sacarosa y 1,2% de agar. Colocar las placas verticalmente en una cámara de crecimiento después de la estratificación a 4 ° C durante 2 días (Figura 1A). </li><li> Transferir las plántulas sobre una película. Colocar una película adhesiva (Figura 1B) en la parte superior de 7-10 días de edad plántulas que crecen en la placa. Empuje suavemente la película con la mano para asegurarse de que las plántulas se adhieren a la película (Figura 1C). Pelar la película con cuidado para que las plántulas permanecen adheridos a la película (Figura 1D y 1E) </li><li> Se incuban las plántulas con cofactor. Colocar la unaplántulas dhered sobre la placa cuadrada (10 x 10 cm) que contiene 15 ml de 2 mg / ml h-CTZ (coelenterazina) en agua. Incubar las plantas de semillero a temperatura ambiente durante 4 horas a toda la noche (Figura 1F). </li><li> Preparar para la imagen de luminiscencia. Tome la película fuera de la solución h-CTZ y cortar por la mitad, formando dos piezas. Coloque cada pieza de película con plántulas cara arriba en dos placas diferentes. Deje las placas en la oscuridad durante 5 min. </li><li> Adquirir imágenes de luminiscencia. En la oscuridad, colocar las dos placas junto a la otra en la etapa del sistema de imágenes de luminiscencia (Figura 1G). Adquirir imágenes inmediatamente después de la adición de 20 ml de solución de estímulos a las placas de forma simultánea. </li><li> Analizar imágenes de luminiscencia. Elija el mismo rango de visualización para todas las imágenes de luminiscencia. Recortar la región de interés (ROI) y generar las imágenes como archivos JPEG (Figura 2A). Alternativamente, exportar las imágenes como archivos de formato SPE e importarlos en elImageJ software de análisis de imagen. Medidas de ajuste para el cálculo del valor medio gris del ROI. Seleccione el mismo tamaño del área de retorno de la inversión y medir los datos de grises y presentes medios como gráficos de barras (Figura 2B). </li></ol> 2. vivo Cell Confocal Ca 2 + Imaging <ol><li> Preparar plántulas para la imagen confocal. Esterilizar semillas de plantas de Arabidopsis que expresan case12 con una solución de lejía al 10% que contiene 0,01% de Triton. Siembre las semillas estériles en una placa que contiene la fuerza completa sales MS, sacarosa al 1%, y 1,2% de agar. Coloque las placas verticalmente en una cámara de crecimiento después de la estratificación a 4 ° C durante 2 días. </li><li> Cámaras de imagen de instalación <ol><li> Montar una cámara de imágenes usando un portaobjetos y cubreobjetos (Sala A). Coloque un trozo de lana de algodón empapado de agua en el medio de la corredera. A continuación, traslado de uno o dos 5 días plántulas de la placa en la parte superior del agua empapada lana de algodón. Se adhieren pequeños trozos de arcilla a cada esquina de un cubreobjetos, unad lugar cubreobjetos en la parte superior de las plantas de semillero para crear un espacio (cámara) entre el cubreobjetos y portaobjetos (Figura 3A, panel izquierdo). Conectar un extremo del tubo de polietileno (0,58 mm de diámetro) a una jeringa de 1 ml y colocar el otro extremo del tubo inmediatamente adyacente a la cámara. Sostenga el tubo en su lugar con cinta (Figura 3A, panel derecho). </li><li> Montar una cámara de imágenes utilizando una cámara de plexiglás (Sala B). <ol><li> Extender una capa fina de grasa de silicona alrededor de dos tubos de polietileno (0,58 mm de diámetro) y presione los tubos revestidos en los canales a cada lado de la cámara de plexiglass (Figura 3B panel de la izquierda). Extender una capa fina de grasa de silicona sobre la superficie de la cámara que contiene las ranuras del tubo y presione un cubreobjetos en la grasa para sellar un lado de la abertura de la cámara (cortadas). </li><li> Transferir una antigua planta de semillero cinco días a partir de la placa en la cámara y coloque un trozo de algodón empapado con agua en la parte superior of la plántula. Extienda la grasa de silicona sobre la otra superficie de la cámara, y presione otro cubreobjetos en la parte superior para sellar. Conectar el extremo de uno de los tubos a una jeringa de 1 ml. Deje el extremo del otro tubo (panel de la derecha Figura 3B) abierta. </li></ol></li><li> Preparar una cámara de imágenes utilizando una cubierta de vidrio cámaras (Cámara C). Esterilizar el cristal de la cubierta de cámaras con etanol al 70% y se deja en el capó hasta que se seque. Añadir 0,6 ml o 0,2 ml de fuerza completa medio MS que contenía 1% de sacarosa y 0,5% de fitagel en cada pocillo de una cámara de 2 pocillos o una cámara de 8 pocillos (panel de la derecha Figura 3C), respectivamente. Esterilizar semillas y sembrar las semillas directamente en una cubierta de vidrio cámaras que contiene una fina capa de gel transparente y dejarlos crecer verticalmente durante 5 días (Figura 3C). </li></ol></li><li> Adquirir imágenes utilizando un microscopio confocal. Para aplicar estímulos de estrés, como la sal, el frío o peróxido, inyectar lentamente alrededor de 200 l de NaCl 150 mM, hielo-cold agua o 1 mM H 2 O 2 solución en la cámara (Cámara A o B) justo antes de la adquisición de imágenes, o agregar suavemente 500 l o 100 l de solución de estímulo para el pozo de una cámara de 2 o de 8 pocillos, respectivamente . Capturar imágenes inmediatamente después de aplicar la solución de estímulo utilizando un microscopio confocal Nikon A1R de escaneo láser invertida con un lente de inmersión en agua 20X (apertura numérica 0,75). Reúne una serie temporal de imágenes a intervalos de 4 segundos con longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 500-550 nm, respectivamente, y con una resolución de píxel de 512 x 512. </li><li> Análisis de Imagen Usando Nikon Elements, ROIs fueron elaboradas alrededor de cada celda (o área) de interés. Intensidad total dentro de cada ROI se mide en el tiempo utilizando el cuadro de diálogo Medición del tiempo (ImageJ se podría utilizar en su lugar). Mediciones totales de intensidad fueron exportados y tratados en Datagraph. Ca 2 + amplitud pico se define como la intensidad máxima de menos intensidad de descanso, la duración como ªtiempo e entre el inicio y la finalización de un pico, y el período como el intervalo de tiempo entre los picos pico adyacentes de dos picos. t-test fue utilizado para comparar las medias. </li></ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+the+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: the lead currency of plant information processing.</a> Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+screening+Arabidopsis+mutants+with+disordered+abiotic+stress-induced+calcium+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal.</a> J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+calcium+signalling+pathways+regulate+calmodulin+gene+expression+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco.</a> Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).</li>
<li>Johnson, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillations+of+cytosolic+and+chloroplastic+free+calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants.</a> Science. 269 (5232), 489-503 (1995).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signature+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation.</a> Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).</li>
<li>Logan, D. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+cytosolic+calcium+dynamics+are+differentially+regulated+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants.</a> Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).</li>
<li>Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+calcium+responses+to+drought%2C+salt+and+cold+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root.</a> Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Souslova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+fluorescent+protein-based+Ca2%2B+sensors+with+increased+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range.</a> BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).</li>
<li>Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nucleotides+elicit+cytosolic+free+calcium+oscillations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).</li>
<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+the+cytoplasmic+Ca2%2B+concentration+is+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).</li>
<li>Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear-targeted+Cameleon+demonstrates+intranuclear+Ca2%2B+spiking+in+Medicago+truncatula+root+hairs+in+response+to+rhizobial+nodulation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).</li>
<li>Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Cameleons+to+different+subcellular+compartments+reveals+a+strict+cytoplasmic%2Fmitochondrial+Ca2%2B+handling+relationship+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells.</a> Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics.</a> Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+accumulation+and+dynamics+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Arabidopsis+root+cells+using+a+genetically+encoded+Cameleon+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor.</a> Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+in+plant+peroxisomes%3A+An+in+vivo+analysis+uncovers+a+Ca2%2B+dependent+scavenging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system.</a> Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).</li>
<li>Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+in+innate+immunity-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death.</a> EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos demostrado un sistema FAS para el registro de la espacio-temporal Ca 2 + respuesta de plántulas de Arabidopsis. Este sistema de grabación FAS 2 + Ca proporciona un enfoque sencillo, sensible y robusto que se podría adaptar para medir la dinámica de Ca 2 + desencadenadas por diversos estímulos, además de los estímulos de estrés abióticos que se presentan aquí. El uso de este sistema, podemos comparar fácilmente tejido o específicos estímulos espaciales-temporales de Ca <s...

La célula de la planta responde al medio ambiente a través de señalización que coordina las acciones celulares. Un evento de señalización temprana de la célula en respuesta a estímulos del medio ambiente es un aumento transitorio de Ca 2 +. El patrón, o la firma de un aumento transitorio en la concentración de Ca2 + libre se caracteriza por su amplitud, frecuencia, y duración. Firmas Ca 2 + espacio-temporales diferentes regulan diferentes actividades celulares 1. Estímulos específicos, como el calor, el frío, la sal, la sequía, la luz o las hormonas vegetales, pueden afinar la actividad espacio-temporal de Ca 2 + canales de membrana localizada y / o transportistas, lo que resulta en específicos de Ca 2 + firmas. Aunque Ca 2 + transportistas han sido bien caracterizado, se sabe poco sobre las identidades moleculares y las funciones de los canales de Ca 2 + en las plantas 1. Pantallas genéticos para mutantes con alteración de Ca 2 + respuesta al estrés estímulos pueden ser un apr efectivaoach para la identificación de los componentes que componen las firmas de Ca 2 +. Ca 2 + sistemas de detección Recientemente basa varios Aequorina han sido desarrollados para facilitar las pantallas de genética para el Ca 2 + señalización componentes en respuesta al ataque de patógenos y estrés abiótico 2-4. Aequorina fue utilizado por primera vez para detectar Ca 2 + señales en plantas a principios de 1990 5. Desde entonces, la Aequorina se ha dirigido a diferentes compartimentos celulares, tales como el citoplasma 5, el núcleo 6, 7 cloroplastos, tonoplasto 8, 9 mitocondrias, y el estroma 10, así como a diferentes tipos de células en la raíz para supervisar celda específica Ca 2 + señales 11. Mediciones de Ca 2 + basado Aequorina revelan la espacial y temporal Ca 2 + respuesta de una población de células para estresar estímulos. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las respuestas de la Ca 2 + de las células individuales son unsynchronizado en el tejido de responder 4. Por lo tanto, la grabación Aequorina Ca 2 + no informa necesariamente la señal de Ca 2 + en las células individuales. En los últimos años, la proteína fluorescente codificada genéticamente (FP) a base de Ca 2 + indicadores, como cameleon amarilla (YCs) 12 y CASEs12 13 se han utilizado para estudiar Ca 2 + señalización con alta resolución subcelular. YCs son la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) a base de Ca 2 + indicadores, que contiene PPC y YFP variantes vínculo del Ca 2 + vinculante calmodulina proteína y péptido de unión a calmodulina-M13. La calmodulina sufre un cambio conformacional ya que se une a Ca 2 +, con lo que trae PPC y YFP más cerca juntos, resultando en una mayor transferencia de energía (FRET mejorada). El nivel de FRET con el tiempo, más o menos calculado como la relación de las intensidades de señal de YFP PPC, refleja la dinámica intracelular de Ca 2 +. Varias versiones TA se han utilizado en las plantas. YC3.6 era targeted al citosol 14,15, el núcleo 16, 17 mitocondrias y membrana plasmática 18, y YC4.6 y D4ER fueron atacados a Urgencias 15,19, y D3cpv fue dirigido a los peroxisomas 20. Las plantas transgénicas que expresan YCs permiten la formación de imágenes en vivo de células de Ca 2 + dinámica dentro de los diferentes compartimentos celulares de diferentes tipos de células. Casos (presumiblemente Ca lcium sí Nsor) son proteínas individuales circularmente permutados fluorescentes (CPFPS) albergan una calmodulina y el péptido de unión a calmodulina-M13. Tras la unión a Ca 2 +, CASEs sufren cambios conformacionales, llevando a un aumento de la intensidad de fluorescencia. La correlación entre la respuesta de fluorescencia del CASE y concentración de Ca2 + intracelular de Ca 2 + permite la dinámica que se deben medir cuantitativamente. La variante Case12 ha 12 veces mayor fluorescencia en la Ca 2 + formas saturados. N. plantas benthiminana transitoriamente expresser Case12 o plantas de Arabidopsis que expresan establemente caso 12 se utilizaron para estudiar Ca 2 + señalización en defensa y abióticos de estrés 4,21. Asíncrono espacial y temporal de Ca 2 + oscilaciones en células que responden al ataque de patógenos, o al estrés deshidratación han sido reveladas con basado Case12 Ca 2 + de imágenes. A continuación, presentamos las instrucciones detalladas para Aequorina imágenes luminiscencia basada de tejidos y estímulos específicos de Ca 2 + en la dinámica de plántulas de Arabidopsis, y de imagen confocal de citosólicas y Ca 2 + dinámica nuclear en células de la raíz de Arabidopsis que expresan Caso 12. luminiscencia imágenes de FAS podría ser adaptado para analizar el estrés inducido por la dinámica de Ca2 + en las plantas o tejidos que no se describen aquí intactos, o para cribar poblaciones de plantas de Arabidopsis mutagenizadas para mutantes con el estrés alterada inducida por Ca 2 + señales. La configuración de imágenes de células vivas Ca2 + podría adaptarse para analizar Ca2 + dinámicas dentro de diferentes compartimentos subcelular o en diferentes tipos de células utilizando otros indicadores de Ca 2 +.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri cuadrada de 10 cm x 10 cm</td><td>VWR</td><td>60872-310</td><td></td></tr><tr><td>Película adhesiva</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>PerkinElmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 1 ml</td><td>VWR</td><td>53548-000</td><td></td></tr><tr><td>Grasa de silicona</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de 2 pocillos&nbsp;</td><td>Nalge Nunc international 155379</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de 8 pocillos</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen de luminiscencia</td><td>Princeton Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal invertido</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon A1R&nbsp;</td></tr><tr><td>Software de imagen</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Elementos Nikon&nbsp;</td></tr><tr><td>DataGraph</td><td>Visual Data Tools Inc</td><td>N/A</td><td>DataGraph 3.1.1 es la versión más reciente</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>NanoLight Technolgies</td><td>#301B NF-BCTZ-FB</td><td></td></tr><tr><td>Lejía multiusos</td><td>Cualquier tienda local</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BP151500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>sal Laboratorios de fitotecnología</td><td>M524-50L</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>VWR</td><td>BDH8029-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

medición espacial y temporal ca 2 + las señales en plantas de arabidopsis

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Señales de desarrollo y ambientales inducen Ca 2 + fluctuaciones en las células vegetales. Espacio-temporales de Ca 2 +-patrones de estímulo específico son detectados por las proteínas de unión a Ca 2 + celulares que inician Ca 2 + cascadas de señalización. Sin embargo, todavía sabemos poco sobre cómo estímulo señales específicas Ca 2 + se generan. La especificidad de una señal de Ca2 + puede atribuirse a la regulación sofisticada de las actividades de los canales y / o transportadores de Ca 2 + en respuesta a un estímulo dado. Para identificar estos componentes celulares y entender sus funciones, es crucial usar sistemas que permiten una grabación sensible y robusta de señales de Ca 2 +, tanto en el tejido y niveles celulares. Genéticamente codificados Ca 2 + indicadores que están dirigidos a diferentes compartimentos celulares han proporcionado una plataforma para la célula viva imagen confocal de celulares Ca 2 + señales. Aquí se describe la instruccións para el uso de dos sistemas de detección de Ca 2 +: Aequorina basa FAS (adhesivo de película) plántulas luminiscencia Ca 2 + de imágenes y basado case12 de fluorescencia confocal de células vivas Ca 2 + de imágenes. De imágenes de luminiscencia usando el sistema FAS ofrece una detección simple, robusto y sensible de espaciales y temporales Ca 2 + señales a nivel de los tejidos, mientras que la célula viva imagen confocal utilizando Case12 ofrece detección simultánea de citosólicas y nucleares Ca 2 + señales con una resolución alta.

Manitol, NaCl y H 2 O 2 se utilizaron como indicadores de la deshidratación, la sal y el estrés oxidativo estímulos, respectivamente. Para comprobar si el ion de metal pesado Cu 2 + sinergia con cualquiera de estos tres estímulos de estrés, se comparó la Ca 2 + respuesta a cada uno de los estímulos en la presencia o ausencia de Cu 2 +. Como se muestra en la Figura 2, las imágenes de luminiscencia FAS reveló que las plantas de semillero Arabidoposis ...

La señalización de Ca2 + regula diversos procesos biológicos en las plantas. Aquí presentamos los enfoques para el control de estrés abiótico inducida espacial y temporal Ca 2 + señales en las células y tejidos que usan las codificados genéticamente Ca 2 + indicadores Aequorina o Case12 Arabidopsis.

Medición Espacial y Temporal Ca 2 + Las señales en plantas de Arabidopsis

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método de monitorización de las señales de calcio tanto a nivel celular como a nivel de toda la planta. Esto se logra cultivando primero las plántulas en la placa de agar MS o directamente dentro de la cámara de imagen. El segundo paso es transferir las plántulas a una película adhesiva o mantenerlas en la cámara de imagen.A continuación, se aplican estímulos a las plántulas para inducir señales de calcio. En última instancia, las imágenes de luminiscencia o fluorescencia del estilo de vida se utilizan para mostrar la respuesta del calcio nuclear citosólico o de la plántula entera, respectivamente, a diferentes estímulos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la de una sola planta, es que el ensayo de plántulas adhesivas con película es simple, sensible y robusto.Por lo tanto, esta técnica se puede adaptar al cribado de alto rendimiento de mutantes con respuestas de señal de calcio alteradas. Además, en comparación con las imágenes de calcio planas, el uso del indicador de calcio codificado genéticamente basado en GFP evita configuraciones y cálculos microscópicos complicados. Este método proporciona información sobre la señalización del calcio durante la respuesta al estrés en Arabidopsis, pero también se puede utilizar en otros contextos, como durante el desarrollo o la defensa en otros modelos de plantas.Demostrar este método será brillante. Un estudiante de nuestro laboratorio Para comenzar este procedimiento, esterilice las semillas de las plantas de opsis de conejo que expresan un quain con una solución de lejía al 10% que contiene 0.01%Triton 100, siembre las semillas en un plato cuadrado que contenga MS 1% sacarosa y 1.2% agar. A continuación, coloque las placas verticalmente en una cámara de crecimiento después de una estratificación de cuatro grados centígrados durante dos días.Luego, transfiera las plántulas a una película. Coloque una película adhesiva encima de las plántulas de siete a 10 días que crecen en el plato. Empuje suavemente la película con la mano para asegurarse de que las plántulas se adhieran a la película.A continuación, pela la película suavemente para que las plántulas permanezcan adheridas a la película. A continuación, incube las plántulas con el cofactor colocando las plántulas adheridas A en un plato cuadrado que contenga 15 mililitros de dos microgramos por mililitro de HCTZ en agua. Incube las plántulas a temperatura ambiente durante cuatro horas o toda la noche.Para prepararse para la obtención de imágenes de luminiscencia, saque la película de la solución HCTZ y córtela por la mitad para formar dos piezas. Coloque los dos trozos de película con las plántulas hacia arriba en dos platos diferentes. A continuación, deje las placas en la oscuridad durante cinco minutos para adquirir imágenes de luminiscencia en la oscuridad.Coloque dos placas una al lado de la otra en la platina del sistema de imágenes de luminiscencia. Adquiera imágenes inmediatamente después de agregar 20 mililitros de solución de estímulos a las placas simultáneamente. Para analizar las imágenes de luminiscencia, elija el mismo rango de visualización para todas las imágenes de luminiscencia, recorte el ROI y genere las imágenes como archivos jpeg.Alternativamente, exporte las imágenes como archivos en formato SPE e impórtelas en el software de análisis de imágenes image J. Establezca las medidas para calcular el valor medio de gris del ROI, seleccione el mismo tamaño de área de ROI. A continuación, mida el valor medio de gris y presente los datos como gráficos de barras.Para preparar plántulas para la obtención de imágenes confocal. Esterilizar las semillas de las plantas de opsis expresando el caso 12 con una solución de lejía al 10% que contenga 0,01% de Tritón. Por lo tanto, las semillas estériles en un plato que contiene sales MS de alta potencia, 1% de sacarosa y 1,2% de agar.Luego coloque las placas verticalmente en una cámara de crecimiento después de la estratificación a cuatro grados centígrados durante dos días. Mientras tanto, ensamble una cámara de imágenes con un portaobjetos y un cubreobjetos. Coloca un pedazo de algodón empapado en agua en la parte superior del tobogán.Luego, transfiera una o dos plántulas de cinco días del plato al centro del portaobjetos. A continuación, pega pequeños trozos de arcilla en cada esquina del cubreobjetos y colócalo encima de las plántulas para crear un espacio entre el cubreobjetos y el portaobjetos. Después de eso, conecte un extremo del tubo de polietileno a una jeringa de un mililitro y coloque el otro extremo del tubo inmediatamente adyacente a la cámara.Sostenga el tubo en su lugar con cinta adhesiva para ensamblar una cámara de imágenes con una cámara de plexiglás. Extienda una fina capa de grasa de silicona alrededor de dos tubos de polietileno y presione los tubos recubiertos en los canales a cada lado de la cámara de plexiglás. A continuación, extienda una fina capa de grasa de silicona sobre la superficie de la cámara que contiene las ranuras del tubo y coloque un cubreobjetos sobre la grasa para sellar un lado de la abertura de la cámara.A continuación, transfiera una plántula de cinco días del plato a la cámara y coloque un trozo de algodón empapado en agua encima de la plántula. Extienda la grasa de silicona sobre la otra superficie de la cámara y presione otro cubreobjetos en la parte superior para sellar. Después, conecta el extremo de uno de los tubos a una jeringa de un mililitro y deja abierto el extremo del otro tubo.Para preparar una cámara de imágenes con un cubreobjetos con cámara, primero esterilice el cubreobjetos con 70% de etanol y déjelo en la campana hasta que se seque a 0,6 mililitros o 0,2 mililitros de MS de concentración completa. Medio que contiene 1% de sacarosa y 0,5% de gel de combate en cada pocillo de una cámara de dos pocillos o una cámara de ocho pocillos, respectivamente. A continuación, esteriliza las semillas y siémbralas directamente sobre un cubreobjetos con cámara que contenga una fina capa de gel transparente y déjalas crecer verticalmente durante cinco días. Para la adquisición de imágenes.El uso de un microscopio confocal aplica estímulos de estrés inyectando lentamente 200 microlitros de cloruro de sodio de 150 milimolares, agua helada o una solución de peróxido de hidrógeno milimolar en la cámara justo antes de adquirir imágenes. Capture las imágenes inmediatamente después de aplicar la solución de estímulo. Utilizando un microscopio de barrido láser confocal invertido con una lente de inmersión en agua de 20 aumentos.Recopile una serie temporal de imágenes a intervalos de cuatro segundos con longitudes de onda de excitación y emisión de 4 88 nanómetros y de 500 a 550 nanómetros respectivamente, y una resolución AIX de cinco 12 por cinco 12 o análisis de imágenes utilizando elementos de Nikon. Los ROI se dibujan en torno a cada celda de interés. La intensidad total dentro de cada ROI se mide a lo largo del tiempo utilizando el cuadro de diálogo de medición del tiempo.Luego, las mediciones de intensidad total se exportan y procesan en el gráfico de datos que se muestra. Aquí está la comparación de la respuesta espacial temporal de calcio de plántulas de 10 días. Los diferentes estímulos de estrés aquí son las series temporales de luminiscencia, imágenes de plántulas sometidas a 400 milimolares de manitol y 400 milimolar más un milimolar de cloruro de cobre, 75 milimolar de cloruro de sodio y 75 milimolares de cloruro de sodio más un milimolar de cloruro de cobre y un milimolar de peróxido de hidrógeno o un milimolar de peróxido de hidrógeno más un milimolar de cloruro de cobre.Los paneles superior e inferior son las imágenes de luminiscencia adquiridas durante los primeros 40 segundos y los segundos 40 segundos respectivamente. Y aquí está el gráfico de barras de la intensidad de luminiscencia promedio de las plántulas en respuesta a los estímulos de estrés indicados que se muestran aquí como la oscilación citosólica y nuclear del calcio. En respuesta al estrés salino, las imágenes confocales muestran que el caso 12 se expresa en el citoplasma y los núcleos de las células de la raíz y las células de la hoja de las plantas transgénicas que expresan el caso 12.Se emerge esta imagen, imagen del rojo, autofluorescencia de los cloroplastos y la fluorescencia verde del caso 12. Estos dos gráficos muestran la oscilación cálcica inducida por estrés salino en el citosol, un núcleo de las células de la raíz. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar plántulas bien cultivadas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo monitorear dynas tanto a nivel celular como de toda la planta.

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Investigación

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Biología

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