Name: In vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprende el ensayo de metilación in vitro para estudiar la metilación de arginina en proteínas usando PRMTs marcados con epítopos. Este método permite determinar el estado de metilación de sustratos mediante SDS-PAGE y autoradiografía.

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Este estudio fue apoyado por un Premio al Mérito del Departamento de Asuntos de Veteranos de Estados Unidos, y un NIH conceder R01CA138528 a RW.

1 Preparación de construcciones de expresión <ol><li> Antes de comenzar el protocolo, PRMTs clones en vectores de expresión de mamífero con una etiqueta de epítopo N-terminal (Myc o HA), y el sustrato en marco con la glutatión-S-transferasa (GST) para la expresión de proteínas de alto nivel y purificación a partir de células bacterianas lisados, usando técnicas de biología molecular estándar. </li></ol> 2. Purificación de PRMTs <ol><li> Utilice 100 mm cultura platos para mantener las células epiteliales bronquiales humanas (Beas2B). Pasaje de las células cada 3 días y no dejarlos crecer hasta confluencia. </li><li> En el día antes de la transfección, las semillas 7,5 x 10 5 células en medio de cultivo de 10 ml en una placa de cultivo de 100 mm. Agitar para dispersar uniformemente las células, y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 humidificado 5%. </li><li> Al día siguiente, aspirar los medios de comunicación y añadir 5 ml de medio de cultivo sin suero y antibióticos. Agitar y aspirar el medio. Repita este paso unomás tiempo y, finalmente, añadir 5 ml de medio libre de suero / antibiótico y proceder a la transfección. </li><li> Diluir 6 g de ADN plásmido en 750 l de medio libre de suero en un tubo de centrífuga de plástico de 1,5 ml estéril. </li><li> En otro tubo de centrífuga de plástico de 1,5 ml, diluir 30 l de reactivo de transfección en 750 l de medio libre de suero. </li><li> Transferir la solución diluida reactivo de transfección (paso 2,5) al tubo que contiene el ADN diluido (paso 2.4). Mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces. </li><li> Incubar la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Después de 15 minutos, la mezcla de transfección pipetear suavemente sobre las células, remolino para mezclar uniformemente, y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 humidificado 5%. </li><li> Después de 3 horas, aspirar el medio que contiene mezclas de transfección de las células. Añadir medio de cultivo celular fresco suplementado con suero y antibióticos. </li><li> Se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2 humidificadoincubadora durante 48 horas. </li><li> Después de 48 h, la lisis de las células en 1 ml de tampón de lisis (1x solución salina tamponada con fosfato, 1% Nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato de sodio, 0,1% de dodecil sulfato de sodio, y 1 mg / ml phenlymethyl sulfonil fluoruro). Recoger los lisados ​​en un tubo de centrífuga de plástico con un levantador de células e incubar los lisados ​​en hielo durante 30 min. </li><li> Centrifugar los lisados ​​a 15.000 xg durante 10 min en una centrífuga de sobremesa para borrar los lisados ​​de restos celulares. [* Se recomienda confirmar la expresión de HA-PRMT1 través inmunotransferencia de una parte alícuota de los lisados ​​con anticuerpos anti-HA, antes de proceder a la purificación de las enzimas para ensayo de metilación.] </li><li> Para la purificación de PRMTs, incubar 3 mg de lisados ​​celulares con 30 l de 50:50 suspensión de matriz de afinidad anti-HA en tampón fosfato salino (PBS), y rotar durante la noche a 4 ° C en un rotador de tubo. </li><li> Al día siguiente, girar los tubos a 14.000 xg en una centrífuga de sobremesa durante 2 minutos para recogerlas perlas. Descartar el sobrenadante y lavar las perlas 3 veces con 1 ml de tampón RIPA [Tris 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM y 1% de Triton-X-100] en cada lavado seguido de centrifugación a 14.000 xg durante 2 min. Después del tercer lavado, lavar las perlas una vez con 100 l de tampón de metilación (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM de MgCl 2, 1 mM β-mercaptoetanol, sacarosa 100 mM). Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante. Las perlas que contienen los PRMTs inmovilizados están listos para ser utilizado en el ensayo de metilación. [* Se recomienda utilizar los PRMTs inmovilizados inmediatamente en el ensayo de metilación.] </li></ol> 3. Purificación de Sustrato <ol><li> Inocular una sola colonia de GST-G3BP1 transformó BL21 en 5 ml de medio Luria-Bertani (LB) que contenían 100 mg / ml de ampicilina. Crecer los cultivos durante la noche a 37 ° C con agitación a 250 rpm. </li><li> Al día siguiente, transferir el cultivo durante la noche a 50 ml de medio LB fresco y continue crezca a un OD 600 de 0,5-0,7 (tarda aproximadamente 2 horas). </li><li> Cuando el OD 600 alcanza 0,5-0,7, añadir isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM y continuar a la cultura de 4 horas adicionales a 37 ° C con agitación a 250 rpm. </li><li> Recoger las células por centrifugación a 1500 xg durante 10 minutos, y el proceso de la pastilla para la purificación GST o almacenar a -80 ° C. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento bacteriano en 5 ml de tampón de lisis (PBS 1x con inhibidores de proteasa, 100 g / ml de lisozima, y ​​0,1% de Triton-X-100) y se incuban los lisados ​​a 37 ° C durante 30 min. En este momento los lisados ​​aparecerá turbia y viscosa debido a la liberación de ADN genómico bacteriano. </li><li> Cortar el ADN genómico por tratamiento con ultrasonidos (10 pulsos de 1 seg cada uno con una amplitud de 30%). </li><li> Borrar los lisados ​​por centrifugación a 15.000 xg durante 10 min y transferir el sobrenadante transparente a un tubo de 15 ml. Si el sobrenadante no está claro repetir el centrifugación proceso una vez más. </li><li> Mientras tanto, lavar las perlas de sefarosa-GST dos veces con PBS enfriado con hielo y hacer una suspensión 50:50 de GST-sefarosa en PBS. Añadir 200 l de la suspensión GST-sefarosa al lisado celular bacteriana despejado y rotar a 4 ° C durante 1 hr. </li><li> Después de 1 hora, centrifugar los tubos a 500 xg durante 3 minutos para recoger las perlas. Lavar las perlas 3 veces con PBS frío hielo. </li><li> Después del lavado final, resuspender las perlas en 100 l de tampón de elución (50 mM Tris pH 8,0, NaCl 150 mM, glutatión 30 mM) y girar a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Centrifugar los tubos a 15.000 xg durante 2 min y transferir el sobrenadante que contiene la proteína purificada en otro tubo de centrífuga de plástico. Llevar a cabo la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) análisis sobre 5 l de la proteína purificada junto con cantidades conocidas de albúmina de suero bovino (BSA) para estimar la concentración de la proteína purificada. </li></ol> 4. metilación Ensayo NOTA: Realice los pasos siguientes en un área separada designada para el trabajo de radioisótopos y de acuerdo con los protocolos de la institución en la realización de experimentos con isótopos radiactivos. <ol><li> Añadir 2 g de GST-sustrato purificada y una mezcla maestra que contiene tampón de metilación 1x (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM de MgCl 2, 1 mM β-mercaptoetanol, sacarosa 100 mM), 1 Ci de S-adenosil- L-[metil-3H] metionina, y agua hasta un volumen final de 10 l a los PRMTs inmovilizados (paso 2,13) ​​y se incuba la reacción a 30 ° C durante 1 hr. </li><li> Después de 1 hora, detener la reacción mediante la adición de 10 l de tampón de muestra 2x SDS. Después de la desnaturalización de las muestras a 95 ° C durante 10 min, separar las muestras en un gel de SDS-PAGE. </li><li> Más tarde, transferir las proteínas separadas del gel de SDS sobre membrana de nitrocelulosa mediante el uso de una transferencia electroforética semi-seco. </li><li> Después de la transferencia, cubrir la membrana con unutofluor (un intensificador de imagen autorradiográfica), y el rock lento durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de 2 horas, verter la autofluor y conservar para su uso posterior. [* Etiquetar el tubo como material radiactivo] </li><li> Aire rápidamente se seque la membrana en un papel de filtro, sellar en una bolsa de plástico y exponer la membrana a una película de rayos X a -20 ° C. Tiempo de exposición suficiente oscila entre 5-30 días. </li></ol> 5. Confirmación de la expresión PRMT y la igualdad de carga de Sustrato <ol><li> Después de lograr exposiciones suficientes, transferir la membrana a una caja de plástico que contiene tampón de bloqueo [Tris-buffer salino con Tween-20 (TBST + leche descremada 3%)] y el rock suave durante 1 hora. </li><li> Deseche el tampón de bloqueo como residuos radiactivos. Incubar la membrana con anticuerpo anti-HA (dilución 1: 1.000) en TBST durante la noche a 4 ° C, con suave balanceo. </li><li> Lavar la membrana con TBST 3x e incubar la membrana con marcado con HRP anti-ratón anticuerpo secundario(1: 5000 dilución) en TBST a temperatura ambiente durante 1 h con agitación suave. </li><li> Después de 1 hora, lavar la membrana con TBST 3x, y realizar la detección de quimioluminiscencia de proteínas con un sustrato de HRP. </li><li> Después de la detección de los PRMTs HA-etiquetados, incubar la membrana con solución de tinción Ponseau-S durante 5 min a temperatura ambiente. Lavar rápidamente las 3x membrana con agua para detectar los sustratos GST-etiquetados. Escanear la imagen. </li></ol>

<ol><li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).</li>
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<li>Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation at a glance.</a> J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Mol Cell. 33, 1-13 (2009).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled3+is+a+novel+arginine+methyl+transferase+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate.</a> Scientific reports. 2, 805(2012).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+of+G3BP1+in+response+to+Wnt3a+regulates+%7Bbeta%7D-catenin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA.</a> J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a-stimulated+LRP6+phosphorylation+is+dependent+upon+arginine+methylation+of+G3BP2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2.</a> J Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+arginine+methylation+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of arginine methylation in transcription.</a> Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).</li>
<li>Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques in protein methylation.</a> Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).</li>
<li>Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+applied+to+the+study+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods applied to the study of protein arginine methylation.</a> Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).</li>
<li>Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+protein+arginine+methyltransferase+7+%28PRMT7%29+is+a+type+III+enzyme+forming+omega-NG-monomethylated+arginine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues.</a> J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito en el presente documento se utiliza rutinariamente para establecer el estado de metilación de los sustratos PRMT identificados. Este ensayo robusto y consistente también proporcionará evidencia definitiva de la especificidad de PRMTs para sus sustratos. Los componentes clave para el éxito de este ensayo son: 1. Expresión de PRMTs en células de mamífero, 2. Actividad de PRMTs purificados, 3. Expresión y purificación de sustrato, y 4. transferencia Western completa de las proteínas a la membrana de n...

Metilación de proteínas fue descrita por primera vez en 1968 1. No fue sino hasta la primera clonación de PRMT1 en 1996, que los investigadores comenzaron a apreciar la importancia de esta modificación después de la traducción 2. Curiosamente, alrededor del 2% de los residuos de arginina en las proteínas de extractos nucleares se metilado 3, lo que indica la abundancia de esta modificación. La arginina es un aminoácido cargado positivamente con una cadena lateral básica y el nitrógeno / s dentro de las cadenas laterales de arginina puede ser modificado después de la traducción a través de la adición de un grupo metilo, un proceso conocido como arginina metilación 4-6. Metilación de arginina es catalizada por una clase de enzimas viz., Transferasas proteína arginina metil (PRMTs). Argininas pueden o bien ser monometilado o dimetilado y el segundo pueden ser simétricos o asimétricos, dependiendo del tipo de PRMTs que catalizan el proceso de 4-6. Las proteínas que muestran argininamotivos ricos e-glicina son objetivos potenciales para la catálisis PRMT mediada. PRMT metilación mediada de sustratos se ha demostrado que modulan la interacción proteína-proteína, interacciones proteína-ácido nucleico, la función de proteínas, la expresión génica, y / o de señalización celular, todos los cuales son críticos para la homeostasis celular normal 7-9. Con el fin de entender el papel biológico de la proteína metilación de arginina, se requieren ensayos precisos, eficientes y reproducibles para establecer el estado de metilación de los sustratos PRMT identificados. En ensayo de metilación in vitro, que evalúa las capacidades de PRMTs purificadas para catalizar la metilación de sus sustratos, es un ensayo bien aceptado para el estudio de la metilación de arginina 10-12. El éxito general de este ensayo depende en gran medida de la actividad de los PRMTs purificados. PRMTs pueden ser expresadas y purificadas a partir de bacterias o células de mamífero, 10,11. Este ensayo de metilación in vitro, como detailed en la sección de protocolo, se basa en un método descrito originalmente por Tini y sus colegas 10. En este protocolo, se muestra en detalle los pasos necesarios para la expresión y purificación de PRMT1 en células de mamíferos. La capacidad de la PRMT1 purificada para catalizar la metilación en Ras GTPasa-activación de la proteína de unión a la proteína 1 (G3BP1), un sustrato conocido PRMT 8, más tarde fue evaluada en presencia de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina como el donante de metilo. Utilizando este ensayo, podemos definir con fiabilidad las habilidades de los PRMTs a la novela metilato o sustratos conocidos, que es un paso principal en el estudio de la metilación de arginina de proteínas.

<table><tbody><tr><td>S-adenosil-L-[metil-3H] metionina</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint ultra&nbsp;</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-270</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de tapa de botella</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-900</td><td></td></tr><tr><td>AutoFluor</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-315</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Viales de centelleo</td> National <td>Diagnostics</td><td>SKU:SVC-06</td><td></td></tr><tr><td>GST-sepharose</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutatión Reducido</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Beas2B</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>US-Biologicals</td> SDS Sigma Desoxicolato de <td></td><td></td></tr><tr><td>sodio</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> PMSF Sigma <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>matriz de afinidad anti-HA</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad gel doc</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-HA</td><td>roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponseau S</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Proteína arginina metilación es una de las más abundantes modificaciones post-traduccionales en el núcleo. Proteína arginina metilación se puede identificar y / o determina a través de enfoques proteómicos, y / o inmunotransferencia con anticuerpos específicos metil-arginina. Sin embargo, estas técnicas a veces pueden ser engañosas ya menudo proporcionan resultados positivos falsos. Más importante, estas técnicas no pueden proporcionar evidencia directa en apoyo de la especificidad de sustrato PRMT. Los ensayos in vitro de metilación, por otro lado, son ensayos bioquímicos útiles, que son sensibles, y consistentemente revelan si las proteínas identificadas son de hecho los sustratos PRMT. Un ensayo típico de metilación in vitro incluye, PRMTs activos purificados, sustrato purificado y marcado con un radioisótopo metil donante (S-adenosil-L-[metil-3H] metionina). Aquí se describe un protocolo de paso a paso para aislar PRMT1 catalíticamente activo, un miembro de la familia PRMT doquier expresó. El metransferasa actividades Thyl del PRMT1 purificada más tarde fueron probados en Ras-proteína activadora de GTPasa proteína de unión 1 (G3BP1), un sustrato PRMT conocido, en presencia de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina como donante de metilo. Este protocolo se puede emplear no sólo para establecer el estado de metilación de sustratos fisiológicos PRMT1 nuevos, sino también para la comprensión del mecanismo básico de la metilación de arginina de proteínas.

<html> Las habilidades de HA-PRMT1 de metilato de GST-G3BP1 se determinaron por un ensayo in vitro de metilación en. PRMT1 marcada con HA purificada a partir de lisados ​​de células Beas2B se empleó en una reacción de metilación que contiene GST-G3BP1, y 1 Ci de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina, como un donante de metilo. PRMT1 podría catalizar eficazmente la metilación de GST-G3BP1 (Figura 1, panel superior). Reacciones de metilación utilizando menús desplegables realizados...

Proteína arginina metilación, catalizada por una clase de enzimas viz., La proteína arginina metil transferasas (PRMTs), es el proceso de adición enzimática de grupo (s) metilo para argininas dentro de las proteínas. El ensayo de metilación in vitro es la herramienta más fiable para evaluar el estado de metilación de sustratos PRMT conocidos o nuevos.

In vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer el estado de metilación de la proteína arginina metiltransferasa o sustratos de PRMT. Esto se logra expresando primero PRT marcados con epítopos en células de mamíferos. A continuación, las P RMT se inmunoprecipitan a partir de los lisados celulares utilizando velocidades SRO recubiertas de antihemaglutinina o anti HA, seguidas de un lavado extenso para eliminar las proteínas no unidas específicamente.A continuación, las perlas lavadas se incuban con la proteína del sustrato purificada a partir de bacterias y tritio marcada con metionina L de caracol, o sam. Finalmente, se detiene la reacción y se determina el estado de metilación del sustrato mediante sulfato de sodio y siluro, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis de página SDS seguido de autorradiografía. En última instancia, la capacidad de las p RMTs para metilar el sustrato se determina comparando las reacciones de metilación mediante inmunoprecipitación realizadas en los lisados de células transfectadas de vector vacío y BRMT.Los abordajes proteómicos o la inmunotransferencia con anticuerpos específicos de metilarginina a veces pueden ser engañosos, a menudo proporcionando resultados postales falsos. Y lo que es más importante, no pueden proporcionar una evidencia directa que respalde la especificidad del sustrato PRMT. La principal ventaja del ensayo de metilación in vitro que demostraré en este video es que es sensible y revela consistentemente si las proteínas identificadas fueron sustratos de PRMT El día antes de la transfección sembraron 750.000 células epiteliales bronquiales humanas en 10 mililitros de medio de cultivo.En una placa de cultivo de 100 milímetros, agite la placa para dispersar uniformemente las células e incubar a 37 grados centígrados en una incubadora de CO2 humidificada al 5%. Al día siguiente, aspire el medio y agregue cinco mililitros de medio de cultivo sin suero y antibióticos, agite y aspire el medio. Repita este paso una vez más y finalmente agregue cinco mililitros de medio sérico libre de antibióticos, y proceda a la transfección.Para realizar la transfección, primero diluya seis microgramos de ADN plasmídico PRMT en 750 microlitros de medio libre de suero en un tubo de centrífuga de plástico estéril de 1,5 mililitros en otro tubo de centrífuga de plástico de 1,5 mililitros. Diluir 30 microlitros de reactivo de transfección en 750 microlitros de medio libre de suero. A continuación, transfiera la solución de reactivo de transfección diluida al tubo que contiene el ADN diluido mezclado suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.Incubar la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, pipetee suavemente la mezcla de transfección sobre las células y revuelva para mezclar uniformemente. Después de una incubación de tres horas a 37 grados centígrados, aspire el medio que contiene las mezclas de transfección de las células.A continuación, añada un medio de cultivo celular fresco suplementado con suero y antibióticos. Después de una incubación de 48 horas a 37 grados centígrados, las células de lyce en un mililitro de tampón de lisis. Recoja los lisados en un tubo de centrífuga de plástico con un elevador de celdas.A continuación, incubar los lisados en hielo durante 30 minutos. A continuación, centrifugar. Los lisados a 15.000 GS durante 10 minutos en una centrífuga de sobremesa.Para limpiar los lisados de los restos celulares para la purificación de P mts. Incubar tres miligramos de lisados celulares con 30 microlitros de una suspensión de 50 a 50 de matriz de afinidad anti HA en solución salina tamponada con fosfato. O PBS rota durante la noche a cuatro grados centígrados en un rotador de tubo.Al día siguiente, haga girar los tubos a 14.000 GS en una centrífuga de sobremesa durante dos minutos para recoger las perlas. Después de desechar el snat, lave las perlas con un mililitro de tampón RIPA seguido de una centrifugación como antes. Después de lavar las perlas tres veces con tampón RIPA, lavar las perlas una vez con 100 microlitros de tampón de metilación.Después de la centrifugación, retire el sobrenadante. Las perlas que contienen los p RMT inmovilizados están listas para ser utilizadas en el ensayo de metilación. Realice el ensayo de metilación en un área separada designada para radioisótopos.Trabajar en cumplimiento de los protocolos de la institución para el trabajo con isótopos radiactivos. Prepare glutatión purificado, s transferasa o sustrato GST como se describe en el protocolo de texto. Combine dos microgramos con una mezcla maestra que contenga un tampón de metilación x y micro curie de metionina L de caracol marcada con tridium.Añadir la mezcla a los p RMTs inmovilizados e incubar a 30 grados centígrados durante una hora. Después de una hora, detenga la reacción agregando 10 microlitros de dos XSDS. Tampón de muestras después de la desnaturalización de las muestras a 95 grados centígrados durante 10 minutos.Separe las muestras por página SDS más adelante. Transfiera las proteínas separadas del gel SDS a una membrana de nitrocelulosa mediante una transferencia electroforética semiseca. Después de la transferencia, cubra la membrana con una imagen autorradiográfica.Intensificar y mecer suavemente durante dos horas a temperatura ambiente Después de dos horas, vierta el intensificador y guárdelo para su uso posterior. Seque rápidamente la membrana al aire en un papel de filtro, séllela en una bolsa de plástico y exponga la membrana a una película de rayos X a menos 20 grados centígrados. Los tiempos de exposición suficientes oscilan entre cinco y 30 días.Después de lograr exposiciones suficientes, transfiera la membrana a una caja de plástico que contenga tampón de bloqueo y balancee suavemente durante una hora. Deseche el tampón de bloqueo como residuo radiactivo. A continuación, incubar la membrana con el anticuerpo anti HA en T tris, solución salina tamponada con tween 20, abreviada TBST durante la noche a cuatro grados centígrados con un suave balanceo al día siguiente.Lave la membrana con TBST tres veces. A continuación, incubar la membrana con peroxidasa de rábano picante marcada con anticuerpo secundario anti ratón en TBST a temperatura ambiente durante una hora con un balanceo suave. Después de lavar la membrana con TBST tres veces, realice la detección de quimioluminiscencia de proteínas con sustrato de peroxidasa de rábano picante después de la detección de HA tag P RMT.Incubar la membrana con la solución de tinción poncho S durante cinco minutos. A temperatura ambiente, lave rápidamente la membrana tres veces con agua antes de escanear la imagen. Para detectar los sustratos marcados con GST, se determinaron las capacidades de la marca HA PMT one para metilar GST marca G tres PP one mediante un ensayo de metilación in vitro.HA TAG prm T uno purificado a partir de célula B2B. Los lisados se emplearon en una reacción de metilación que contenía GSTG tres, BP uno y un micro curry de metionina de caracol L marcada con tritio. Como donante de metilo, p MT uno podría catalizar eficientemente la metilación de las reacciones de metilación de GS TG tres BP uno utilizando tirones realizados en lisados de vector vacío.Las células B2B transfectadas sirvieron como control negativo. La inmunotransferencia con anticuerpos anti HA confirmó la expresión de p rmt. A continuación, se utilizó una tinción de ponchos para demostrar la carga igual de GSTG tres BP uno en ambas reacciones.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de metilación in vitro.

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