El cultivo de células de mamífero utilizando un solo uso Sistema Neumático biorreactor

El objetivo general de este procedimiento es cultivar grandes cantidades de células de mamíferos. Esto se logra calibrando primero el pH y el oxígeno disuelto o las sondas de dosificación, y luego esterilizando en autoclave el pH, las sondas de do y el manguito de la sonda de temperatura. El segundo paso es insertar las sondas y el manguito en el recipiente y colocar el recipiente en el biorreactor y conectar el escape, el filtro, las líneas de gas y la sonda de temperatura.

El siguiente paso es conectar los cables de OD y pH y conectar asépticamente el medio y los microportadores que se bombean al biorreactor. El paso final es poner en marcha los controladores para garantizar que el biorreactor alcance la velocidad del impulsor, la temperatura y la saturación de oxígeno deseadas. En última instancia, después de la inoculación y el monitoreo informático, el cultivo se puede procesar para la extracción y purificación del producto deseado.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el biorreactor de tanque de agitación reutilizable, es que el biorreactor de rueda de aire es fácil de usar y minimiza las posibilidades de contaminación microbiana. Empecemos. Para comenzar el protocolo, inicie sesión en la pantalla de saludo.

A continuación, inspeccione el sensor de pH y confirme que la punta del sensor esté llena de solución electrolítica. Obtenga un vaso de precipitados con solución de pH cuatro, otro vaso de precipitados con solución de pH siete y una botella de lavado con agua destilada. A continuación, conecte el cable de pH al sensor de pH.

Vaya a la pestaña de acciones en la interfaz de saludo, seleccione calibrar. A continuación, seleccione la pestaña PHA y la calibración de dos puntos. Introduzca la temperatura del tampón en el campo de temperatura de la solución de calibración.

Coloque el sensor en la solución de pH cuatro para calibrar Introduzca el valor en el campo cero. Una vez que el gráfico se estabilice, empuje, calibre y enjuague el sensor de pH con agua destilada. Repita la calibración para pH siete y guarde los ajustes.

Introduzca el valor de la zona de influencia en el campo span y espere a que el injerto se estabilice. Para comenzar con el oxígeno disuelto o hacer la calibración. Asegúrese de que el sensor de oxígeno disuelto haya estado conectado al sistema durante varias horas y se haya polarizado dentro de la pestaña de calibración, seleccione DOA y calibración de dos puntos.

Desconecte el sensor de oxígeno disuelto. Introduzca cero en la pestaña cero y espere hasta que el gráfico se estabilice. Antes de seleccionar calibrar uno, vuelva a conectar el sensor de oxígeno disuelto e introduzca 100 en el campo de intervalo.

Cuando el gráfico se estabilice, haga clic en calibrar dos. A continuación, guarde la configuración y cierre el programa. Después de la calibración, coloque los sensores y el pozo térmico en bolsas de autoclave y hágalo en autoclave durante 30 minutos a 121 grados Celsius y 15 PSI.

Una vez finalizado el autoclave, desinfecte las bolsas del autoclave con alcohol isopropílico al 70% y transfiera las bolsas a un gabinete de seguridad biológica o BSC. Desinfecte e introduzca el recipiente de reactivo en el BSC. Retire el embalaje interior e inspeccione el recipiente y la tubería en busca de daños.

A continuación, instale el sensor de OD en el puerto delantero izquierdo del recipiente de reactivo y el pozo térmico en el puerto trasero izquierdo. Instale el sensor de pH en el puerto frontal derecho para instalarlo. Abra la tapa del sensor y enrosque el sensor ligeramente en el puerto en la parte superior del recipiente.

A continuación, transfiera el buque fuera del BSC. Asegúrese de que los cables de los sensores de pH y OD estén fuera de la funda del recipiente y que no haya nada dentro de la funda. Sostenga el recipiente de modo que mire hacia el frente y deslice el recipiente con los pies primero en la manga.

Asegúrese de que el fondo del recipiente esté apoyado en los calentadores. A continuación, coloque con cuidado el sensor de temperatura en la térmica del recipiente. Pozo. A continuación, retire los juegos de tubos de la bolsa.

Haga coincidir el código de colores de la tubería con los conectores y bombas correspondientes de la unidad de control del biorreactor. Dirija las líneas de adición de medios y muestreo detrás del sensor de OD y la térmica. Bueno, inserte el tubo en la bomba codificada por colores en el lado izquierdo del biorreactor.

Conecte las líneas de gas principal y micro. Presione el conector de la línea de gas principal en su salida de gas para instalar la línea de gas principal. Luego gire el conector de la línea de micro gas en el sentido de las agujas del reloj en su salida de gas para instalar la línea de micro gas.

Para instalar el tubo del horno de filtro, abra el horno de filtro y asegure el tubo del filtro de escape al uan. Asegúrese de que el tubo pase a través de los dos ganchos hasta el filtro y salga del horno. Pase la línea inferior a través del gancho en la parte inferior del horno de filtro y cierre la puerta.

A continuación, conecte los cables a los sensores de oxígeno disuelto y pH. Una vez completada la instalación, forme una conexión estéril con accesorios de señuelo entre una línea de edición mediana no utilizada y la fuente de la bolsa de botella mediana. Vaya a la pestaña de acciones en la interfaz de Hello.

Haga clic en bombas de control, seleccione la bomba de medios y haga clic en el control deslizante para encender la bomba de medios. A continuación, añada de 1,5 a 3,0 litros de medio y haga clic en el control deslizante para apagar la bomba. El sistema ya está listo para bombear microportadores previamente preparados al reactor.

Estos se pueden agregar usando una línea de suma. Fije la botella MICROCAR a la línea de adición adecuada mediante un cierre de señuelo estéril. Encienda la bomba de adición dentro de la pantalla de la bomba de control.

Después de la adición de los micro portadores, apague la bomba con el control deslizante, vuelva a la pantalla principal en la interfaz de saludo, seleccione acciones y luego avanzado. Seleccione el controlador adecuado para editar la configuración. Configure los controladores en automático e ingrese los puntos de ajuste.

Después de configurar los controladores, encienda la bomba de aire. Mire dentro del recipiente de reactivo para asegurarse de que la rueda de aire esté girando. Asegúrese de que el sensor de oxígeno disuelto esté completamente polarizado y que el valor de oxígeno disuelto se haya estabilizado.

A continuación, calibre la forma del sensor de dos, una conexión estéril entre una línea de adición de medio no utilizada identificada por una banda naranja y la fuente de la bolsa de la botella de celda utilizando accesorios de señuelo. A continuación, instale la sección de silicona del tubo en la bomba de medios. Asegúrese de que la abrazadera de tubo esté abierta y que la abrazadera de tubo ramificado esté cerrada.

Vaya a la pestaña de la bomba de control y, a continuación, encienda la bomba de medios. Agregue las celdas y apague la bomba de medios. Después de la inoculación, vaya a la pestaña de acciones y seleccione tomar muestra.

Asegúrese de que el tubo de muestreo esté en la bomba de muestreo y manipule la llave de paso de muestreo de acuerdo con las instrucciones en pantalla. Retire la jeringa con la muestra para el recuento de células y otras aplicaciones posteriores realicen recuentos de células. Finalmente, cuando las células han alcanzado la densidad deseada de 1,2 por 10 a las seis células por mililitro, se añade sépticamente el inóculo del virus a una jeringa de 20 mililitros.

Conecte la jeringa a un puerto de adición de repuesto en el reactor. Use la pantalla de la bomba de control para encender la bomba de adición y agregar el inóculo del virus. La mayoría de las células A 5 49 se adhirieron a los microportadores en dos horas.

Después de 12 horas, las células mostraron signos de aplanamiento y propagación en la superficie del microcoche. A las 24 horas, los microportadores mostraron una distribución uniforme de las células. La colonización de microcoches ocurre rápidamente, como se demuestra aquí.

El porcentaje de colonización de microcoches por una 54 9 células es del 75% a las 24 horas. Este gráfico muestra el número de células viables a 54 9 en cultivo pre y post infección con adenovirus. Las células continúan creciendo exponencialmente a 1 millón de células por mililitro después de 48 horas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar y operar un biorreactor de rueda de aire para cultivar células de mamíferos a alta densidad para la producción celular o de proteínas. Gracias por mirar y mucha suerte con tus experimentos.