Name: Un método para la detección y validación de mutaciones de resistencia contra la quinasa Inhibidores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Aprende a identificar y validar mutaciones de resistencia a inhibidores de quinasas mediante bibliotecas de mutación aleatoria y cribado in vitro. Este protocolo mejora el diseño de terapias oncológicas.

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Este estudio fue financiado por subvenciones a M.A. del NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) y la Fundación para la Investigación de la Leucemia. M.A. ha recibido el premio V-Scholar de la Fundación V-. Los autores están agradecidos a la Dra. Sara Rohrabaugh por la edición.

NOTA: Todos los procedimientos de este protocolo se llevaron a cabo de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud directrices para el tratamiento ético y cuidado de los animales, y de acuerdo con un protocolo de uso de los animales aprobado IACUC. Línea 1. Mantenimiento de la celda <ol><li> Cultura células BAF3 en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml y 100 mg / ml) y medio de cultivo gastado de las células Wehi. Se cultivan las células HEK293T en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml y 100 mg / mL). Mantener las células a 37 ° C en un ambiente humidificado contiene 5% de CO2. </li></ol> 2. Construcción de plásmidos <ol><li> Clonar el ratón JAK2 y su oncogénico isoforma JAK2 V617F-en pMSCV-puro-GW por LR Clonase usando el procedimiento de clonación de recombinación estándar. </li><li> Para la construcción del vector de expresión de luciferasa (pMSCV-Luc-cereza-GW) que se utiliza en el in-viimágenes vo, amplificar la luciferasa de pLVX-Tet-ON vector mediante PCR utilizando cebadores (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG y LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) siguieron con la clonación en pENTR-SD-TOPO para generar pENTR-Luc, que se utiliza para transferir el gen de la luciferasa en el vector retroviral, pMSCV-cereza-GW por recombinación mediada por clonación usando LR clonasa. </li></ol> 3. Preparación de Random Mutación Biblioteca, detección e identificación de las mutaciones 3.1) Random Mutagenesis <ol><li> Clon de longitud completa de JAK2 tipo salvaje y la mutación en pMSCV-puro-GW vector retroviral V617F utilizando una tecnología de clonación de recombinación comercial. </li><li> Utilice 1 g de ADN plásmido JAK2 V617F-transformar, XL-1 Rojo, E. coli células, lo que es defectuoso en los mecanismos de reparación del ADN lo que les permite incorporar mutaciones aleatorias durante la replicación. Más específicamente, mezclar 50 - 100 ng de ADN (más de 100 ng de ADN disminuye la eficiencia de transformación) con 100 l de células competentes en un tubo de polipropileno pre-enfriada y se incubaron en hielo durante 30 min, agitando suavemente cada 5 min. Para una buena cobertura de la biblioteca, utilice cinco y cincuenta y seis tubos de células competentes. NOTA: Más de 100 ng de ADN disminuye la eficiencia de transformación </li><li> Sumerja el tubo en un baño de agua a 42 ° C durante un choque térmico de 45 segundos e incubar en hielo durante 2 min. A continuación, añadir 1 ml de medio SOC (2,0% de triptona, extracto de levadura al 0,5%, 0,05% de NaCl, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, y 0,4% de D-glucosa). Incubar el tubo a 37 ° C con agitación a 225-250 rpm durante 90 min. </li><li> Células de la placa de cada tubo en cuatro placas de 10 cm de agar LB que contienen 100 mg / ml de ampicilina. Incubar las placas durante 16-24 horas a 37 ° C. </li><li> Después de colonias visibles, ellos recoger raspando las placas con un raspador de placa estéril. Piscina células de cada placa y el plásmido aislado de ADN usando un kit de extracción de plásmido comercial. NOTA: Por lo general, las colonias son más pequeños y toman 18-24 horas para servisible porque estos son cepas bacterianas de crecimiento lento. En esta etapa, evaluar la heterogeneidad de las mutaciones en la biblioteca por digestión de restricción con un cortador frecuentes, tales como Sau3A1 o Taq1 o secuenciación. </li></ol> 3.2) Producción de sobrenadantes retrovirales y la transducción <ol><li> Un día antes de la transfección, placa de 4 x 10 6 células HEK 293T sobre 100 cm de platos en DMEM que contenía 10% de FCS, penicilina / estreptomicina y 2 mM L-glutamina. </li><li> Al día siguiente, reemplace el medio y transfectar las células con mutagenized biblioteca pMSCV-JAK2-V617F. Para cada placa de 10 cm, mezclar 10 g de ADN (5 g de la biblioteca de plásmido y 5 g de plásmido de empaquetamiento retroviral, pCLEco) con 40 l de FuGENE a un volumen total de 400 l de suero utilizando medio DMEM libre. Incubar la mezcla de ADN y lípidos durante 20 min a temperatura ambiente. Después de 20 minutos añadir el complejo de abandono ADN lípidos sabio en la parte superior de las células HEK293T. </li><li> Después de seis horas, cambiar el medio de transfección wITH medio fresco y se incuban las placas durante 48 horas a 37 ° C para la producción de virus. Después de 48 horas de incubación, recoger los sobrenadantes virales filtrados a través de un filtro de 0,45 micras acrodisco. </li></ol> 3.3) La selección de clones resistentes in vitro <ol><li> Para mutantes resistentes JAK2 V617F-drogas, transducir 100 millones de células BAF3 con 100 ml de sobrenadantes de virus que tienen un título viral de 0,5-1 x10 6. Más específicamente, mezclar 10 8 células con 100 ml de sobrenadante de virus a un volumen total de 300 ml utilizando medio RPMI, conteniendo 10% de suero y 24 mg / ml de polyberene (concentración final de ployberene es de 8 mg / ml). Distribuir estos mezcladores de células en múltiples placas de seis pocillos (4-5 ml por pocillo). </li><li> Centrifugar las placas a 1250 xg durante 90 minutos a 25 ° C. Después de la centrifugación, se incuban las placas a 37 ° C durante 24 horas. </li><li> Al día siguiente, en común las células juntos y mezclar con ruxolitinib y medio con agar blando y chapada en six placas de pocillos. Para cada concentración de fármaco, mezclar 10 ml de células BAF3 transducidas (10-20 millones de células) con la cantidad apropiada de ruxolitinib en un tubo de 50 ml. Completar el volumen a 40 ml usando RPMI que contiene 20% de suero. Añadir 10 ml de 1,2% de agar a las células, mixcarefully y la placa en placas de seis pocillos. </li><li> Incubar las placas a 37 ° C durante dos semanas. Tome las colonias resistentes utilizando puntas de pipeta de 0,2 ml y subcultura individualmente en placas de 24 pocillos durante 3-4 días. </li><li> Recoger las células BAF3 resistentes por centrifugación a 450 xg durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aislar el ADN genómico usando un kit de aislamiento de ADN genómico comercial. PCR amplificar ADNc completo JAK2 de 100 ng de ADN utilizando cebadores genómicos (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG y mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) y largo plantilla ampliar los sistemas de PCR de alta fidelidad. </li><li> Separar los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Escindir el 3,4 kb de banda de ADN que representan JAK2 trama de codificación y aislar el ADNutilizando un kit de extracción de gel comercial. Secuencia de la longitud total de cDNA utilizando 8 cebadores internos (P1 - P8) que abarca la secuencia de codificación y analizar secuencias utilizando el software comercial. </li></ol> 4. En Vitro Validación de mutaciones resistentes Muchos clones de células llevan más de una mutación, Para probar la contribución de cada mutación en el fenotipo de resistencia, generar variantes seleccionadas por mutagénesis dirigida al sitio utilizando el plásmido pMSCV-JAK2V-617F como plantilla. <ol><li> Realizar mutagénesis dirigida al sitio en el plásmido pMSCV-JAK2-V617F utilizando un kit de mutagénesis comercial y oligonucleótidos diseñados para crear mutaciones puntuales. Confirmar la identidad de los clones mutantes por secuenciación. </li><li> Transducir células BAF3 con retrovirus hacen usando plásmidos mutantes seguidos con la selección utilizando puromicina de 1 g / ml. </li><li> Plate 10 4 células BAF3-JAK2-V617F (50 l de RPMI con 10% de FCS) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Separadoly añadir 50 l de los medios de comunicación ruxolitinib que contiene a los pozos a través de la placa (concentración final: 0, 1, 3, 5, 10 y 20 mM), e incubar las placas durante 60 horas a 37 ° C. </li><li> Evaluar la viabilidad celular mediante la adición de 10 l de reactivo WST-1 a cada pocillo seguido con incubación a 37 ° C durante 2-4 h. Absorbancia Record en A450 usando un lector de placas. Realizar todos los ensayos por triplicado y parcela promedio de absorbancia contra INCB018424 concentraciones. Realice una curva sigmoidal de ajuste óptimo usando un algoritmo de ajuste de curva no lineal. Puntuación de la concentración de fármaco resultante en la viabilidad celular 50% como el IC50 celular. </li><li> A continuación, la placa de seis millones de células que expresan variantes BAF3 JAK2 en placas de seis pocillos en medio RPMI que contenía 10% de suero con concentraciones crecientes de ruxolitinib y se incubaron durante 4-6 horas a 37 ° C. </li><li> Recoger las células por centrifugación a 450 g durante cinco minutos a 4 ° C. Lavar las células una vez con PBS, y se lisan en 20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50mM de NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, EDTA 5 mM, EGTA 1 mM, fluoruro de sodio 1 mM, 2 mM de sodio vanadato, y 5% de glicerol suplementado con inhibidores de cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa. Sonicar la suspensión de células durante 1 min seguido por adición de 5x tampón de carga de gel (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], DTT 500 mM, 15% de SDS, benzamidina 10 mM, EDTA 5 mM, 5 mM EGTA, 5 mM de sodio vanadato , cóctel de proteasa, 50% de glicerol, y 0,001% de azul de bromofenol) y desnaturalización a 70 ° C durante 5-10 min. </li><li> Resolver las proteínas en un gel de poliacrilamida SDS 8% en condiciones desnaturalizantes. Realizar inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal de ratón anti-phopsho STAT5. Pele los borrones y reprobed con un anticuerpo policlonal de conejo anti-SATA5. Visualice las bandas utilizando reactivos ECL según la recomendación del proveedor. </li></ol> 5. En Vivo Validación <ol><li> Transducir células BAF3 expresan luciferasa y cereza (transducidas con retrovirus hechos de pMSCV-Luc-cherry GW) con virus que expresan JAK2-V617F y variantes resistentes. Seleccionar las células que sobreviven a la selección de puromicina para la expresión de JAK2 y sus variantes de resistencia. </li><li> Inyectar dos millones de células en crecimiento activo / cereza BAF3-Luc llevan JAK2-V617F y sus variantes resistentes en 200 l de PBS a 6 ratones Balb / C a través de la inyección de la cola de la vena. </li><li> Después de tres días de trasplantes de células, inyectar a los ratones con ruxolitinib (100 mg / kg) dos veces al día durante dos semanas. </li><li> Realizar imágenes de bioluminiscencia basado en la luciferasa con un sistema de imagen. . <ol><li> En resumen, preparar la solución de luciferina por disolución de 300 mg a 25 ml de agua desionizada estéril, la alícuota en volúmenes más pequeños y tienda. NOTA: luciferina tienda a -80 ° C y protegido de la luz hasta su uso. </li><li> Inyectar 250 l a cada ratón por IP para alcanzar 125 mg / kg en cada ratón. Anestesiar a los ratones de un mismo grupo juntos utilizando isoflurano inhalado (1,5% -2,0%) en una caja sellada. Aplique un ungüento veterinario en el the ojo para prevenir la sequedad. NOTA: El tiempo necesario para que los ratones dormir (10-15 min) permitió la actividad luciferina a pico. Mantenga el tiempo constante entre los grupos para evitar la variación. </li></ol></li><li> Transferir los ratones inmediatamente a la etapa de cámara de imágenes y mantener la anestesia en el 1,5-2% isofluorano durante los procedimientos de imagen. Ratones imagen secuencial con 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60, y 300 segundos de exposición. Captura imágenes y cuantificar la intensidad de la bioluminiscencia usando adquisición de imágenes y software de análisis. Siguiendo imágenes devolver los ratones de nuevo a su jaula. </li><li> Para bonemarrow totales, células in vivo cosecha quimerismo. La eutanasia a los ratones con CO 2 durante 5 min seguido con dislocación cervical. Cosecha de los huesos y aplastar en 4 ml de PBS frío para recoger la médula ósea. Analizar las células positivas por ciento de cerezo bajo el microscopio de fluorescencia y cuantificar mediante FACS. Recoge veinte mil eventos de cada muestra. </li></ol>

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No se declaran conflictos de intereses.

El éxito clínico de imatinib en el tratamiento de la LMC demostró no sólo la posibilidad de dirigirse a las rouge quinasas por inhibidores de moléculas pequeñas, pero las limitaciones también al descubierto de la terapia dirigida: recaída clínica y la aparición de mutaciones de resistencia a fármacos en el gen diana. Identificación de mutaciones de resistencia ayuda a una mejor gestión clínica y el desarrollo de inhibidores de la próxima generación. Este protocolo describe una metodología para identificar las mutaciones...

Las proteínas quinasas son enzimas reguladoras clave de las vías de transducción de señales intracelulares que aparentemente modulan cada función celular. Un adecuado control de la señalización mediada por la quinasa es crucial para la homeostasis y el desarrollo, que se basa principalmente en una adecuada regulación de quinasas, fosfatasas y su degradación por UPS (sistema ubiquitina proteasoma). Quinasas desreguladas están en el centro del escenario de muchos tipos de cáncer e implicado en multitud de enfermedades humanas 1. Genoma humano codifica más de 500 proteínas quinasas que se han relacionado, directa o indirectamente, a ~ 400 enfermedades humanas 2. Estas observaciones apoyaron el concepto de focalización terapéutica de quinasas por los inhibidores de moléculas pequeñas de 3-5. La demostración de inhibidores de la quinasa ABL, tales como Imatinib, en el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (CML) proporcionó la prueba de concepto para este enfoque 6,7. Esta observación no solo revolucionó la hormigai-quinasa terapia, pero también hace cumplir la idea de identificar las lesiones genéticas en otras enfermedades neoplásicas para el enfoque terapéutico, que conducen al descubrimiento de mutaciones oncogénicas en el JAK2 de la policitemia vera (PV) y los pacientes con neoplasias mieloproliferativas (MPN). Este descubrimiento generó gran interés en el tratamiento de las MPN apuntando JAK2 con inhibidores de la quinasa de moléculas pequeñas. Ahora, casi una docena de inhibidores de JAK2 están en ensayos clínicos y uno de ellos ha sido aprobado recientemente para el tratamiento de la mielofibrosis. Si bien la orientación específica de quinasas oncogénicas por inhibidores de moléculas pequeñas en los cánceres traer resultados prometedores, que también sufre de desarrollar resistencia al tratamiento. De hecho, hasta ahora, los pacientes tratados con inhibidores de la quinasa, como Imatinib, Gefitinib, erlotinib y dasatinib desarrollaron mutaciones de resistencia en su mayoría mediante la adquisición de mutaciones en el dominio quinasa de qué fármaco se dirige a 08.10. Resistencia como resultado de la mutación del gen pone de relieve las limitaciones of dirigido monoterapia contra las quinasas oncogénicas, y representa el siguiente reto en el desarrollo de la quimioterapia del cáncer cada vez más éxito. Consecuencias mecánicas y funcionales de resistencia a los medicamentos deben proporcionar una justificación para la selección y el diseño de compuestos de cortesía para el desarrollo de fármacos. Las mutaciones identificadas a través de pantallas in vitro, han demostrado un alto grado de correlación con las que se encuentran en los pacientes. Por lo tanto, la detección in vitro de mutaciones que confieren resistencia a las drogas para un determinado objetivo pares de drogas en asistencias de desarrollo clínico o preclínico en la identificación de los patrones de resistencia que puedan causar la recaída clínica. La identificación de estas formas mutantes no sólo es útil en el seguimiento de los pacientes para la respuesta a los fármacos y la recaída, pero también es esencial para el diseño de inhibidores de próxima generación más robustos. Por ejemplo, el desarrollo de inhibidores de BCR / ABL de próxima generación, nilotinib y Ponatinib, fueron posibles debido a la mayor mecentendimientos hanistic ganaron de mutagénesis, estructurales y estudios funcionales. Anteriormente, hemos informado de los resultados de nuestra pantalla usando mutagénesis aleatoria de BCR / ABL para revelar el espectro de mutaciones que confieren resistencia a los inhibidores como el Imatinib 11,12, PD166326 12 y 13 AP24163. Los resultados no sólo identificaron las mutaciones que confieren resistencia y la enfermedad recaída clínica, sino que también proporcionan la comprensión mecanicista de la resistencia y de los principios que rigen la función quinasa 11,14 drogas. Aquí proporcionamos detalles metodológicos adicional, usando ruxolitinib y JAK2 como un par de objetivos farmacológicos, para permitir una aplicación más amplia de esta estrategia de cribado.

<table><tbody><tr><td>Cultivo de células y tejidos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células BaF3</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células HEK293T</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td><td>Un regalo de Ross Levine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C. GW</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F / L983F. GW</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F / P58A. GW</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-V617F-Cherry.GW</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-Luciferase-puro.GW</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biológico</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 1X</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Gibco (tecnologías de vida)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de protamina</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/ml stock en agua</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripán (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>INCB018424 (Ruxolitinib)</td><td>ChemieTeK</td><td>941678-49-5</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>filtro de disco de 0,45 micras</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr> colador de <tr><td>células de nailon de 70 micras</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo</td><td></td><td></td><td></td>bacteriano</tr><tr><td>XL-1 células rojas E. coli</td><td>Agilent Tech</td><td></td> 200129 <td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/ml solución madre&nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Excelente caldo</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Kit de sangre y tejidos</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Expandir sistema de PCR de plantilla larga</td><td>Roche</td><td>1168134001</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Sistema de limpieza de gel y PCR Sv</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Pure Yield Mini sistema de preparación de plásmidos</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de clonación de PCR con tecnología de puerta de enlace con pDONR 221 & OmniMAX 2 Células Competentes</td><td>Invitrogen</td><td>12535029</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&nbsp; Mezcla de enzimas clonasa LR&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos</td><td></td><td></td><td></td>de ratón</tr><tr><td>Vivo-Glo Luciferina in-vivo Grado</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 jeringa de insulina 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>mortero mortero</td><td>Coor tek&nbsp;</td><td>60316 y 60317</td><td></td></tr><tr><td>Isoflorane (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO serie 8000 WJ Incubadora de CO2</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de rotor de cangilón oscilante 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 contador de células automatizado</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>Esto no es necesario, se puede utilizar el hemocitometría estándar para el recuento de células</td></tr></tbody></table>

un método para la detección y validación de mutaciones de resistencia contra la quinasa inhibidores

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

El descubrimiento de BCR / ABL como un oncogén conductor en la leucemia mieloide crónica (CML) dio como resultado el desarrollo de Imatinib, que, de hecho, demostró el potencial de focalizar la quinasa en los cánceres por tratar eficazmente los pacientes con LMC. Esta observación revolucionó el desarrollo de fármacos para orientar las quinasas oncogénicas implicado en varios otros tumores malignos, tales como, EGFR, B-RAF, KIT y PDGFR. Sin embargo, una desventaja importante de las terapias anti-quinasa es la aparición de mutaciones de resistencia a fármacos que prestan el objetivo de haber reducido o perdido afinidad por la droga. La comprensión de los mecanismos empleados por variantes resistentes no sólo ayuda en el desarrollo de los inhibidores de la próxima generación, sino también da impulso a la gestión clínica usando la medicina personalizada. Nos informó de una estrategia de cribado retroviral vector basado para identificar el espectro de resistencia que confiere mutaciones en BCR / ABL, lo que ha ayudado en el desarrollo de la próxima generación de BCR / ABL inhibidores. Utilizando Ruxolitinib y JAK2 como un par de objetivos farmacológicos, aquí nos describen en los métodos de cribado in vitro que utiliza las células BAF3 ratón que expresan la biblioteca mutación aleatoria de JAK2 quinasa.

La aparición de mutaciones genéticas plantea un gran desafío para la terapia anti-quinasa específica. Mutacional estudios, además de proporcionar conocimientos sobre mecánica y funcionales que son instrumentales en la selección y el diseño de desarrollo de fármacos de nueva generación, que también permite una mejor gestión clínica y puedan en el futuro ser más útil para el tratamiento personalizado. En este experimento, se muestra la detección de mutaciones de resistencia ruxolitinib en JAK2 V617F-quinasa (Figur...

Aparición de resistencia genética contra la terapia con inhibidores de quinasa plantea reto significativo para la terapia del cáncer eficaz. Identificación y caracterización de mutaciones resistentes contra un fármaco recientemente desarrollado ayuda a una mejor gestión clínica y el diseño de fármacos de próxima generación. A continuación, describimos nuestro protocolo para la detección in vitro y la validación de las mutaciones resistentes.

Un método para la detección y validación de mutaciones de resistencia contra la quinasa Inhibidores

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar y validar las mutaciones resistentes a los fármacos. Esto se logra creando primero una biblioteca de mutaciones aleatorias del oncogén objetivo. El segundo paso es realizar un cribado in vitro para detectar la aparición de clones resistentes.El tercer paso del procedimiento es secuenciar los clones resistentes para identificar las mutaciones resistentes. El paso final es validar las mutaciones resistentes mediante la recreación de las mutaciones mediante mutagénesis dirigida al sitio, seguida de ensayos in vitro e in vivo. En última instancia, se pueden identificar mutaciones resistentes a los fármacos clínicamente relevantes frente a un determinado par de dianas farmacológicas.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los métodos basados en ENU o PCR, es que es imparcial y, a diferencia de METAGENE ssis basada en PCR, este no se limita a un tamaño del oncogén o al contenido de GC de ningún gen. Por lo general, los nuevos en esta técnica tendrán dificultades debido a la falta de conocimientos en biología molecular y celular. La demostración visual de este método es fundamental.Como la neogénesis

a-method-for-screening-validation-resistant-mutations-against-kinase

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Quinasa con repeticiones ricas en leucina 2 es una quinasa multidominio grandes, las mutaciones en el que son la causa genética más común de enfermedad de Parkinson. Análisis de la actividad quinasa de la proteína ha demostrado ser una herramienta crucial en la comprensión de la biología y la disfunción de esta proteína. En este...

Ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 In vitro</em

Resistencia a los medicamentos para terapias dirigidas es generalizada y la necesidad de identificar mecanismos de resistencia - antes o después de la aparición clínica - es fundamental para guiar las estrategias de gestión clínica alternativas. A continuación, presentamos un protocolo para acoplar derivación de líneas resistentes a los fármacos in vitro con la secuenciación para acelerar el descubrimiento de estos mecanismos.

Implementación de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga Resistencia Ensayos: Maximizar el Potencial de Descubrimiento clínicamente relevantes mecanismos de resistencia

La fosforilación de proteínas es una característica central de cómo las células interpretan y responden a la información en su entorno extracelular. Aquí, presentamos un protocolo de cribado de alto rendimiento que utiliza quinasas purificadas a partir de células de mamíferos para identificar rápidamente las quinasas que fosforilan un sustrato o sustratos de interés.

Identificación de los pares quinasa-sustrato Usando selección de alto rendimiento

Las proteínas quinasas son enzimas de señalización altamente evolucionadas y andamios que son críticos para la transducción de señales inter e intracelulares. Se presenta un protocolo para medir la actividad quinasa mediante el uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), un método fiable para ayudar a la elucidación de la regulación de señalización celular.

Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Los ensayos de competición de péptidos se usan ampliamente en una variedad de experimentos moleculares e inmunológicos. Este documento describe un método detallado para un ensayo de quinasa que compite con oligopéptido in vitro y los procedimientos de validación asociados, que pueden ser útiles para encontrar sitios de fosforilación específicos.

Ensayo de Competencia Oligopeptídica para la Determinación del Sitio de Fosforilación

Aquí, presentamos un protocolo para matrices de anticuerpo para identificar alteraciones en las vías de señalización en distintos modelos celulares. Estos cambios, causados por drogas/hipoxia/ultra-violet luz radiación, o sobreexpresión/downregulation/nocauts, son importantes para varios modelos de la enfermedad y pueden indicar si una terapia eficaz o puede identificar mecanismos de drogas resistencia.

Evaluación de la resistencia a inhibidores de la cinasa de tirosina por un interrogatorio de vías de transducción de señal por Arrays de anticuerpos

Aquí, describimos protocolos de validación genética y química de c-Fos y Dusp1 como una diana farmacológica en leucemia usando modelos de ratón humanizado y genética in vitro e in vivo. Este método puede ser aplicado a cualquier objetivo de validación genética y desarrollo terapéutico.

Métodos para evaluar el papel de c-Fos y Dusp1 en dependencia del oncogén

Este papel utiliza un ensayo basado en la citometría de flujo para las bibliotecas de la pantalla de inhibidores químicos para la identificación de los inhibidores y los objetivos que influyen en la del receptor de células T de señalización. Los métodos descritos aquí pueden ampliarse también para proyecciones de alto rendimiento.

Identificación de mediadores del Receptor de células T de señalización a través de la proyección de las bibliotecas del inhibidor químico

En este artículo, presentamos un conjunto de métodos prácticos y factibles para caracterizar mutantes relacionados con enfermedades de quinasas familiares de la RAF, que incluyen el ensayo de quinasa in vitro, el ensayo de coactivación de la RAF y el ensayo complementario de luciferasa dividida.

Caracterizar a los mutantes relacionados con enfermedades de los kinases familiares de la RAF mediante el uso de un conjunto de métodos prácticos y factibles

Se presenta un protocolo detallado para la generación de microarrays de proteínas humanas autoensamblados para el cribado de inhibidores de la quinasa.

Detección de inhibidores de la quinasa en microarrays de proteínas humanas autoensamblados

Aquí presentamos un protocolo para generar células quimioresistentes utilizando un enfoque de escalada de dosis, seguido de un cribado basado en CRISPR/Cas9 utilizando una biblioteca de sgRNA enfocada dirigida a modificadores epigenéticos para identificar reguladores de la quimiorresistencia adquirida. El protocolo también proporciona múltiples puntos de optimización adaptados a modelos celulares quimioresistentes, proporcionando un marco sólido para investigadores que investigan mecanismos de...

Cribados knockout a nivel epigenomico basados en CRISPR-Cas9 en células quimioresistentes

Aprende a identificar y validar mutaciones de resistencia a inhibidores de quinasas mediante bibliotecas de mutación aleatoria y cribado in vitro. Este protocolo mejora el diseño de terapias oncológicas.

Un método para la detección y validación de mutaciones de resistencia contra la quinasa Inhibidores

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