Un método para la detección y validación de mutaciones de resistencia contra la quinasa Inhibidores

El objetivo general de este procedimiento es identificar y validar las mutaciones resistentes a los fármacos. Esto se logra creando primero una biblioteca de mutaciones aleatorias del oncogén objetivo. El segundo paso es realizar un cribado in vitro para detectar la aparición de clones resistentes.

El tercer paso del procedimiento es secuenciar los clones resistentes para identificar las mutaciones resistentes. El paso final es validar las mutaciones resistentes mediante la recreación de las mutaciones mediante mutagénesis dirigida al sitio, seguida de ensayos in vitro e in vivo. En última instancia, se pueden identificar mutaciones resistentes a los fármacos clínicamente relevantes frente a un determinado par de dianas farmacológicas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los métodos basados en ENU o PCR, es que es imparcial y, a diferencia de METAGENE ssis basada en PCR, este no se limita a un tamaño del oncogén o al contenido de GC de ningún gen. Por lo general, los nuevos en esta técnica tendrán dificultades debido a la falta de conocimientos en biología molecular y celular. La demostración visual de este método es fundamental.

Como la neogénesis y los pasos de cribado son difíciles de aprender. Esto se debe a que muchas personas carecen de experiencia en la producción viral, en cultivos celulares y medios semicelulares. Este procedimiento comienza con la transformación de células XL una Red E coli con un plásmido portador de JAK dos V 617 f, una isoforma oncogénica de JAK dos células XL One Red E Coli que son defectuosas en los mecanismos de reparación del ADN, lo que les permite incorporar mutaciones aleatorias durante la replicación.

Mezcle de 50 a 100 nanogramos de ADN plasmídico con 100 microlitros de células competentes en un tubo de polipropileno preenfriado. No use más de 100 nanogramos de ADN porque disminuye la eficiencia de la transformación. Incube en hielo durante 30 minutos, agitando suavemente cada cinco minutos para una buena cobertura de la biblioteca.

Utilice de cuatro a seis tubos de células competentes. Sumerja los tubos de polipropileno en un baño de agua a 42 grados centígrados durante un choque térmico de 45 segundos y luego incube en hielo durante dos minutos. A continuación, agregue un mililitro de medio SOC a cada tubo.

Incubar los tubos a 37 grados centígrados mientras se agitan a 225 a 250 RPM durante 90 minutos. Celdas de placa en cuatro placas de barrena LB de 10 centímetros que contienen 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 16 a 24 horas.

Una vez que las colonias sean visibles, recójalas raspando las placas con un raspador de placas estéril. Agrupa las celdas de cada plato. Posteriormente, el ADN del plásmido se aísla utilizando un kit comercial de extracción de plásmidos y la heterogeneidad de las mutaciones en la biblioteca se evalúa mediante la secuenciación un día antes de la placa de transfección, cuatro veces 10 a la sexta célula T HEK 2 93, en placas de 100 milímetros en DM EM que contienen 10% de FCS, penicilina, estreptomicina y dos milimolares de L-glutamina.

Al día siguiente, prepare los reactivos de transfección para cada plato de 100 milímetros. Mezcle cinco microgramos de la biblioteca de plásmidos, cinco microgramos de un plásmido de empaquetamiento retroviral y 40 microlitros del gen FU hasta obtener un volumen total de 400 microlitros utilizando medios DM E EM libres de suero. Incubar la mezcla de ADN y lípidos durante 20 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, sustituya el medio de las células T HEK 2 93 por un medio fresco y añada el complejo lipídico de ADN gota a gota encima de las células. Incubar a 37 grados centígrados durante seis horas. Después de seis horas, reemplace el medio de transfección con medio fresco e incube las placas durante 48 horas a 37 grados Celsius por producción de virus.

Después de 48 horas de incubación, recoja los sobrenadantes virales filtrados a través de un filtro de disco acrobático de 0,45 micrómetros para comenzar el procedimiento de detección e identificación de los mutantes JAK dos V 607 F resistentes a los medicamentos. Mezcle 100 millones de BAF tres células con 100 mililitros de sobrenadante del virus hasta un volumen total de 300 mililitros utilizando medios RPMI que contengan un 10% de suero y policerebro. Distribuya esta mezcla de células y virus en múltiples placas de seis pocillos, llenando cada pocillo con cuatro a cinco mililitros.

Centrifugar las placas a 1, 250 GS durante 90 minutos a 37 grados centígrados. Después de la centrifugación, incubar las placas a 37 grados centígrados durante 24 horas al día siguiente, agrupar las células transducidas para cada concentración de fármaco. Mezcle 10 mililitros de células con ruxolitinib en un tubo de 50 mililitros.

Las concentraciones de ruxolitinib analizadas en este ejemplo son 1, 5, 2, 0,5 y 10 micromolares. Aumentar el volumen a 40 mililitros con RPMI que contiene un 20% de suero. Agregue 10 mililitros de barrena al 1,2% a las celdas y mezcle cuidadosamente la placa en seis placas de pocillos.

Dispensación de cuatro mililitros por pocillo. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante dos semanas. Una vez que las colonias resistentes sean visibles, utilice puntas de pipeta de 0,2 mililitros para recoger las colonias y subcultivarlas individualmente.

En placas de 24 pocillos durante tres o cuatro días, coseche las tres celdas resistentes de BAF por centrifugación a 450 GS durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de aislar el ADN genómico utilizando un kit comercial de extracción de ADN, amplifique el ADNC JAK dos de longitud completa del ADN genómico mediante PCR. A continuación, los productos de PCR se separan mediante electroforesis en gel de Agar Rose y la banda de ADN de 3,4 KILOBASES.

En representación del marco de dos recubrimientos JAK, se aísla utilizando un kit de extracción de gel comercial. Por último, secuenciar el ADNC de longitud completa utilizando ocho cebadores internos que abarcan la secuencia codificante y analizar las secuencias utilizando software comercial para validar las mutaciones resistentes a los fármacos. Las variantes seleccionadas in vitro se generan mediante mutagénesis dirigida al sitio de la secuencia JAK two V 617 F y se reintroducen en las células BAF tres.

Agregue 50 microlitros de medios que contengan varias concentraciones de ruxolitinib a los pocillos a través de la placa por separado, la placa 10 a la cuarta de las tres celdas BAF tres JAK dos V 617 F en cada pocillo de una placa de 96 pocillos incube las placas a 37 grados Celsius durante 60 horas Para evaluar la viabilidad de la celda, agregue 10 microlitros de WST, un reactivo a cada pocillo e incube a 37 grados Celsius durante dos a cuatro horas. Registre la absorbancia a 450 usando un lector de placas. Realice todos los ensayos por triplicado y trace la absorbancia media frente a las concentraciones de ruxolitinib.

Realice una curva sigmoidal de mejor ajuste utilizando una puntuación de algoritmo de ajuste de curva no lineal. La concentración del fármaco que da lugar a una viabilidad celular del 50% como IC 50 celular, posteriormente la validación in vivo de las mutaciones resistentes se realiza como se describe en el protocolo de texto adjunto. Dado que los clones de células resistentes generados por mutagénesis aleatoria pueden portar más de una mutación, estas mutaciones deben validarse de forma aislada mediante ensayos in vitro e in vivo.

En el ensayo in vitro, las variantes seleccionadas se generaron mediante mutagénesis dirigida al sitio de la secuencia JAK two V 607 F y se reintrodujeron en tres células BAF, que luego se midieron para determinar la capacidad de proliferación celular a diferentes dosis de ruxolitinib para evaluar los valores de IC 50. Además, se realizó inmunotransferencia para fosfotirosina o fosfoto STAT cinco en lisados de proteínas de células BF tres que se incubaron con dosis crecientes de ruxolitinib para descartar cualquier resistencia mediada por fuera del objetivo. Por lo tanto, se confirma que los mutantes que presentan valores mejorados de IC 50 y autofosforilación persistente a concentraciones más altas de ruxolitinib son variantes resistentes a los fármacos para validar la resistencia in vivo.

BF, se inyectaron tres células modificadas para expresar JAK, dos V, seis variantes de 17 F y luciferasa cherry en ratones, a los que posteriormente se les inyectó ruxolitinib durante dos semanas. Después de dos semanas. Se tomaron imágenes de los ratones para determinar la bioluminiscencia catalizada por luciferasa, el quimerismo de BAF tres en la médula ósea y el flujo sanguíneo periférico se evaluó midiendo la fluorescencia de las células cerezas positivas.

Los resultados muestran que los ratones que expresan JAK dos V 607 F son a ruxolitinib, mientras que las variantes resistentes muestran incrementos progresivos en la bioluminiscencia durante el período de tratamiento. Una vez dominada, la neogénesis aleatoria se puede realizar en cuatro o cinco días si se hace correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar una biblioteca de ADN de plásmido aleatorio para el cribado in vitro contra cualquier par de fármacos diana.

No olvide que trabajar con retrovirus puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.