Name: Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprende a detectar y rastrear la anastasis en células mamíferas mediante microscopía de células vivas y biosensores. Este método permite observar la reversión de la apoptosis y sus consecuencias en la supervivencia celular.

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Agradecemos Rev. Dr. Ralph Bohlmann y el Rev. Dr. James Voelz por sugerir la palabra &quot;Anastasis&quot; para describir la reversión de la apoptosis; Douglas R. Green para las células HeLa que expresan de forma estable el citocromo c-GFP; Charles M. Rudin y Eric E. Gardner para H446 células; Heather Cordero para la asistencia en el dibujo de la historieta en el video; Yee Hui Yeo valioso para el debate de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), la Beca Dr. Walter Szeto Memorial (HLT), beca Fulbright 007-2009 (HLT), Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida de becas (HLT), NIH subvenciones NS037402 (JMH) y NS083373 (JMH), y el Comité de Becas de la Universidad de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang es una Fundación Shurl y Kay Curci Fellow de la Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida.

Los autores no tienen nada que revelar.

Anastasis se refiere al fenómeno por el cual las células que han de células activadas por vía de la muerte posteriormente revertir el proceso de muerte y sobrevivir. Aquí, hemos demostrado que imágenes de células vivas se puede utilizar para confirmar que las mismas células individuales, de hecho, pueden revertir proceso de muerte celular apoptótica en una etapa tardía, y luego continuar sobrevivir y reproducirse. Nuestros protocolos describen varias condiciones de tratamiento específicas del tipo de células optimizado ...

La apoptosis (del griego, &quot;caer a la muerte&quot;) en general se supone que ser un proceso unidireccional que termina en suicidio celular 1-7. Alteración genética de genes pro-muerte como resultado la supervivencia de las células adicionales que de otro modo morirían en animales enteros, incluyendo las células que ya han iniciado el 8,9 vía de la apoptosis. Del mismo modo, las manipulaciones genéticas permiten que las células de mamíferos sanos que artificialmente Display &quot;Cómeme&quot; señales o que pierden la adherencia a su matriz extracelular para escapar de la muerte por la fagocitosis de células enteras o entosis, respectivamente 10,11. Sin embargo, nosotros y otros han demostrado que sin manipulación genética de células de mamíferos sanos normales y líneas celulares también pueden recuperarse de las primeras etapas de la apoptosis 12-15. El uso de herramientas para rastrear células individuales, hemos demostrado aún más la recuperación de las últimas etapas de la apoptosis 12,13, después de las células han pasado los puntos de control importantes que típicoly marcar el &quot;punto de no retorno&quot; 2-6. Estos puntos de control de la apoptosis etapa tardía incluyen liberación mitocondrial de citocromo c, la activación de caspasas, la fragmentación nuclear, y formación de cuerpos apoptóticos. Adoptamos una palabra compuesta griega &quot;Anastasis&quot;, que significa &quot;resurrección a la vida&quot;, para describir esta inversión de la apoptosis en el borde de la muerte celular 2-6. A menos que todo el proceso de recuperación de morir es observado por imágenes de células vivas, es difícil distinguir las células que han sido objeto anastasis a partir de células que nunca experimentaron eventos apoptóticos. Décadas de trabajo han puesto de manifiesto que las características morfológicas de suicidio celular por apoptosis son impulsados ​​por eventos bioquímicos y moleculares conservadas evolutivamente 16-19. Estos eventos promueven la auto-destrucción de las células para regular los procesos de desarrollo y homeostáticos en organismos unicelulares y pluricelulares mediante la eliminación de daños o dcélulas angerous 16-19. Mientras que las células apoptóticas pueden distinguirse fácilmente por manifestaciones morfológicas, bioquímicas y moleculares estandarizados de apoptosis 1,5,6,16,20, actualmente no se conoce ningún marcador específico para anastasis 12,13. Es importante destacar que las células que han sido objeto anastasis parecen ser las células sanas normales y células que sólo empiezan revertir apoptosis aparecer células que mueren como apoptosis 12,13. Por lo tanto, se necesitan nuevas herramientas para concluir con certeza que una célula sobrevive dado había experimentado previamente procesos apoptóticos activos. La apoptosis se asume generalmente como una cascada irreversible porque es un proceso de destrucción rápida y masiva. Si bien se podría tardar minutos en días de algunas células para iniciar la apoptosis, una vez que las mitocondrias han lanzado factores apoptogénicos como citocromo c al citosol 21,22, caspasas pueden ser activados en 5 minutos 23,24, seguidos por citoplasmática ycondensación nuclear dentro de 10 min 25-27, y la muerte celular poco después 25-27. Las caspasas activadas orquestan la apoptosis mediante la escisión e inactivación de componentes estructurales y funcionales clave para el propósito de demolición celular 2,28, tales como el inhibidor de la endonucleasa de DFF45 / ICAD 29,30. Las caspasas también activan factores pro-apoptóticos, tales como BID miembro de familia Bcl-2, que se transloca a la mitocondria para promover la liberación de citocromo C 31,32. Actividad caspasa también da lugar a la exposición de la superficie celular de fosfatidilserina como &quot;comerme&quot; señal para la promoción de inmersión de las células que mueren por los macrófagos o células vecinas a través de la fagocitosis 33. Además, eventos apoptóticos hacen mitocondrias disfuncionales, lo que altera la bioenergética celular y el metabolismo 34,35,36. Por lo tanto, la recuperación de dicha destrucción parece intuitivamente improbable. Contrariamente a la original esperarciones, las células pueden revertir el proceso de muerte celular apoptótica incluso en una etapa tardía. Al monitorear continuamente el destino de morir las células en cultivo, se observó la reversibilidad de la apoptosis etapa tardía en una gama de células primarias y líneas celulares 12,13. La eliminación del estímulo muerte permitió la recuperación de las características evidentes de la apoptosis, tales como la fragmentación mitocondrial, condensación de la cromatina, el daño del ADN, formación de ampollas en la membrana plasmática, la exposición de la superficie celular de la fosfatidilserina, la liberación de citocromo c mitocondrial, la activación de caspasas, la fragmentación nuclear, contracción celular, y formación de cuerpos apoptóticos. Estas observaciones plantean preguntas sin respuesta sobre las funciones, las consecuencias y los mecanismos de anastasis. Para abordar estas cuestiones, es un requisito previo para identificar de forma fiable las células que han sido objeto anastasis. A continuación, describimos los métodos de microscopía en vivo y un biosensor para la detección de caspasa células que han invertido previamente apoptosis etapa tardía y XXen sobrevivió.

<table><tbody><tr><td>Microscopía confocal LSM780</td><td>Carl Zeiss Placa de</td> cultivo con fondo de <td></td><td></td></tr><tr><td>vidrio</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>CultFoi transparente</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>CO2 medio independiente</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V marcada con fluorescencia</td><td>Biovision</td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

estrategias para anastasis seguimiento, una célula de supervivencia fenómeno que invierte apoptosis

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (del griego, &quot;el aumento de la vida&quot;) se refiere a la recuperación de las células que mueren. Antes de que estas células se recuperan, que han pasado a través de los puntos de control importantes de la apoptosis, incluyendo la fragmentación mitocondrial, la liberación de citocromo c mitocondrial en el citosol, la activación de las caspasas, condensación de la cromatina, el daño del ADN, fragmentación nuclear, formación de ampollas en la membrana plasmática, el encogimiento celular, la exposición de la superficie celular de fosfatidilserina, y la formación de cuerpos apoptóticos. Anastasis puede ocurrir cuando los estímulos apoptóticos se eliminan antes de la muerte, permitiendo así que las células que mueren para revertir la apoptosis y potencialmente otros mecanismos de muerte. Por lo tanto, anastasis parece implicar procesos de curación fisiológicos que también podrían sostener las células dañadas de manera inapropiada. Las funciones y mecanismos de anastasis aún no están claros, obstaculizada en parte por las limitadas herramientas para la detección de eventos pasados ​​después de la recuperación de las células aparentemente sanas. Estrategias para detectar anastasis permitirá a los estudios de los mecanismos fisiológicos, los peligros de las células no-muertos en patología de la enfermedad y posibles terapias para modular anastasis. A continuación, describimos las estrategias eficaces usando microscopia de células vivas y un biosensor caspasa mamífero para identificar y rastrear anastasis en células de mamíferos.

Para estudiar la reversión de la apoptosis, las células de cultivo de tejidos se expusieron primero a un estímulo muerte para activar la apoptosis. Cuando las células exhiben características de apoptosis, medio de cultivo fresco se aplica entonces para lavar el estímulo y luego se incuban las células que mueren para permitir la recuperación (Figura 1A). Aquí, la cuestión clave está abordando es hasta qué punto las células cultivadas que mueren individuales pueden progresar hacia la apoptosis y todavía s...

El término anástasis se refiere al fenómeno en el que las células moribundas revierten un proceso de suicidio celular en una etapa tardía, se reparan a sí mismas y, finalmente, sobreviven. Aquí demostramos protocolos para detectar y rastrear células que se someten a anastasis.

Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar y rastrear la reversión del proceso de muerte celular apoptótica y las células cultivadas mediante microscopía de células vivas. Las células sanas se diseminan en el sustrato y contienen mitocondrias filamentosas tubulares alrededor del núcleo. Sin embargo, cuando las células se suicidan a través de la apoptosis, las células moribundas muestran características morfológicas únicas para detectar y rastrear la reversión de la apoptosis.Las células se colocan en placas de cultivo celular con fondo de vidrio. El siguiente paso es realizar la tinción de células vivas para marcar las mitocondrias y los núcleos. Esto permite la detección de características morfológicas de células sanas y apoptóticas.Mediante microscopía de células vivas, las células sanas marcadas se exponen a un estímulo de muerte para inducir la apoptosis. Cuando se detecta la apoptosis, las células moribundas se lavan y luego se incuban con un medio de cultivo celular fresco para permitir la recuperación celular, las imágenes de células vivas se utilizan para detectar y rastrear la reversión de la apoptosis y sus consecuencias, como la reparación y la supervivencia c

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Investigación

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Biología

Se presenta un protocolo simple de visualizar regiones de la muerte celular programada (PCD) en embriones de ratón y diferenciadores madre embrionarias (ES) de cultivos de células utilizando un colorante altamente soluble llamada LysoTracker.

El uso de LysoTracker para detectar la muerte celular programada en embriones y la diferenciación de células madre embrionarias

Contribución del factor de remodelación de la cromatina ACF a la muerte celular inducida por E4orf4 se midió. El protocolo incluye la selección de clones de células en las que el tratamiento con doxiciclina induce desmontables condicional de la ACF subunidades Acf1 y SNF2h, y el uso del ensayo de DAPI para medir E4orf4 inducida por la muerte celular en las líneas celulares inducibles.

Preparación de líneas celulares de Derribo condicional de la expresión génica y la medición de los efectos desmontables en la muerte celular inducida por E4orf4

Este protocolo describe el uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir la absorción de la seguimiento temporal de las células que estaban en fase S en un punto específico en el tiempo. La adición de colorantes de ADN y el etiquetado de anticuerpos facilita el análisis detallado del destino de las células en fase S en épocas posteriores.

Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización

Anastasis es técnicamente difícil de detectar en vivo porque las células que se han invertido el proceso de muerte celular pueden ser morfológicamente indistinguibles de las células sanas normales. Aquí se describen los protocolos para la detección y seguimiento de las células que se someten a la anastasis en animales vivos mediante nuestro sistema de biosensor desarrollado recientemente en vivo CaspaseTracker.

Detección de Anastasis en Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de eventos de señalización intracelular inducidos en células viables por interacción física con células muertas o moribundas adyacentes. El protocolo se centra en los eventos de señalización inducidos por el reconocimiento de las células muertas mediado por receptores, en contraposición a su captación fagocítica o liberación de mediadores solubles.

Identificación de eventos de señalización intracelular inducida en células viables por la interacción con las células vecinas sometidos a la célula apoptótica de la muerte

Proyección de imagen de células vivas proporciona una riqueza de información en las células o poblaciones enteras que es inalcanzable por célula fija la proyección de imagen solamente. Aquí, se describen protocolos de células vivas para evaluar las decisiones de destino celular después del tratamiento con el fármaco anti-mitotic paclitaxel.

A largo plazo células vivas imágenes para evaluar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel

Aquí, presentamos un protocolo para aislar células de cáncer de mama apoptóticas clasificación celular activado por fluorescencia y más detectar la transición no potencia el cáncer de células de mama a Mama cáncer células madre células después de la revocación de la apoptosis por citometría de flujo.

Detección del flujo Cytometric recién formado cáncer similares a células madre de células de mama después de la revocación de la Apoptosis

El método presentado combina el análisis cuantitativo de las roturas de doble cadena de ADN (DSB), la distribución del ciclo celular y la apoptosis para permitir la evaluación específica del ciclo celular del Dsb de inducción y la reparación, así como las consecuencias de la falla de reparación.

Medición específica del ciclo celular de la éH2AX y la apoptosis después del estrés genotóxico por citometría de flujo

Este protocolo describe un método para la medición en tiempo real de los flujos de calcio mitocondrial de imagen fluorescente. El método se aprovecha de una circular permutaciones YFP basada en sensor de calcio de doble excitación radiométrica (radiométrica pericam-mt) expresa selectivamente en las mitocondrias.

Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados

Un método preciso para la evaluación de la muerte celular se describe. El protocolo de mejora sobre convencional anexina V / yoduro de propidio (PI) protocolos, que muestran hasta falsos positivos del 40% los eventos en las líneas celulares y células primarias de una amplia gama de modelos animales.

Modificado anexina V / yoduro de propidio ensayo Apoptosis una evaluación precisa de la muerte celular

Aprende a detectar y rastrear la anastasis en células mamíferas mediante microscopía de células vivas y biosensores. Este método permite observar la reversión de la apoptosis y sus consecuencias en la supervivencia celular.

Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis

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