Name: El cultivo de células de mamífero utilizando un solo uso Sistema Neumático biorreactor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprende a cultivar células de mamífero utilizando un biorreactor neumático de un solo uso. Este protocolo detalla la calibración de sensores, ensamblaje estéril y control de parámetros para lograr un crecimiento celular eficiente con mínimo riesgo de contaminación.

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Este proyecto fue apoyado en parte por la Universidad Johns Hopkins, Oficina del Rector a través de la Iniciativa Científica Gateway.

1. Login <ol><li> Encienda el biorreactor. Haga clic en cualquier lugar para abrir la página de inicio de sesión. Seleccione el nombre de usuario y escriba la contraseña y haga clic en &quot;Iniciar sesión&quot;. </li></ol> 2. Calibración <ol><li> Calibrar sensor de pH (2 puntos antes de la esterilización en autoclave). </li><li> Inspeccione sensor de pH y confirme la punta del sensor se llena con solución electrolítica. Prepare dos vasos con soluciones de calibración pH (electrolitos) pH 4 y pH 7 y disponer de una botella de lavado con agua destilada. </li><li> Conectar el cable de pH para el sensor de pH. Vaya a la pestaña &quot;Acciones&quot; en la interfaz de Hola y haga clic en &quot;calibrar&quot;. Ingrese temperatura del tampón en el campo de temperatura solución de calibración. </li><li> Coloque el sensor de pH en tampón 1 (pH 4) e introduzca el valor en el campo &quot;cero&quot;. Espere a que el gráfico se estabilice y el clic en el botón &quot;calibrar 1&quot;. Enjuague el sensor de pH con agua destilada. </li><li> Coloque el sensor en tampón 2 (pH 7). Ingrese búfer2 valor en el campo &quot;span&quot;. Espere a que se estabilice el gráfico y haga clic en la calibración de 2 botones. </li><li> Haga clic en &quot;Guardar&quot; y luego haga clic en &quot;Cerrar&quot;. </li><li> Calibrar el sensor de oxígeno disuelto (OD). </li><li> Asegúrese de que el sensor de oxígeno se ha polarizado al ser conectado al sistema durante varias horas. Vaya a la pestaña &quot;Acciones&quot; en la interfaz de Hola y haga clic en Calibrar. Haga clic en el botón &quot;HACER A&quot;. </li><li> Desconecte el sensor de oxígeno y escriba 0 en el campo &quot;cero&quot;. Espere a que el gráfico se estabilice y el clic en el botón &quot;Calibrar 1&quot;. </li><li> Vuelva a conectar el sensor de oxígeno y escriba 100 en el campo &quot;Span&quot;. Espere a que el gráfico se estabilice y el clic en el botón &quot;Calibrar 2&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;Guardar&quot; y luego haga clic en &quot;cerrar&quot;. </li></ol> 3. Autoclave e instalación de sensores y recipientes de reactivos <ol><li> Después de la calibración, los sensores de lugar y así térmica en autocLave y bolsas de autoclave durante 30 min a 121 ° C, 15 psi. </li><li> Desinfectar las bolsas de autoclave con 70% alcohol isopropílico (IPA) y bolsas de transferencia a cabina de seguridad biológica (BSC). Retire el embalaje exterior del buque. </li><li> Desinfectar envase interior con un 70% de IPA y transferir buque cabina de seguridad biológica (BSC). Retire el embalaje interior e inspeccionar el buque y la tubería por los daños infligidos durante el envío. </li><li> Instale el pH y DO sensores en los dos puertos frontales. Instale el bienestar térmico en el puerto lateral izquierdo. Abra la tapa del sensor. </li><li> Guía del sensor a través del puerto del sensor. Pase el sensor firmemente en el puerto. </li><li> Transferencia recipiente de BSC. </li><li> Cuelgue la DO y cables de los sensores de pH fuera de la manga del vaso y compruebe que no hay nada en la manga. Deslice el recipiente dentro de la funda, los pies por delante. </li><li> Coloque con cuidado el sensor de temperatura en el pozo termal buque. Asegúrese de que el fondo del recipiente se apoya contra los calentadores. </li><li> Retirela tubería fija de sus bolsas. Partido codificación de color en el tubo a los conectores correspondientes y bombas en la unidad de control biorreactor. </li><li> Instale la línea de gas principal presionando el conector en su salida de gas. Instale la línea de gas micro girando el conector hacia la derecha en la salida de gas. Instale el tubo de filtro de escape: </li><li> Abrir la estufa filtro. Asegure el filtro de escape en el canal en U de modo que su tubo pasa por los dos ganchos al filtro y fuera del horno. </li><li> Instale el tubo de la bolsa de condensador en el soporte de la tubería. Cierre la puerta. </li><li> Ruta líneas adición de A y B, ambas líneas de comunicación, y la línea de cosecha detrás del sensor de oxígeno y en el banco junto a la unidad de control de bioreactor. </li><li> Conecte los cables a los sensores de oxígeno y pH. </li></ol> 4. Añadir medianas y micro-portadores <ol><li> Vaya a la pestaña &quot;acciones&quot; y haga clic en &quot;Control de Bombas&quot; en la interfaz de la computadora. </li><li> Formar un esterilizadorLe conexión entre una línea sin usar medio de adición (1 banda naranja) y la fuente de la botella / bolsa de medio por soldadura el tubo o el uso de accesorios Luer. </li><li> Haga clic en el control deslizante para encender la bomba de los medios de comunicación en. Haga clic en el control deslizante para activar los medios de comunicación de la bomba después de adición deseada cantidad de medio. </li><li> Coloque microportadoras cuentas en Ca 2 +, Mg 2 + PBS libre durante 3 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavar perlas varias veces con Ca 2 +, Mg 2 + PBS libre. </li><li> Autoclave durante 15 min a 115 ° C, 15 psi. NOTA: Añadir 3 g / L (peso en seco) en este experimento. </li><li> Bomba en micro-soportes que han sido hidratadas, lavados y esterilizados en autoclave en el reactor de la misma manera se añadió el medio en el paso 4.1. </li></ol> 5. de equilibrado y de un punto de calibración HACER <ol><li> Establecer los controladores a Automático e introducir los puntos de ajuste deseados. Aquí, utilice Agitación Set Point (SP) = 15 rpm, temperatura SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Espere a que el parámetros se equilibren. </li><li> Confirmar sensor es completamente polarizada. Confirmar DO valor actual se ha estabilizado. </li><li> Vaya a la pestaña &quot;Acciones&quot; y haga clic en &quot;calibrar&quot;. Haga clic en &quot;DO A&quot;, haga clic en &quot;One-punto&quot;. </li><li> Introduzca &quot;100&quot; en el campo &quot;Span&quot;. Haga clic en el botón &quot;Calibrar 1&quot;, haga clic en &quot;Guardar&quot; y haga clic en &quot;cerrar&quot;: </li></ol> 6. de iniciar una ejecución <ol><li> Vaya a la pestaña Acciones. Haga clic en &quot;lotes&quot;. Utilice el teclado en pantalla o un teclado externo para ingresar un nombre de lote de 16 caracteres o menos. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Ocultar&quot; del teclado en pantalla. Haga clic en &quot;Iniciar lote&quot; confirme haciendo clic en &quot;Inicio&quot; en la superposición. </li></ol> 7. inoculan con células <ol><li> Formar una conexión estéril entre un (banda naranja 1) línea de adición de medio sin usar y la botella de células / fuente bolsa por soldadurael tubo o el uso de los accesorios Luer. </li><li> Instale la sección de silicona de la tubería en la bomba de los medios de comunicación por lo que la flecha apunte hacia la tubería entre la bomba y el recipiente. </li><li> Compruebe pinza de la línea está abierta y su pinza de la línea ramificada está cerrado. Haga clic en el control deslizante para encender la bomba de los medios de comunicación en y haga clic en &quot;No&quot;, después de la adición de las células. </li><li> Vaya a la pestaña &quot;Acciones&quot; y haga clic en &quot;Bombas de control&quot;. </li></ol> 8. Muestreo <ol><li> Después de inocular y tan frecuentemente como se desee para controlar la cultura, extraer una muestra de la cultura de la siguiente manera: </li><li> Vaya a la pestaña &quot;acciones&quot; y haga clic en &quot;tomar la muestra&quot;. Coloque el tubo de muestreo en la bomba de muestreo y manipular la llave de paso de muestreo de acuerdo con las instrucciones de la pantalla. </li><li> Realizar al menos una observación microscópica diario y recuento de células en estas muestras. </li><li> Cuando las células han alcanzado la densidad deseada, en este cASE 1,2 x 10 6 células / ml, infectar las células con la adición de un inóculo de virus. </li><li> Agregar asépticamente el inóculo a una jeringa de 20 ml, y conectar la jeringa a uno de los puertos de adición de repuesto en el reactor. Introducir el inóculo en el reactor presionando en el émbolo de la jeringa. </li><li> Continuar el muestreo y el análisis de la cultura de la concentración de partículas intracelulares adenovirus. </li></ol>

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells+A+Manual+of+Basic+Techniques+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications</a>. , 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).</li>
<li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+Data+File+18-1140-62%22%5BJournal%5D)">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li>
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<li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSousa%2C+MF+%22Impact+of+Bioreactor+Design+on+the+Performance+of+Microcarrier+Cultures%22">Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures</a>. , 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).</li>
</ol>

Autores D. Giroux y Y. Hashimura son empleados de PBS Biotech que produce reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.

Este sistema de biorreactor de un solo uso es relativamente sencillo de usar y proporciona análisis en tiempo real para la monitorización y el análisis reactor. Está muy bien adecuado para el cultivo de células de mamíferos y de insectos con densidades celulares que llegan a más de 30 millones de células / ml. Además de las células A549 describen en este informe 11, hemos crecido SF-9 células de insectos en el biorreactor también. La mezcla suave proporcionado por la rueda de aire neumático reduce el daño celular. Varios pasos son críticos al establecer este reactor. Primera calibración, apropiado del pH y DO sensores es importante para la vigilancia óptima de la cultura y para la adición de reactivos para ajustar el pH o el oxígeno en el sistema. En segundo lugar, los frascos de reactivos y de semillas deben ser llenados y los accesorios Luer realizan en un ambiente estéril, como un BSC. Una vez que los frascos de reactivos se mueven fuera del ambiente estéril, las conexiones a las líneas de alimentación de biorreactores deben hacerse con cuidado para evitar la contaminación microbiana. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Si bien este sistema de biorreactor funciona bien para las líneas de células de mamíferos e insectos que no está diseñado para los cultivos bacterianos. El sistema no puede proporcionar la mezcla rápida y la oxigenación que se requiere para células bacterianas. El crecimiento bacteriano se realiza mejor en un biorreactor de tanque agitado. En comparación con otros biorreactores de un solo uso para el cultivo de células de mamífero o insecto, este sistema es fácil de usar, proporciona datos suficientes para el análisis de pistas, y tiene el crecimiento celular similar o mejor que el otro sistema de un solo uso que hemos evaluado. El uso único sistema biorreactor neumático tiene el potencial para satisfacer muchas de las investigaciones y aplicaciones clínicas en los campos de bioterapéuticos, vacunas, las células madre y la medicina personalizada 4. Además, la flexibilidad de este sistema permite por lotes, Fed-batch, la perfusión, y las aplicaciones de biorreactores de transfección basado 5. Por último, de un solo uso sistemas de biorreactores desechables tienen el potenciales para satisfacer las necesidades de la producción industrial a gran escala y para cumplir con las directrices y recomendaciones de los organismos reguladores nacionales e internacionales 10.6.

Líneas de células de mamíferos se pueden clasificar en una de tres categorías basadas en sus características de crecimiento: células que crecen en suspensión, las células que crecen en forma de agregados, y las células que crecen anclado a un sustrato. Aunque el biorreactor de aire de la rueda demostrado en este video es capaz de crecer los tres tipos de células, este video demostrará el uso del biorreactor para cultivar células dependientes de anclaje en micro-soportes. Células de mamíferos dependientes de anclaje pueden ser cultivadas con el propósito de producir más células - donde las propias células son el producto. Por ejemplo, las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana están siendo cultivadas con el propósito de recoger las células e inyectarlas en el tejido enfermo. El biorreactor neumático demostrado en este vídeo ha demostrado ser adecuado para la producción de dichas células madre mesenquimales para esta aplicación (Serra et al., Comunicación personal, 2013). Anchorage depcélulas de mamífero se cultivan típicamente endent pequeña escala en recipientes de cultivo 2D tales como placas de cultivo celular, frascos de cultivo de células, o botellas de rodillos, donde se adhieren a una superficie de crecimiento especialmente tratado 1. Cuando se desean más células, las placas o frascos se pueden ampliar mediante el uso de más o grandes vasos. Sin embargo, para un cultivo más rentable de grandes cantidades de células dependientes de anclaje, aumentando el área superficial para la fijación celular que se puede lograr mediante el uso de pequeñas perlas sólidas llamados micro-soportes. Dependiendo de las características de fijación de la célula, diferentes tipos de micro-soportes están disponibles comercialmente, tal como dextrano, un péptido, o colágeno recubierto. Micro-soportes tienen una gran área superficial a volumen que proporciona una mayor superficie para el crecimiento celular; y los micro-soportes se pueden mantener en suspensión con agitación, lo que permite que las células se cultivan a altas densidades en sistemas de biorreactores 2. Actualmente, los tipos de bioreactors donde las células adherentes se cultivan en micro-vehículos incluyen matraces rotativos y sistemas de tanque agitado, que utilizan hélices axiales para mantener la suspensión de las células recubierto micro-soportes. Varios factores son importantes para el cultivo con éxito de células, incluyendo la tensión de oxígeno, la tensión de cizallamiento, la matriz de superficie, y de nutrientes y las concentraciones de metabolitos. El uso de biorreactores permite la monitorización en tiempo real de las condiciones de crecimiento y el potencial de significativamente más bajos costos de producción 1. Hay varios diseños de biorreactores común para el cultivo in vitro de células incluyendo, suspensión agitada, recipiente de pared giratorio, de fibra hueca, la bolsa de biorreactor en una plataforma de balancín, y sistemas de lecho fluidizado 3. Muchos de estos sistemas presentan problemas únicos para el cultivo de células y la escala -up, tales como el alto costo, los gradientes de concentración de nutrientes, cizallamiento hidrodinámico, la agregación de células, y la dificultad en el muestreo, monitoreo y control de cell de escala. Varias líneas de células adherentes se utilizan en la producción de virus, ya sea en la producción de vacunas virales o para la producción de vectores virales para aplicaciones de terapia génica. En este video, usando el sencillo uso neumática (aire-ruedas) sistema de biorreactor, se demuestra la cultura de células de carcinoma de pulmón humano (A549) las células en micro-soportes para la producción de un adenovirus oncolítico. El diseño del biorreactor neumática utiliza una rueda de agitación vertical que es alimentado por la flotabilidad del gas burbujeado en la parte inferior del biorreactor. Este método de agitación suave limita las fuerzas de cizallamiento hidrodinámico, pero aún asegura medio y óptima de la célula de mezcla 4. En comparación con el reactor de tanque agitado, el reactor neumático tiene una baja tensión de cizallamiento, incluso con sistemas de biorreactor de aire de la rueda de alto volumen (Figura 1). En contraste con los biorreactores de tanque agitado, el impulsor vertical de este reactor único uso está activado por una corriente de burbujas de gas dentro deel recipiente, lo que permite suave y uniforme de mezcla medio (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>PBS 3&nbsp;</td>Ensamblaje <td>de</td> un solo uso PBS <td></td><td></td></tr><tr><td>Células de carcinoma de pulmón humano PBS</td><td></td><td></td> (A549)ATCC CCL-185 <td></td></tr><tr><td>DMEM Medio de alta glucosa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero</td><td></td><td></td><td></td>fetal bovino</tr><tr><td>Tripsina EDTA, 0.25%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 1 Microportadores</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiespumante C</td><td>Sigma</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

el cultivo de células de mamífero utilizando un solo uso sistema neumático biorreactor

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Los avances recientes en el cultivo y la ampliación de células madre y mamíferos han creado enormes oportunidades para nuevas innovaciones terapéuticas y de medicina personalizada. Sin embargo, traducir estos avances en aplicaciones terapéuticas requerirá sistemas in vitro que permitan sistemas de biorreactores robustos, flexibles y rentables. Hay varios sistemas de biorreactores que se utilizan actualmente en entornos comerciales y de investigación; Sin embargo, muchos de estos sistemas no son óptimos para establecer, expandir y monitorear el crecimiento de diferentes tipos de células. Los parámetros de cultivo más difíciles de controlar en estos sistemas incluyen minimizar el cizallamiento hidrodinámico, prevenir la formación de gradientes de nutrientes, establecer una aireación uniforme del medio de cultivo, prevenir la contaminación microbiana y monitorear y ajustar las condiciones de cultivo en tiempo real. Utilizando un sistema de biorreactor neumático de un solo uso, demostramos el montaje y el funcionamiento de este novedoso biorreactor para células de mamíferos cultivadas en microportadores. Este sistema de biorreactor elimina muchos de los desafíos asociados con los sistemas disponibles actualmente al minimizar el cizallamiento hidrodinámico y la formación de gradientes de nutrientes, y permitir una aireación uniforme del medio de cultivo. Además, el software del biorreactor permite el monitoreo remoto en tiempo real y el ajuste de los parámetros de funcionamiento del biorreactor. Este sistema de biorreactor también tiene un enorme potencial para el escalado de células de mamífero adherentes y en suspensión para la producción de una variedad de proteínas terapéuticas, anticuerpos monoclonales, células madre, biosimilares y vacunas.

En la Figura 3, se muestran los parámetros para el inicio de la carrera biorreactor. Esta figura muestra la pantalla antes de establecer los parámetros de temperatura, oxígeno disuelto, pH y agitación. Una vez que los parámetros se establecen, los parámetros de ejecución son monitoreados continuamente y se pueden hacer ajustes para mantener las condiciones requeridas. El software produce una lectura continua que permite una fácil identificación de problemas. En este experimento utilizando 2,5 L de DMEM que contenía 10% de FBS, 250 ppm de SAFC anti-espuma C, 2 mM L-glutamina y 3 g / L de micro-soportes, el sistema se estabiliza por lo que el porcentaje de oxígeno es 50%, el temperatura es 37 ° C, y el pH es 7,2. El reactor es inoculado con células A549 a una concentración de 7 x 10 4 células / ml (o 10 células / micro-portadoras). Los parámetros elegidos para esta ejecución resultaron en la mayoría de las células que se adhieren a los micro-soportes dentro de 2 horas (Figura 4). Después de 12 h, las células son demoniossignos trating de aplanamiento y la difusión en la superficie micro-portadora (Figura 5). Por 24 horas, micro-soportes tienen una distribución relativamente uniforme de las células, sin micro-soportes sin células y no hay grandes grupos de células en los micro-soportes (Figura 6). El porcentaje de colonización micro-portador por las células A549 es de 75% en 24 horas y el 90% a partir de entonces (Figura 7). Las células continuaron creciendo exponencialmente a ~ 1 millón de células / ml después de 48 horas (Figura 8). Después de la infección con una dosis de adenovirus oncolítico (2 x 10 8 viriones / ml) a 50 h, la densidad aumentó a 1.2 millones de células / ml y luego comenzó a disminuir a medida que la infección lítica progresó. Había ~ 10.000 amplificación pliegue del inóculo viral. En experimentos anteriores, se ha encontrado que el control y regulación del caudal de gas es crítica para maximizar el crecimiento celular (datos no publicados). El rápido crecimiento de las células pueden agotar el sistema de oxígeno con el nivel de OD de caer a cero. Mientras que las células continuaron creciendo, fue a un ritmo mucho más lento. Es crítico para controlar y ajustar el flujo de oxígeno para satisfacer las demandas celular durante la fase de crecimiento logarítmico. Cada serie se puede analizar para un óptimo crecimiento comparando el pH, DO, y la temperatura con recuentos de células diarias. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg"> Figura 1. Dinámica de Fluidos del sistema biorreactor neumático (PBS) en comparación con el tanque biorreactor Agitador medición de fuerzas de cizallamiento de pared en varios volúmenes de reactor. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg"> Figura 2. neumática Aire rueda impulsor reactor. 52008 / 52008fig3highres.jpg "/&gt; Figura 3. software de ruedas Aire neumático captura de pantalla de los parámetros para iniciar la carrera biorreactor. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg"> Figura 4. colonización Micro-portador con células A549 2 horas después de la inoculación. (Diámetro medio de micro-portador ~ 180 m.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg"> Figura 5. 12 horas después del inicio del cultivo, las células A549 están otorgando, aplanar, y la difusión en los micro-soportes.5highres.jpg "target =" _blank "&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg"> Figura 6: Micro-portadoras recubiertas con células después de 24 horas en la cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg"> Figura 7. Porcentaje de colonización micro-portadora por las células A549 después de la inoculación. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg"> Figura 8. El número de células A549 viables en cultivo antes y después de la infección con adenovirnosotros. Tenga en cuenta que el paso de la infección viral se produjo a las 50 h.

Utilizando un biorreactor neumático, demostramos el montaje, el funcionamiento y el rendimiento de este sistema de biorreactor de un solo uso para el crecimiento de células de mamíferos.

El cultivo de células de mamífero utilizando un solo uso Sistema Neumático biorreactor

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar grandes cantidades de células de mamíferos. Esto se logra calibrando primero el pH y el oxígeno disuelto o las sondas de dosificación, y luego esterilizando en autoclave el pH, las sondas de do y el manguito de la sonda de temperatura. El segundo paso es insertar las sondas y el manguito en el recipiente y colocar el recipiente en el biorreactor y conectar el escape, el filtro, las líneas de gas y la sonda de temperatura.El siguiente paso es conectar los cables de OD y pH y conectar asépticamente el medio y los microportadores que se bombean al biorreactor. El paso final es poner en marcha los controladores para garantizar que el biorreactor alcance la velocidad del impulsor, la temperatura y la saturación de oxígeno deseadas. En última instancia, después de la inoculación y el monitoreo informático, el cultivo se puede procesar para la extracción y purificación del producto deseado.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el biorreactor de tanque de agitación reutilizable, es que el biorreactor de rueda de aire es fácil de usar y minimiza las posibilidades de contaminación microbiana. Empecemos. Para comenzar el protocolo, inicie sesión en la pantalla de saludo.A continuación, inspeccione el sensor de pH y confirme que la punta del sensor esté llena de solución electrolítica. Obtenga un vaso de precipitados con solución de pH cuatro, otro vaso de precipitados con solución de pH siete y una botella de lavado con agua destilada. A continuación, conecte el cable de pH al sensor de pH.Vaya a la pestaña de acciones en la interfaz de saludo, seleccione calibrar. A continuación, seleccione la pestaña PHA y la calibración de dos puntos. Introduzca la temperatura del tampón en el campo de temperatura de la solución de calibración.Coloque el sensor en la solución de pH cuatro para calibrar Introduzca el valor en el campo cero. Una vez que el gráfico se estabilice, empuje, calibre y enjuague el sensor de pH con agua destilada. Repita la calibración para pH siete y guarde los ajustes.Introduzca el valor de la zona de influencia en el campo span y espere a que el injerto se estabilice. Para comenzar con el oxígeno disuelto o hacer la calibración. Asegúrese de que el sensor de oxígeno disuelto haya estado conectado al sistema durante varias horas y se haya polarizado dentro de la pestaña de calibración, seleccione DOA y calibración de dos puntos.Desconecte el sensor de oxígeno disuelto. Introduzca cero en la pestaña cero y espere hasta que el gráfico se estabilice. Antes de seleccionar calibrar uno, vuelva a conectar el sensor de oxígeno disuelto e introduzca 100 en el campo de intervalo.Cuando el gráfico se estabilice, haga clic en calibrar dos. A continuación, guarde la configuración y cierre el programa. Después de la calibración, coloque los sensores y el pozo térmico en bolsas de autoclave y hágalo en autoclave durante 30 minutos a 121 grados Celsius y 15 PSI.Una vez finalizado el autoclave, desinfecte las bolsas del autoclave con alcohol isopropílico al 70% y transfiera las bolsas a un gabinete de seguridad biológica o BSC. Desinfecte e introduzca el recipiente de reactivo en el BSC. Retire el embalaje interior e inspeccione el recipiente y la tubería en busca de daños.A continuación, instale el sensor de OD en el puerto delantero izquierdo del recipiente de reactivo y el pozo térmico en el puerto trasero izquierdo. Instale el sensor de pH en el puerto frontal derecho para instalarlo. Abra la tapa del sensor y enrosque el sensor ligeramente en el puerto en la parte superior del recipiente.A continuación, transfiera el buque fuera del BSC. Asegúrese de que los cables de los sensores de pH y OD estén fuera de la funda del recipiente y que no haya nada dentro de la funda. Sostenga el recipiente de modo que mire hacia el frente y deslice el recipiente con los pies primero en la manga.Asegúrese de que el fondo del recipiente esté apoyado en los calentadores. A continuación, coloque con cuidado el sensor de temperatura en la térmica del recipiente. Pozo. A continuación, retire los juegos de tubos de la bolsa.Haga coincidir el código de colores de la tubería con los conectores y bombas correspondientes de la unidad de control del biorreactor. Dirija las líneas de adición de medios y muestreo detrás del sensor de OD y la térmica. Bueno, inserte el tubo en la bomba codificada por colores en el lado izquierdo del biorreactor.Conecte las líneas de gas principal y micro. Presione el conector de la línea de gas principal en su salida de gas para instalar la línea de gas principal. Luego gire el conector de la línea de micro gas en el sentido de las agujas del reloj en su salida de gas para instalar la línea de micro gas.Para instalar el tubo del horno de filtro, abra el horno de filtro y asegure el tubo del filtro de escape al uan. Asegúrese de que el tubo pase a través de los dos ganchos hasta el filtro y salga del horno. Pase la línea inferior a través del gancho en la parte inferior del horno de filtro y cierre la puerta.A continuación, conecte los cables a los sensores de oxígeno disuelto y pH. Una vez completada la instalación, forme una conexión estéril con accesorios de señuelo entre una línea de edición mediana no utilizada y la fuente de la bolsa de botella mediana. Vaya a la pestaña de acciones en la interfaz de Hello.Haga clic en bombas de control, seleccione la bomba de medios y haga clic en el control deslizante para encender la bomba de medios. A continuación, añada de 1,5 a 3,0 litros de medio y haga clic en el control deslizante para apagar la bomba. El sistema ya está listo para bombear microportadores previamente preparados al reactor.Estos se pueden agregar usando una línea de suma. Fije la botella MICROCAR a la línea de adición adecuada mediante un cierre de señuelo estéril. Encienda la bomba de adición dentro de la pantalla de la bomba de control.Después de la adición de los micro portadores, apague la bomba con el control deslizante, vuelva a la pantalla principal en la interfaz de saludo, seleccione acciones y luego avanzado. Seleccione el controlador adecuado para editar la configuración. Configure los controladores en automático e ingrese los puntos de ajuste.Después de configurar los controladores, encienda la bomba de aire. Mire dentro del recipiente de reactivo para asegurarse de que la rueda de aire esté girando. Asegúrese de que el sensor de oxígeno disuelto esté completamente polarizado y que el valor de oxígeno disuelto se haya estabilizado.A continuación, calibre la forma del sensor de dos, una conexión estéril entre una línea de adición de medio no utilizada identificada por una banda naranja y la fuente de la bolsa de la botella de celda utilizando accesorios de señuelo. A continuación, instale la sección de silicona del tubo en la bomba de medios. Asegúrese de que la abrazadera de tubo esté abierta y que la abrazadera de tubo ramificado esté cerrada.Vaya a la pestaña de la bomba de control y, a continuación, encienda la bomba de medios. Agregue las celdas y apague la bomba de medios. Después de la inoculación, vaya a la pestaña de acciones y seleccione tomar muestra.Asegúrese de que el tubo de muestreo esté en la bomba de muestreo y manipule la llave de paso de muestreo de acuerdo con las instrucciones en pantalla. Retire la jeringa con la muestra para el recuento de células y otras aplicaciones posteriores realicen recuentos de células. Finalmente, cuando las células han alcanzado la densidad deseada de 1,2 por 10 a las seis células por mililitro, se añade sépticamente el inóculo del virus a una jeringa de 20 mililitros.Conecte la jeringa a un puerto de adición de repuesto en el reactor. Use la pantalla de la bomba de control para encender la bomba de adición y agregar el inóculo del virus. La mayoría de las células A 5 49 se adhirieron a los microportadores en dos horas.Después de 12 horas, las células mostraron signos de aplanamiento y propagación en la superficie del microcoche. A las 24 horas, los microportadores mostraron una distribución uniforme de las células. La colonización de microcoches ocurre rápidamente, como se demuestra aquí.El porcentaje de colonización de microcoches por una 54 9 células es del 75% a las 24 horas. Este gráfico muestra el número de células viables a 54 9 en cultivo pre y post infección con adenovirus. Las células continúan creciendo exponencialmente a 1 millón de células por mililitro después de 48 horas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar y operar un biorreactor de rueda de aire para cultivar células de mamíferos a alta densidad para la producción celular o de proteínas. Gracias por mirar y mucha suerte con tus experimentos.

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