Name: Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprende a detectar y rastrear la anastasis en células mamíferas mediante microscopía de células vivas y biosensores. Este método permite observar la reversión de la apoptosis y sus consecuencias en la supervivencia celular.

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Agradecemos Rev. Dr. Ralph Bohlmann y el Rev. Dr. James Voelz por sugerir la palabra &quot;Anastasis&quot; para describir la reversión de la apoptosis; Douglas R. Green para las células HeLa que expresan de forma estable el citocromo c-GFP; Charles M. Rudin y Eric E. Gardner para H446 células; Heather Cordero para la asistencia en el dibujo de la historieta en el video; Yee Hui Yeo valioso para el debate de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), la Beca Dr. Walter Szeto Memorial (HLT), beca Fulbright 007-2009 (HLT), Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida de becas (HLT), NIH subvenciones NS037402 (JMH) y NS083373 (JMH), y el Comité de Becas de la Universidad de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang es una Fundación Shurl y Kay Curci Fellow de la Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida.

Los autores no tienen nada que revelar.

Anastasis se refiere al fenómeno por el cual las células que han de células activadas por vía de la muerte posteriormente revertir el proceso de muerte y sobrevivir. Aquí, hemos demostrado que imágenes de células vivas se puede utilizar para confirmar que las mismas células individuales, de hecho, pueden revertir proceso de muerte celular apoptótica en una etapa tardía, y luego continuar sobrevivir y reproducirse. Nuestros protocolos describen varias condiciones de tratamiento específicas del tipo de células optimizado ...

La apoptosis (del griego, &quot;caer a la muerte&quot;) en general se supone que ser un proceso unidireccional que termina en suicidio celular 1-7. Alteración genética de genes pro-muerte como resultado la supervivencia de las células adicionales que de otro modo morirían en animales enteros, incluyendo las células que ya han iniciado el 8,9 vía de la apoptosis. Del mismo modo, las manipulaciones genéticas permiten que las células de mamíferos sanos que artificialmente Display &quot;Cómeme&quot; señales o que pierden la adherencia a su matriz extracelular para escapar de la muerte por la fagocitosis de células enteras o entosis, respectivamente 10,11. Sin embargo, nosotros y otros han demostrado que sin manipulación genética de células de mamíferos sanos normales y líneas celulares también pueden recuperarse de las primeras etapas de la apoptosis 12-15. El uso de herramientas para rastrear células individuales, hemos demostrado aún más la recuperación de las últimas etapas de la apoptosis 12,13, después de las células han pasado los puntos de control importantes que típicoly marcar el &quot;punto de no retorno&quot; 2-6. Estos puntos de control de la apoptosis etapa tardía incluyen liberación mitocondrial de citocromo c, la activación de caspasas, la fragmentación nuclear, y formación de cuerpos apoptóticos. Adoptamos una palabra compuesta griega &quot;Anastasis&quot;, que significa &quot;resurrección a la vida&quot;, para describir esta inversión de la apoptosis en el borde de la muerte celular 2-6. A menos que todo el proceso de recuperación de morir es observado por imágenes de células vivas, es difícil distinguir las células que han sido objeto anastasis a partir de células que nunca experimentaron eventos apoptóticos. Décadas de trabajo han puesto de manifiesto que las características morfológicas de suicidio celular por apoptosis son impulsados ​​por eventos bioquímicos y moleculares conservadas evolutivamente 16-19. Estos eventos promueven la auto-destrucción de las células para regular los procesos de desarrollo y homeostáticos en organismos unicelulares y pluricelulares mediante la eliminación de daños o dcélulas angerous 16-19. Mientras que las células apoptóticas pueden distinguirse fácilmente por manifestaciones morfológicas, bioquímicas y moleculares estandarizados de apoptosis 1,5,6,16,20, actualmente no se conoce ningún marcador específico para anastasis 12,13. Es importante destacar que las células que han sido objeto anastasis parecen ser las células sanas normales y células que sólo empiezan revertir apoptosis aparecer células que mueren como apoptosis 12,13. Por lo tanto, se necesitan nuevas herramientas para concluir con certeza que una célula sobrevive dado había experimentado previamente procesos apoptóticos activos. La apoptosis se asume generalmente como una cascada irreversible porque es un proceso de destrucción rápida y masiva. Si bien se podría tardar minutos en días de algunas células para iniciar la apoptosis, una vez que las mitocondrias han lanzado factores apoptogénicos como citocromo c al citosol 21,22, caspasas pueden ser activados en 5 minutos 23,24, seguidos por citoplasmática ycondensación nuclear dentro de 10 min 25-27, y la muerte celular poco después 25-27. Las caspasas activadas orquestan la apoptosis mediante la escisión e inactivación de componentes estructurales y funcionales clave para el propósito de demolición celular 2,28, tales como el inhibidor de la endonucleasa de DFF45 / ICAD 29,30. Las caspasas también activan factores pro-apoptóticos, tales como BID miembro de familia Bcl-2, que se transloca a la mitocondria para promover la liberación de citocromo C 31,32. Actividad caspasa también da lugar a la exposición de la superficie celular de fosfatidilserina como &quot;comerme&quot; señal para la promoción de inmersión de las células que mueren por los macrófagos o células vecinas a través de la fagocitosis 33. Además, eventos apoptóticos hacen mitocondrias disfuncionales, lo que altera la bioenergética celular y el metabolismo 34,35,36. Por lo tanto, la recuperación de dicha destrucción parece intuitivamente improbable. Contrariamente a la original esperarciones, las células pueden revertir el proceso de muerte celular apoptótica incluso en una etapa tardía. Al monitorear continuamente el destino de morir las células en cultivo, se observó la reversibilidad de la apoptosis etapa tardía en una gama de células primarias y líneas celulares 12,13. La eliminación del estímulo muerte permitió la recuperación de las características evidentes de la apoptosis, tales como la fragmentación mitocondrial, condensación de la cromatina, el daño del ADN, formación de ampollas en la membrana plasmática, la exposición de la superficie celular de la fosfatidilserina, la liberación de citocromo c mitocondrial, la activación de caspasas, la fragmentación nuclear, contracción celular, y formación de cuerpos apoptóticos. Estas observaciones plantean preguntas sin respuesta sobre las funciones, las consecuencias y los mecanismos de anastasis. Para abordar estas cuestiones, es un requisito previo para identificar de forma fiable las células que han sido objeto anastasis. A continuación, describimos los métodos de microscopía en vivo y un biosensor para la detección de caspasa células que han invertido previamente apoptosis etapa tardía y XXen sobrevivió.

<table><tbody><tr><td>Microscopía confocal LSM780</td><td>Carl Zeiss Placa de</td> cultivo con fondo de <td></td><td></td></tr><tr><td>vidrio</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>CultFoi transparente</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>CO2 medio independiente</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V marcada con fluorescencia</td><td>Biovision</td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

estrategias para anastasis seguimiento, una célula de supervivencia fenómeno que invierte apoptosis

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (del griego, &quot;el aumento de la vida&quot;) se refiere a la recuperación de las células que mueren. Antes de que estas células se recuperan, que han pasado a través de los puntos de control importantes de la apoptosis, incluyendo la fragmentación mitocondrial, la liberación de citocromo c mitocondrial en el citosol, la activación de las caspasas, condensación de la cromatina, el daño del ADN, fragmentación nuclear, formación de ampollas en la membrana plasmática, el encogimiento celular, la exposición de la superficie celular de fosfatidilserina, y la formación de cuerpos apoptóticos. Anastasis puede ocurrir cuando los estímulos apoptóticos se eliminan antes de la muerte, permitiendo así que las células que mueren para revertir la apoptosis y potencialmente otros mecanismos de muerte. Por lo tanto, anastasis parece implicar procesos de curación fisiológicos que también podrían sostener las células dañadas de manera inapropiada. Las funciones y mecanismos de anastasis aún no están claros, obstaculizada en parte por las limitadas herramientas para la detección de eventos pasados ​​después de la recuperación de las células aparentemente sanas. Estrategias para detectar anastasis permitirá a los estudios de los mecanismos fisiológicos, los peligros de las células no-muertos en patología de la enfermedad y posibles terapias para modular anastasis. A continuación, describimos las estrategias eficaces usando microscopia de células vivas y un biosensor caspasa mamífero para identificar y rastrear anastasis en células de mamíferos.

Para estudiar la reversión de la apoptosis, las células de cultivo de tejidos se expusieron primero a un estímulo muerte para activar la apoptosis. Cuando las células exhiben características de apoptosis, medio de cultivo fresco se aplica entonces para lavar el estímulo y luego se incuban las células que mueren para permitir la recuperación (Figura 1A). Aquí, la cuestión clave está abordando es hasta qué punto las células cultivadas que mueren individuales pueden progresar hacia la apoptosis y todavía s...

El término anástasis se refiere al fenómeno en el que las células moribundas revierten un proceso de suicidio celular en una etapa tardía, se reparan a sí mismas y, finalmente, sobreviven. Aquí demostramos protocolos para detectar y rastrear células que se someten a anastasis.

Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar y rastrear la reversión del proceso de muerte celular apoptótica y las células cultivadas mediante microscopía de células vivas. Las células sanas se diseminan en el sustrato y contienen mitocondrias filamentosas tubulares alrededor del núcleo. Sin embargo, cuando las células se suicidan a través de la apoptosis, las células moribundas muestran características morfológicas únicas para detectar y rastrear la reversión de la apoptosis.Las células se colocan en placas de cultivo celular con fondo de vidrio. El siguiente paso es realizar la tinción de células vivas para marcar las mitocondrias y los núcleos. Esto permite la detección de características morfológicas de células sanas y apoptóticas.Mediante microscopía de células vivas, las células sanas marcadas se exponen a un estímulo de muerte para inducir la apoptosis. Cuando se detecta la apoptosis, las células moribundas se lavan y luego se incuban con un medio de cultivo celular fresco para permitir la recuperación celular, las imágenes de células vivas se utilizan para detectar y rastrear la reversión de la apoptosis y sus consecuencias, como la reparación y la supervivencia celular, como lo muestran la recuperación morfológica y la migración celular, respectivamente. La apoptosis es un tipo de muerte celular programada que desempeña un papel esencial para eliminar las células no deseadas o peligrosas de nuestro cuerpo.Este proceso de síntesis celular generalmente se asume como irreversible porque una vez que ha comenzado, la célula muere ciertamente después, sin embargo, descubrimos que, de hecho, la célula moribunda puede revertir el proceso de muerte celular y luego sobrevivir e incluso. Tienen posibles pasos críticos que se han visto obligados a ser el punto de bajo retorno, como el citoC, la liberación, la activación basada en casos, la fragmentación nuclear y la formación de cuerpos apoptóticos. Después de consultar a los expertos griegos, adoptamos un término, una estasis, que significa resucitar a la vida.Para describir el fenómeno de revertir la apoptosis y otros procesos de muerte celular, la antesis es difícil de detectar porque las células que invierten la apoptosis se parecen a las células pesadas normales. Sin embargo, mediante la microscopía continua de células vivas, podemos detectar la aparición de anástasis en una gran parte de las células. Dominar esta técnica es importante porque nos permite estudiar la recreación de la antesis.Propusimos que esa antesis podría curar el daño del tejido, pero también podría permitir que las células dañadas sobrevivan y formen cánceres. Por lo tanto, la identificación de los mecanismos que controlan las anestesias podría proporcionarnos nuevos enfoques para tratar enfermedades inyectables como el cáncer, la insuficiencia cardíaca y la degeneración mediante la mediación de la muerte celular y la supervivencia para detectar y rastrear la anástasis. Después de los eventos apoptóticos, se realiza una microscopía de células vivas de lapso de tiempo para rastrear qué células pueden revertir la apoptosis después de la inducción de la muerte celular transitoria.Para comenzar, agregue un mililitro de solución de poli de licina a una placa de cultivo celular de 35 milímetros con un fondo de vidrio más delgado. Después de una incubación de un minuto para recubrir la superficie del vidrio, aspire la solución y lave el vidrio con dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato Para preparar las células primero los ojos de tripsina, las células del talón al 80 al 90%confluencia Después de que las células se hayan desprendido, agregue 10 mililitros de medio a 37 grados centígrados para suspender las células. A continuación, transfiera la solución de suspensión celular a un tubo estéril de 10 mililitros para centrifugar a 160 veces G durante uno o dos minutos.Después del centrifugado, aspire con cuidado el medio. No moleste el pellet de celda en la parte inferior del tubo. Proceda a resuspender las células con 10 mililitros de medio de cultivo celular mediante un pipeteo suave.A continuación, vea dos mililitros de las celdas suspendidas en un vidrio prerrevestido de 35 milímetros. Placas de cultivo celular inferiores. Incubar las células en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante un día.Puede ser necesario ajustar el número de células para que las células puedan alcanzar el 80% de fluidez en el momento de la toma de imágenes. La fragmentación mitocondrial y nuclear son las características morfológicas de la apoptosis. Para visualizar las mitocondrias y los núcleos, realice la tinción poco antes de la obtención de imágenes de células vivas.Comience el protocolo de tinción agregando primero dos microlitros de tinción mitocondrial. MIT tracker red 50 micromolar solución madre y dos microlitros de tinción de ADN enganchada 3 3 3 3 4 2 10 miligramos por mililitro de solución madre en un tubo de microcentrífuga estéril, agregue un mililitro del medio de cultivo acondicionado de la placa de cultivo celular al tubo de microcentrífuga y mezcle bien con las manchas mediante pipeteo. A continuación, vuelve a añadir la mezcla al plato de cultivo.Después de incubar la placa a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 20 minutos, aspire el medio y lave las células teñidas tres veces con un mililitro de cultivo celular caliente, medio o solución salina tamponada con fosfato. A continuación, incubar las células con medio de cultivo celular a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos más. Evite el tiempo de tinción prolongado, ya que la señal de fondo inespecífica de las células de tinción podría aumentar debido a la tinción excesiva.Después de la incubación, aspire el medio, lave las células nuevamente y luego continúe incubando las células con dos mililitros de medio de cultivo celular a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Los componentes del microscopio deben alcanzar un equilibrio térmico para evitar la deriva del enfoque y el desplazamiento del plano XY debido a la expansión y contracción térmica de los componentes. Para garantizar que se logre el equilibrio térmico, encienda la cámara de control ambiental y la incubadora de etapas para precalentar el microscopio a 37 grados Celsius al menos dos horas antes de que comiencen las imágenes.Luego encienda el regulador de dióxido de carbono para suministrar un 5% de dióxido de carbono a la cámara de control ambiental. Cuando el suministro de dióxido de carbono no está disponible, se puede utilizar un medio independiente del dióxido de carbono para apoyar el crecimiento celular. Antes de tomar imágenes, coloque una gota de aceite de inmersión directamente sobre un objetivo de 40 x con una apertura numérica de 1,4.A continuación, coloque suavemente la placa de cultivo con células teñidas en la incubadora de etapa a 37 grados centígrados. Cubra el plato con papel de aluminio frío transparente para evitar la pérdida de agua por evaporación y la contaminación de la muestra para realizar microscopía de contraste de interferencia diferencial. No utilice la cubierta plástica del plato de cultivo, ya que el plástico puede alterar la polaridad de la luz.A continuación, localice y concéntrese en un grupo de células sanas que se propagan en la superficie del vidrio con mitocondrias tubulares y núcleos redondos. Elija las células en o cerca del centro de la placa de cultivo para asegurarse de que las células estén en el mismo plano focal una vez en su lugar, realice una exposición rápida mediante microscopía confocal para determinar la intensidad mínima del láser y el tiempo de exposición para obtener imágenes claras de las células y sus orgánulos. Este paso es fundamental.Como la luz láser es fototóxica para las células, es necesario optimizarla y ajustarla. Para eliminar la deriva del enfoque, utilice un dispositivo de compensación de la deriva del enfoque automático continuo que utilice un diodo emisor de luz infrarroja. Alternativamente, el plano de enfoque se puede corregir manualmente. Cuando se identifiquen las células y el plano focal, optimice todos los parámetros y tome una imagen de prueba antes de comenzar la obtención de imágenes de células vivas.A continuación, inicie la obtención de imágenes en directo para obtener imágenes de las células sanas con intervalos de un minuto durante 10 ciclos para inducir la apoptosis. Retire el medio celular con una pipeta transparente. Aplique un estímulo de muerte celular que se mezcla previamente con un medio de cultivo celular a 37 grados Celsius en el plato.Continúe cubriendo el plato con papel de culto transparente. Durante la obtención de imágenes de lapso de tiempo después de la aplicación del estímulo de muerte celular, ajuste el intervalo de tiempo para obtener imágenes de las células tratadas para detectar la apoptosis mediante la captura de las características morfológicas de la apoptosis, como la mancha de la membrana plasmática, la fragmentación mitocondrial, la condensación y fragmentación nuclear, la condensación citoplasmática, la contracción celular y la formación de cuerpos apoptóticos. Cuando se observa apoptosis, se retira el medio con el estímulo de muerte celular y se aplican dos mililitros de medio de cultivo celular fresco para incubar las células.Continúe con la imagen de lapso de tiempo para observar la recuperación morfológica de las células y las consecuencias de la anástasis. Después de la eliminación de un estímulo de muerte celular que muere por cáncer de pulmón humano, las células H 4 46 pueden revertir la apoptosis. Aunque las células muestran características distintivas de la apoptosis, como la contracción celular, el desmoldeo de la membrana, la fragmentación mitocondrial, la condensación nuclear y la fragmentación y la apoptosis, la formación del cuerpo después de la división celular por anástasis puede ser anormal.En este ejemplo, en lugar de dos núcleos punteadores, se forman tres núcleos principales después de la división celular con la formación de micronúcleos que indican alteraciones genéticas en las células punteadoras. Esto sugiere que la anástasis podría ser mutagénica después de la exposición de una célula a un estímulo de muerte celular. Los factores pro apoptóticos se translocan a las mitocondrias para desencadenar la liberación del citocromo C, que conduce al ensamblaje de un protosoma y a la activación basada en moldes para la demolición celular y luego la muerte celular.Aquí están las células HELOC que expresan citocromo C marcado con GFP, que se localiza en las mitocondrias después de la inducción de la apoptosis. El citocromo C se libera en el citosol. Sin embargo, después de que las células se lavan y luego se incuban con citosol medio fresco, el ex citocromo C se reduce a los niveles normales, lo que indica que puede ocurrir anastasis después de la liberación del citocromo C.Aquí se muestran células hela que expresan el biosensor basado en CA N-E-S-D-E-V-D-Y-F-P-N-L-S, que primero se localiza en el citosol después de la inducción de la apoptosis como se esperaba. Y-F-P-N-L-S se transloca al núcleo debido a la escisión de DEVD por bases de fundición activadas. Sin embargo, después de que el estímulo de muerte se lava y las células se incuban con medio fresco, Y-F-P-N-L-S permanece en el núcleo mientras que las células recuperan la morfología normal, lo que indica que puede ocurrir una ptosis de VA inversa después de la activación de la base fundida.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar las imágenes de células vivas para detectar antesis y sus consecuencias. En esta demostración, utilizamos etanol como inductor de ATO. Al mismo tiempo, la célula puede revertir el proceso de muerte celular que es inducido por otros estímulos de muerte como el teso DMSO y la esporina La luz fluorescente es fototónica para las células, por lo que es fundamental minimizar las noches que calientan una muestra durante la obtención de imágenes de células vivas.El proceso de apoptosis y anástasis nocturna depende de las actividades sensibles a la temperatura y semáticos. Por lo tanto, es importante mantener las células a la misma temperatura durante el experimento para garantizar resultados repetibles.

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Se presenta un protocolo simple de visualizar regiones de la muerte celular programada (PCD) en embriones de ratón y diferenciadores madre embrionarias (ES) de cultivos de células utilizando un colorante altamente soluble llamada LysoTracker.

El uso de LysoTracker para detectar la muerte celular programada en embriones y la diferenciación de células madre embrionarias

Contribución del factor de remodelación de la cromatina ACF a la muerte celular inducida por E4orf4 se midió. El protocolo incluye la selección de clones de células en las que el tratamiento con doxiciclina induce desmontables condicional de la ACF subunidades Acf1 y SNF2h, y el uso del ensayo de DAPI para medir E4orf4 inducida por la muerte celular en las líneas celulares inducibles.

Preparación de líneas celulares de Derribo condicional de la expresión génica y la medición de los efectos desmontables en la muerte celular inducida por E4orf4

Este protocolo describe el uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir la absorción de la seguimiento temporal de las células que estaban en fase S en un punto específico en el tiempo. La adición de colorantes de ADN y el etiquetado de anticuerpos facilita el análisis detallado del destino de las células en fase S en épocas posteriores.

Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización

Aquí, describimos un método de microscopía de lapso de tiempo a largo plazo para rastrear longitudinalmente células individuales en respuesta a terapias contra el cáncer.

A través del espejo: Microscopía de lapso de tiempo y de seguimiento longitudinal de las células individuales para el Estudio de la terapéutica contra el cáncer

Anastasis es técnicamente difícil de detectar en vivo porque las células que se han invertido el proceso de muerte celular pueden ser morfológicamente indistinguibles de las células sanas normales. Aquí se describen los protocolos para la detección y seguimiento de las células que se someten a la anastasis en animales vivos mediante nuestro sistema de biosensor desarrollado recientemente en vivo CaspaseTracker.

Detección de Anastasis en Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de eventos de señalización intracelular inducidos en células viables por interacción física con células muertas o moribundas adyacentes. El protocolo se centra en los eventos de señalización inducidos por el reconocimiento de las células muertas mediado por receptores, en contraposición a su captación fagocítica o liberación de mediadores solubles.

Identificación de eventos de señalización intracelular inducida en células viables por la interacción con las células vecinas sometidos a la célula apoptótica de la muerte

Proyección de imagen de células vivas proporciona una riqueza de información en las células o poblaciones enteras que es inalcanzable por célula fija la proyección de imagen solamente. Aquí, se describen protocolos de células vivas para evaluar las decisiones de destino celular después del tratamiento con el fármaco anti-mitotic paclitaxel.

A largo plazo células vivas imágenes para evaluar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel

Aquí, presentamos un protocolo para aislar células de cáncer de mama apoptóticas clasificación celular activado por fluorescencia y más detectar la transición no potencia el cáncer de células de mama a Mama cáncer células madre células después de la revocación de la apoptosis por citometría de flujo.

Detección del flujo Cytometric recién formado cáncer similares a células madre de células de mama después de la revocación de la Apoptosis

El método presentado combina el análisis cuantitativo de las roturas de doble cadena de ADN (DSB), la distribución del ciclo celular y la apoptosis para permitir la evaluación específica del ciclo celular del Dsb de inducción y la reparación, así como las consecuencias de la falla de reparación.

Medición específica del ciclo celular de la éH2AX y la apoptosis después del estrés genotóxico por citometría de flujo

Este protocolo describe un método para la medición en tiempo real de los flujos de calcio mitocondrial de imagen fluorescente. El método se aprovecha de una circular permutaciones YFP basada en sensor de calcio de doble excitación radiométrica (radiométrica pericam-mt) expresa selectivamente en las mitocondrias.

Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados

Aprende a detectar y rastrear la anastasis en células mamíferas mediante microscopía de células vivas y biosensores. Este método permite observar la reversión de la apoptosis y sus consecuencias en la supervivencia celular.

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