El ensayo de formación de colonias en agar blando

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar el crecimiento independiente del anclaje celular. Esto se logra colocando primero una capa de agar en la placa de cultivo celular y permitiendo que se endurezca. El segundo paso es colocar una mezcla de células en agar sobre la capa de agar anterior.

A continuación, se permite que las células formen colonias durante un período de unas pocas semanas. El paso final es teñir las colonias para su visualización y cuantificación. En última instancia, el ensayo de formación de colonias de agar blando se utiliza para mostrar el crecimiento independiente de Anchorage como indicación de la transformación celular.

La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos, como el ensayo génico de Clon, es que el ensayo de formación de colonias de agar blando requiere que las células formen colonias de forma independiente de Anchorage. Comience el procedimiento marcando cada pocillo de un cultivo de tejido tratado. Placa de seis pocillos apropiadamente para cada línea celular o condición que se está investigando.

A continuación, prepare dos medios de cultivo Xcel disolviendo un gramo de medio en polvo y 0,2 gramos de bicarbonato de sodio en el agua desionizada hasta un volumen final de 50 mililitros. Pase este medio a través de un filtro de 0,2 micras. Agregue componentes adicionales necesarios para el cultivo normal de la línea celular de interés.

Por ejemplo, cultive la línea celular CMT 1 67 en medio RPMI 1640 suplementado con una solución de estreptomicina al 10% de FBS y penicilina al 1%. Caliente el medio a 37 grados centígrados en un baño de agua caliente antes de usar. Ahora prepare un medio de cultivo Xcel.

A continuación, prepare agar noble al 1% añadiendo un gramo de agar noble a 100 mililitros de agua desionizada. Después de eso, prepare agar noble al 0,6% agregando 0,6 gramos de agar noble a 100 mililitros de agua desionizada. A continuación, autoclave las mezclas de agar noble.

Posteriormente, haga una solución madre de cloruro de tetra oleum nitro azul nitro de un miligramo por mililitro en un XPBS con el fin de teñir las colonias. En este procedimiento, cocine en el microondas la botella de agar noble al 1% durante aproximadamente uno o dos minutos mientras se calienta en un microondas. Vigile la solución de cerca para evitar que hierva.

Luego continúe calentando y mezclando intermitentemente hasta que el agar se disuelva por completo y la solución esté clara. Después de eso, coloque la solución de agar derretida y el medio de cultivo Prewarm two x en una cubitera llena de 42 grados centígrados. Agua del grifo.

Además, coloque un tubo cónico de 50 mililitros en un soporte de tubo en la cubitera con agua caliente. A continuación, transfiera el cubo a la campana de cultivo celular. A continuación, añada seis mililitros de medio de cultivo y seis mililitros de la solución de agar noble al 1% al tubo cónico de 50 mililitros.

Pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar. Trabajar a un ritmo rápido evitará el endurecimiento prematuro del agar blando. A continuación, extraiga aproximadamente 5,5 mililitros de mezcla con una pipeta serológica de cinco mililitros.

Deje que las burbujas de aire suban hasta la parte superior de la columna de pipeta. A continuación, deposite 1,5 mililitros de la mezcla en cada pocillo y evite la deposición de burbujas de aire. Cubra la placa y deje que la mezcla de agar se solidifique en la campana de cultivo celular a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Primero, recoja las células con tripsina y dilúyalas de una a cinco en cultivo, medio en un tubo cónico de 15 mililitros. Cuente las celdas y calcule el número de celdas necesarias por pocillo para preparar una suspensión celular final en este momento. A continuación, derrita la solución de agar al 0,6% en un microondas.

Colóquelo en una cubitera que contenga agua caliente junto con un tubo cónico de 50 mililitros en un soporte de tubo y la suspensión de celda final. A continuación, transfiera la cubitera con agar 0,6% derretido a la campana de cultivo celular para los pasos siguientes. Para preparar un volumen total de 12 mililitros de suspensión celular para una placa de seis pocillos, primero pipetee seis mililitros de suspensión celular en el tubo cónico de 50 mililitros.

A continuación, añada seis mililitros de agar al 0,6% al tubo. Mantenga la mezcla a 42 grados centígrados para evitar el endurecimiento prematuro y maximizar la supervivencia celular. Después, pipetea la mezcla rápidamente, dos o tres veces para distribuir las células.

Extraiga 5,5 mililitros de mezcla con una pipeta serológica de cinco mililitros y permita que las burbujas de aire suban a la parte superior de la columna de pipeta. A continuación, deposita 1,5 mililitros de la mezcla en cada uno. Bueno, deje que la mezcla de agar celular se solidifique a temperatura ambiente en la campana de cultivo celular durante 30 minutos antes de colocarla en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 grados centígrados.

Agregue 100 microlitros de medio de crecimiento sobre la capa superior de agar dos veces por semana para prevenir la desecación y permita alrededor de 21 días para la formación adecuada de colonias. Para teñir las células, agregue 200 microlitros de solución de cloruro de tetra oleum nitro blue a cada pocillo e incube la placa durante la noche a 37 grados centígrados. Una vez que las colonias estén teñidas, tome fotografías de los pozos con el generador de imágenes y cuente las colonias con un software de análisis de imágenes.

Aquí se muestra el ensayo de formación de colonias de agar suave del vector que expresa las células CMT 1 67 LNCX LPC X y CMT 1 67 LL fue siete a nueve frizzled sobre las células que expresan. El vector que expresa las células CMT 1 67 L y CXL PC X y CMT 1 67 LL se encrespó siete veces. Nueve células sobreexpresadas se sembraron en un ensayo de formación de colonias de agar blando CMT 1 67 LL fueron siete células encrespadas, nueve células mostraron una marcada disminución en la formación de colonias después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del cáncer exploraran la transformación celular in vitro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar las células para el crecimiento independiente de Anchorage.