Name: El aislamiento y uso de las Secciones de bovino mesentérica arteria y la vena como un bioensayo para la Prueba de Vasoactividad en el intestino delgado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a aislar arterias y venas mesentéricas bovinas para evaluar la vasoactividad de compuestos experimentales mediante multimiógrafo. Este bioensayo permite estudiar el flujo sanguíneo intestinal y la absorción de nutrientes.

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Los autores reconocen Ryan Chaplin y el Dr. Gregg Rentfrow de la Universidad de Kentucky Meats Lab y el Departamento de Ciencia Animal y de alimentos para proporcionar oportunidades para recoger tejidos experimentales utilizadas en este documento.

Los procedimientos utilizados en este estudio no requieren la aprobación de la Universidad de Kentucky Cuidado de Animales y el empleo Comisión porque no se utilizaron animales vivos. Antes de la recolección de cualquier muestra utilizada en este documento, todos los animales fueron aturdidos con perno cautivo y se desangraron. Esto se llevó a cabo en una instalación de matadero inspección federal en la Universidad de Kentucky. Un representante oficial de la Seguridad e Inspección de los Alimentos del USDA observó todas las actividades que se ocupan de los animales vivos y la manipulación de la canal. 1 Preparación de Instrumentación <ol><li> Para minimizar la cantidad de tiempo entre las colecciones de muestras de tejido para el inicio de un experimento, fije el equipo y preparar tampones antes de recoger el tejido experimental (o si el personal adicionales están disponibles, estas tareas pueden ocurrir simultáneamente). NOTA: Esto no sólo proporciona la mayor cantidad de tiempo que el tejido permanece viable para llevar a cabo experimentos, pero algunosexperimentos pueden correr durante largos períodos de tiempo (o si hay un deseo de completar múltiples experimentos en un día), por lo tanto, suele ser conveniente empezar tan pronto como sea posible. </li><li> Encienda el ordenador asociado, equipos adquisiciones de datos, baño de agua (para el tampón (s)) y myograph unidad (s). Coloque el equipo de calibración en la unidad (s) myograph y encienda el calor myograph (predefinido a 37,5 ° C) y permitir que las unidades y equipos de calibración para calentar para preestablecer las temperaturas. <ol><li> Abra un archivo de configuración de software gráfico creado anteriormente en el equipo y empezar una carrera (pero no la adquisición de datos). </li></ol></li><li> Caliente el equipo durante 10 minutos. <ol><li> Iniciar la adquisición de datos. </li><li> Cero todos los canales. </li><li> Compruebe, y llevar a cabo la calibración (si es necesario) en cada canal (4 canales por multimyograph) para estandarizar la señal eléctrica suministrada desde el transductor de fuerza respectiva asociada a ese canal a una fuerza de 2 g suministrada por un peso certificado. </li><li> Una vez completados calibración y una conversión de unidades, almacenar todos los datos posteriores como gramos. Cambie en consecuencia sobre la base de los deseos de cada laboratorio independiente; el equipo y el software permiten el uso de otras unidades, tales como miliNewtons y voltios. </li></ol></li><li> Asegúrese de que las líneas de gas están libres de obstrucciones y abra el suministro de gas (95% O 2/5% CO 2) a Myograph (s) unidades. Gas continuamente todos los tampones (en las cámaras Myograph) durante todo el procedimiento. </li><li> Rellene todas las cámaras Myograph con etanol al 70% y en remojo durante 10 minutos, retirar el etanol, y repita para un segundo 10 minutos en remojo. <ol><li> Tras eliminación del etanol, enjuáguese la boca tres veces con agua desionizada, seguido de tres lavados con tampón preparada (vea la Sección 2 para la preparación de buffer), dejando la tercera adición de tampón en las cámaras. NOTA: En este punto, el equipo puede permanecer inactivo en este estado hasta que se preparan búfer y el tejido y el personal está listo para proceder con los experiment. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de tampones <ol><li> Preparar una solución tampón de 1 L de Krebs-Henseleit para su uso en el transporte y procesamiento de muestras de tejido para alcanzar concentraciones finales de 11,1 mM de D-glucosa; 1.2 mM MgSO4; 1.2 mM KH 2 PO 4; KCl 4,7 mM; NaCl 118,1 mM; 3,4 mM CaCl 2; 24,9 mM NaHCO3. <ol><li> Mezclar 9,6 g de sales de Krebs en aproximadamente 900 ml de agua desionizada sobre una placa de agitación. </li><li> Mezclar en 0,373 g de cloruro de calcio deshidratado seguido de 2,1 g de bicarbonato de sodio por litro de tampón deseado. </li><li> Gas solución tampón durante 20 minutos con 95% de O2 / 5% de CO 2. </li><li> Después de gasificación, ajustar el pH a 7,05 (filtración de tampón aumenta el pH; pH objetivo final debe ser 7.4) y ajustar el volumen de 1 L. </li><li> Filtrar esterilizar tampón en una botella y almacén intermedio de medios 1 L autoclave limpio a 4 ° C hasta que esté listo para su uso. </li></ol></li><li> Preparar separada Krebs-Hsolución tampón enseleit para su uso en experimentos Myograph como se describe en el paso 2.1 para el transporte tampón de Krebs-Henseleit con compuestos adicionales que se refieren a los experimentos de la contractilidad. NOTA: Por lo general 2 L será suficiente para los experimentos descritos en este artículo, pero puede necesitar este volumen para aumentar o disminuir según la duración del experimento, el número de cámaras Myograph y reemplazos de amortiguamiento número (en relación con las adiciones de tratamiento). <ol><li> Antes de la etapa de gasificación (paso 2.1.3), añadir 9,1 mg (por L de tampón está preparado) de desipramina-HCl para amortiguar. </li><li> Preparar una solución de propranolol-HCl 1,0 M y añadir 1 ml (por L de tampón está preparado) de esta solución a la solución de tampón de Krebs-Henseleit. Hacer este tampón el día de uso y mantener a temperaturas Myograph operativo (una temperatura que produce una temperatura de 37,5 ° C en el myograph). NOTA: La desipramina se añade para inhibir los mecanismos selectivos de la recaptación de aminas biógenasy permitir la limpieza de adiciones experimentales de la memoria intermedia de baño de los vasos sanguíneos que se produzca más rápidamente. La adición de propranolol evita que la unión no específica de compuestos de tratamiento para β-adrenérgicos receptores. </li></ol></li></ol> 3. Recogida y preparación de la vasculatura <ol><li> Tan pronto como sea posible, retire el tracto gastrointestinal de la canal. Una vez que el animal ya no exhibe ningún reflejo involuntario, quitar la cabeza y ocultar y levante la carcasa verticalmente. La eliminación de las vísceras gastrointestinal (esófago hasta el ano) de la canal debe ser completado por el personal de matadero autorizado (&lt;20 min de tiempo de aturdimiento). NOTA: ¿Qué tan pronto, es generalmente limitada por la ubicación / instalación donde ésta se obtiene el tracto intestinal desde y procedimientos operativos estándar o procedimientos por mandato federal, seguidos por los personal de la instalación. <ol><li> En la mayoría de instalaciones, llevar a cabo manipulaciones del tracto gastrointestinalen un lugar separado de la transformación de la canal que está destinado a entrar en el suministro de alimentos. Utilice las inmediaciones conveniente que el tracto gastrointestinal se puede tomar y hacia fuera para su examen. </li></ol></li><li> Una vez que el tracto gastrointestinal se extendió a cabo, identificar el intestino delgado, el pliegue ileocecal que conecta el intestino delgado al intestino ciego, y la brida que se extiende ileal proximal al pliegue ileocecal (Figura 1A). <ol><li> Usando un bisturí o cuchillo, muy ligeramente hacer una incisión en la membrana mesentérica en el centro de la brida ileal. El uso de dos dedos índices, sin rodeos diseccionar la grasa y el tejido conectivo exponer la vasculatura mesentérica (Figura 1B). </li></ol></li><li> De esta brida o protuberancia en el mesenterio intestinal, diseccionar múltiples ramas (~ 2 cm de longitud) de los haces de la arteria y la vena mesentérica expuestos que apoyan esta porción del íleon (Figura 1C). <ol><li> Si ucantar unas pinzas para agarrar el tejido, tenga cuidado de no captar directa o tirar de los vasos sanguíneos en absoluto, mientras que la eliminación de ellos como cualquier tipo de estiramiento puede dañar y afectar negativamente el rendimiento de tejido 14. Eliminación de los vasos sanguíneos se realiza mejor, cortando a través de cada extremo de la sección que ser eliminado y luego cortar junto o en paralelo a la sección de ahora aislado. Para facilitar, eliminar parte del tejido circundante, junto con los vasos para proporcionar un poco de tejido para captar con un par de fórceps. </li><li> Con un par de pinzas, sumerja muestra de tejido en un tubo que contiene hielo frío tampón de Krebs-Henseleit y almacenar en hielo hasta el procesamiento puede ocurrir en el laboratorio. </li></ol></li><li> Coloque la muestra de tejido sobre una superficie de corte o en una placa de Petri y sumerja parcialmente en hielo frío de Krebs-Henseleit. <ol><li> Utilizando # 5 joyeros fórceps, tijeras iris Noyes, y de aumento de la lámpara o la disección de alcance (2,5 a magnificación 5.0X es suficiente), diseccionar cuidadosamente lejos la connecti grasa y rodeacinco tejidos y separar la arteria y la vena. La identificación de la abertura del recipiente en un extremo de la sección y comprender cuidadosamente la fascia que rodea el recipiente con los fórceps. </li><li> Hacer un corte con las tijeras paralela al recipiente deslizando la punta de la tijera debajo de la fascia elevada. Después de la incisión inicial, la grasa y los tejidos conectivos se pueden separar más lejos de la embarcación mediante la reducción de cada lado con las tijeras. Asegúrese de que los vasos son tan limpias como sea posible y reducir al mínimo la cantidad de tiempo que los buques pasan en el banquillo. </li><li> Volver vasos sanguíneos para tubos de fresco tampón de Krebs-Henseleit y se almacenan a 4 ° C (muestras pueden permanecer almacenado durante un máximo de 24 horas después de la recolección y todavía producir datos válidos de la contractilidad). </li><li> Utilizando una hoja de afeitar, buque rebanada que se utilizará en myograph en número deseado de secciones de 2 mm (que es útil usar una máquina de cortar el tejido para obtener secciones transversales consistentes). </li><li> Examine cada sección bajo un sco de disecciónpe (ampliación 12.5X) para asegurar que cada sección tiene ninguna anormalidad, ramas, válvulas, o daños superficiales inadvertidamente hecho durante la disección y la limpieza. Reemplazar la sección de recipiente de si hay alguna anormalidad, rama, válvula, o daño superficial. </li></ol></li><li> Secciones Tienda aceptables rodajas de buques (sumergidos en tampón Krebs-Henseleit) en hielo oa 4 ° C hasta que esté listo para el montaje en cámaras Myograph (generalmente &lt;30 min). </li><li> Montar suavemente el recipiente en la myograph mediante la inserción de los soportes a través del lumen y aumentar la tensión (utilizando el microposicionador en el myograph) teniendo cuidado de no estirar los vasos por encima de un 2 a 3 g lectura. </li><li> Una vez que todas las cámaras están cubiertos, aspire el búfer de todas las cámaras y vuelva a llenar con 5,0 ml de tampón y se iniciará un temporizador de 15 minutos para comenzar el período de equilibrio y el experimento. </li></ol> 4. Experimento <ol><li> Equilibrar todas las secciones de los vasos durante 1,5 horas para lograr una res establesting tensión de 1,0 g. <ol><li> Vuelva a colocar el tampón de incubación Krebs-Henseleit cada 15 min. </li><li> Durante el equilibrado, constantemente ajustar la tensión en las secciones de los vasos sanguíneos hasta 2 g y se deja relajar hasta aproximadamente 0,80 g. Trate de no permitir que los vasos se relajen demasiado (que pueden salirse de las monturas). Trate de lograr una tensión de línea de base estable, donde el buque tiene 1 g de tensión sin necesidad de ajuste. </li></ol></li><li> Durante el equilibrado, preparar una solución acuosa 1,32 M de KCl para ser utilizado como una referencia. </li><li> Tras la finalización de un equilibrio satisfactorio, añadir 500 l de la solución de KCl 1,32 M para dar lugar a una solución 0,12 M en la solución de 5,5 ml de bañar el recipiente. <ol><li> Después de la adición de la M KCl 1,32, no ajustar la tensión manualmente como la respuesta máxima de esta adición se utiliza para evaluar la viabilidad del tejido y se puede utilizar para normalizar los datos de tratamiento (por ejemplo, las respuestas a una concentración de ungonist). </li><li> Vuelva a colocar la memoria intermedia en intervalos de 15 minutos hasta que la tensión ha vuelto al valor basal de 1,0 g. </li></ol></li><li> Una vez que se alcanza la línea de base, cambiar el tampón y comenzar simultáneamente un temporizador de 1 min. Haga esto para todas las cámaras al mismo tiempo para evitar un escalonamiento de las horas de inicio. <ol><li> Vortex el estándar que se añade y preparar un comentario para cámara 1 durante la cuenta regresiva 1 min. </li><li> Añadir las normas en 25 ml de alícuotas a cada cámara como los dictados del experimento (esto mantiene el tratamiento por debajo del 0,5% del volumen total). </li><li> Cuando se ha añadido la última norma, iniciar un temporizador 9 min. </li><li> Al final de la incubación estándar de 9 min, eliminar el tampón que contiene el tratamiento de las cámaras y añadir 5,0 ml de tampón fresco, e iniciar el temporizador de 2,5 min. </li><li> Repita el paso 4.4.4. </li><li> Al final del segundo enjuague 2,5 minutos, aspirar las cámaras y añadir tampón nuevo, y comenzar un temporizador de 1 minuto la cuenta atrás del inicio de la segundad adición estándar. </li></ol></li><li> Continuar este ciclo para todos adiciones estándar del día. </li><li> Durante la adición norma final y la posterior incubación 9 min preparar el compuesto de referencia M KCl 1,32 para una final de la adición de dosis de referencia de ejecución de 500 l. </li><li> Tras el intervalo de 1 min después de la adición tratamiento final, añadir el KCl y iniciar un temporizador 9 min. NOTA: La adición de KCl es para confirmar la viabilidad del tejido a la conclusión del experimento y es útil si la administración de un tratamiento que resulta en respuesta insignificante. </li><li> Al concluir el 9 min de incubación compuesto de referencia final, aspire o eliminar el tampón de todas las cámaras. No añadir tampón fresco. Concluir el experimento. </li><li> Guarde el archivo gráfico, eliminar secciones de los vasos sanguíneos y disponer de forma adecuada, y seguir el protocolo de limpieza (proporcionado por el fabricante y pueden ser específicas de laboratorio) para el equipo myograph. </li></ol>

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<li>Egert, A. M., Kim, D. H., Schrick, F. N., Harmon, D. L., Klotz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+exposure+to+ergot+alkaloids+decreases+contractility+of+bovine+mesenteric+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+animal+science%22%5BJournal%5D)">Dietary exposure to ergot alkaloids decreases contractility of bovine mesenteric vasculature.</a> Journal of animal science. 92, 1768-1779 (2014).</li>
</ol>

La mención de su nombre comercial, producto patentado, o equipo especificado no constituye una garantía o garantía por el USDA y no implica la aprobación de la exclusión de otros productos que pueden estar disponibles.

El desafío inicial en el desarrollo de este bioensayo fue el establecimiento de un punto de recogida repetible para la vasculatura mesentérica. Consistencia sitio de la muestra es crítica, ya que algunas de las funciones del cambio del intestino delgado durante la progresión desde el yeyuno a través del íleon y en consecuencia el mesenterio varían en un patrón similar. Las ramas ileales de la arteria mesentérica y la vena son los más fácilmente identificados a través de puntos de referencia anatómicos. Al ubicar el cieg...

Las alteraciones en el flujo de sangre a un lecho de tejido pueden tener un gran impacto en la función del órgano. Una función principal del intestino delgado es la absorción de nutrientes. Se requiere el flujo de sangre arterial a la superficie de absorción del intestino para absorción aumenta y el flujo sanguíneo de nutrientes para ayudar en la absorción de nutrientes como la digesta se mueve a lo largo de la superficie 1. Una disminución en el flujo sanguíneo puede causar una reducción en la absorción de nutrientes debido a una disminución en el gradiente transepitelial 2. Además de los nutrientes, el intestino delgado también puede estar expuesto a metabolitos secundarios, drogas o toxinas que ejercen un efecto sobre el flujo de sangre localizada en el mesenterio. En el caso de que el animal rumiante, los compuestos pueden ser liberados de un pienso (por ejemplo, nutrientes tales como aminoácidos, o toxinas tales como alcaloides del cornezuelo del centeno) a través de procesos fermentativos del intestino anterior. Si estos compuestos sobreviven el metabolismo microbiano de la fermentación ruminal, que ahora están disponibles para la absorcióno la interacción a medida que viajan a través del tracto gastrointestinal del animal. Hay un número de diferentes métodos disponibles para medir el flujo sanguíneo in vivo (por ejemplo, el ultrasonido Doppler, medidores de flujo de sangre mora, microesferas radiomarcadas, y técnicas de indicador de dilución) que permiten la evaluación de diversos escenarios o tratamientos experimentales. Sin embargo, para obtener información con respecto a las propiedades mecánicas o farmacológicas de músculo liso vascular, los métodos fueron limitadas a los grandes buques hasta Mulvany y Halpern 3 publicaron un artículo que describe una técnica que utiliza alambre montado preparaciones anillo vascular en un myograph. Desde el desarrollo de esta técnica, las modificaciones se siguen realizando a los sistemas Myograph asociados que permiten una variedad de aplicaciones diferentes para la evaluación de las estructuras tubulares. El sistema también se ha adaptado para utilizar varillas fijas para el montaje de los buques más grandes 4, donde la perfusióntécnicas no son deseados. Debido a diferencias en los vasos de diferentes orígenes anatómicos y distinciones en los mismos buques de diferentes especies de animales, datos de buque y tipo de animal no puede ser fácilmente extrapolado a través de diferentes embarcaciones o el mismo recipiente en diferentes tipos de animales 5. En consecuencia, los bioensayos separados deben ser desarrollados y validados en cualquier momento se cambian estos aspectos. Recientemente, varios bioensayos se han desarrollado con estas tecnologías para el uso en el ganado lateral vena safena derecha y la arteria y la vena ruminal 6,7. Este bioensayo se desarrolló para investigar específicamente los efectos que tienen los alcaloides del ergot en la vasculatura de soporte del intestino delgado. Se informó de que el 50-60% de alcaloides alimentados aparece en el contenido del abomaso, pero sólo el 5% se recuperó en las heces 8. Strickland et al. 9 declaró en una revisión de los alcaloides del cornezuelo de centeno, que PV datos disponiblesest que el intestino delgado puede ser el sitio más importante para la absorción Ergopeptine. Eckert et al. 10 aspectos biofarmacéuticos crítica de alcaloides del cornezuelo de centeno y afirmaron que una vez que cruzan la barrera epitelial, alcaloides del cornezuelo de centeno se transporten, bien por el sistema linfático a la vena subclavia o por medio de la vena mesentérica y en la sangre portal. Rhodes et al. 11 reportó una disminución del flujo sanguíneo hacia el duodeno y el colon en novillos que consumen una (alta de alcaloides del cornezuelo de centeno) dieta alta endofito infectadas. Usando el bioensayo de la arteria y la vena ruminal derecho, Foote et al. 12 demostraron que los alcaloides del ergot son vasoactivos en la vasculatura ruminal. Foote et al. 13 posteriormente demostraron in vivo que la exposición a los alcaloides del cornezuelo de centeno ruminal resultados en un rumen disminución del flujo sanguíneo epitelial. Esta disminución en el flujo sanguíneo a la superficie de absorción del rumen de forma concomitante causó una reducción en nutrientes (ácidos grasos volátiles) de flujo. Dada la quantity de alcaloides del cornezuelo de centeno que pasan en el intestino delgado del intestino anterior; se planteó la hipótesis de que se produzca un efecto similar en la pequeña vasculatura intestinal y la absorción de nutrientes. Esto requirió el desarrollo de la bioensayo arteria mesentérica y vena ileal proximal bovina.

<table><tbody><tr><td>Multi Myograph</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>610M</td><td>Un miógrafo es fundamental para este bioensayo, pero hay otras plataformas disponibles para su uso que serán suficientes.</td></tr><tr><td>Powerlab 8/sp</td><td>ADIntrumentos</td><td>ML785</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 7</td><td>ADInstrumentos</td><td>Versión 7</td><td></td></tr><tr><td>Kit de calibración de fuerza</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>100055</td><td>específico para micógrafos DMT</td></tr><tr><td>Filtro de tapa de botella</td><td>Nalgene</td><td>595-4520</td><td>0.22 &#956; m tamaño de los poros; Talla de cuello de 45 mm</td></tr><tr><td>#5 Jewler' Pinzas</td><td>Miltex</td><td>555008FT</td><td>Se puede utilizar cualquier marca de pinzas</td></tr><tr><td>Noyes Tijeras de iris</td><td>Miltex</td><td>18-1510</td><td>Se puede utilizar cualquier marca de tijeras</td></tr><tr><td>Visor de disección</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Cualquier marca de microscopio óptico de disección será suficiente</td></tr><tr><td>Matrices de tejido ajustables</td><td>Braintree Scientific</td><td>TM C12</td><td>Esto no es crítico para el ensayo, pero reduce en gran medida la variación de longitud de sección a sección y acelera en gran medida el proceso de corte</td></tr><tr><td>Krebs-Hensleit Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3753-10x1L</td><td>No es necesario comprar Krebs, esto se puede hacer en casa</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio deshidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Desipramina-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3900-5G</td><td></td></tr><tr><td>Propranolol-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0884-1G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2</td><td>Scott Gross</td><td>UN3156</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento y uso de las secciones de bovino mesentérica arteria y la vena como un bioensayo para la prueba de vasoactividad en el intestino delgado

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Sistemas digestivo de los mamíferos están constantemente expuestos a compuestos (deseables e indeseables) que pueden tener un efecto sobre el flujo de sangre hacia y desde ese sistema. Los cambios en el flujo de sangre al intestino delgado puede resultar en efectos en las funciones de absorción del órgano. Especial interés en las toxinas liberadas de los piensos a través de procesos fermentativos y digestivos en rumiantes ha desarrollado como un área donde las eficiencias productivas se podrían mejorar. El vídeo asociado con este artículo se describe un bioensayo in vitro desarrollado para seleccionar compuestos para vasoactividad en aislados secciones transversales de la arteria mesentérica bovina y la vena utilizando un multimyograph. Una vez que los vasos sanguíneos se montan y se equilibraron en el myograph, el propio bioensayo se puede utilizar: como una herramienta de detección para evaluar la respuesta contráctil o vasoactividad de compuestos de interés; determinar la presencia de tipos de receptores por la orientación farmacológicamente receptores con agonista específicos; determinar el papel de un receptor con la presencia de uno o más antagonistas; o determinar las posibles interacciones de los compuestos de interés con los antagonistas. A través de todo esto, se recogen datos en tiempo real, el tejido recogido de un solo animal puede ser expuesto a un gran número de diferentes tratamientos experimentales (una ventaja in vitro), y representa la vasculatura a cada lado de la cama capilar para proporcionar una precisa imagen de lo que podría estar sucediendo en la aferente y eferente suministro de sangre apoyar el intestino delgado.

Los vasos sanguíneos que se usa para generar los resultados incluidos se obtuvieron de 6 novillos Holstein (425 ± 8 kg) dentro de un intervalo de 3 semanas. Un ejemplo de un típico mesentérica respuesta contráctil a KCl vena y adiciones crecientes de tratamiento en la concentración se presenta en la Figura 2. La magnitud de la respuesta variará algunos con el tamaño de la embarcación (correlacionada con el tamaño del animal donante), pero puede también ser influido (negativamente) por un manejo inadecua...

El intestino delgado se expone frecuentemente a las toxinas que pueden influir en el flujo sanguíneo y afectar negativamente a la absorción de nutrientes. El uso de una arteria multimyograph y mesentérica y la vena aislados, compuestos o toxinas de interés puede ser examinado para vasoactividad.

El aislamiento y uso de las Secciones de bovino mesentérica arteria y la vena como un bioensayo para la Prueba de Vasoactividad en el intestino delgado

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar secciones transversales de arterias y venas mesentéricas bovinas en un gráfico múltiple para permitir la detección de compuestos experimentales para su actividad vasológica. Esto se logra recolectando primero una muestra de tejido mesentérico del animal. En el segundo paso, se limpia la muestra y se seccionan los recipientes.A continuación, las secciones se montan y equilibran en el mioinjerto. En el paso final, los vasos aislados se exponen a los compuestos de interés. En última instancia, este bioensayo de arterias y venas se puede utilizar para evaluar la actividad vasológica de los compuestos y los efectos que tienen sobre el flujo sanguíneo dentro de los vasos sanguíneos mesentéricos bovinos.La principal ventaja de esta técnica en comparación con los métodos existentes, como la medición del flujo sanguíneo in vivo, es que con esta técnica, el tejido de un solo animal puede exponerse a múltiples compuestos simultáneamente. Aunque este método puede proporcionar información sobre síndromes animales muy específicos que pueden causar vasoconstricción como la festuca, la toxicosis o el ergotismo, también se puede aplicar a otros escenarios que pueden ser de interés para los investigadores, como los productos farmacéuticos que se están desarrollando o los productos naturales. Además, también podría aplicarse no solo a la vasculatura del ganado, sino también a la vasculatura de cualquier otra especie de mamífero.Después de extraer los vasos sanguíneos del tejido mesentérico, use un par de pinzas para colocar la muestra de tejido en una superficie de corte y sumérjala parcialmente en un tampón crebs henzel aite helado. Luego, usando el número cinco de joyería, fórceps y ruido, las tijeras Iris diseccionan cuidadosamente la grasa y los tejidos conectivos que rodean los vasos. Después de separar la arteria y la vena, identifique la abertura del vaso en un extremo de la sección y sujete cuidadosamente la fascia que rodea el vaso con las pinzas.Luego, deslice la punta de las tijeras por debajo de la fascia elevada para hacer un corte con las tijeras paralelas al recipiente. Después de la incisión inicial, corte cada lado del vaso para separar aún más la grasa y los tejidos conectivos, y para limpiar el vaso. Coloque los vasos sanguíneos limpios en un tubo nuevo de tampón de luz Henzel de Krebs y almacene el tubo a cuatro grados centígrados durante un máximo de 24 horas.Cuando esté listo, utilice un cortador de pañuelos para obtener secciones transversales consistentes del recipiente de interés en el número deseado de secciones de dos milímetros, y luego examine cada sección con un aumento de 12,5 x para asegurarse de que cada muestra no tenga anomalías, ramas, válvulas o daños superficiales adquiridos durante el proceso de disección y limpieza. Almacene las secciones aceptables del recipiente en rodajas sumergidas en el tampón ligero Henzel de Krebs a cuatro grados centígrados durante un máximo de 30 minutos. A continuación, inserte suavemente los soportes a través del lumen de cada muestra y utilice el microposicionador del injerto myo para aumentar gradualmente la tensión y montar el vaso en el mioinjerto.Tenga cuidado de no estirar los vasos por encima de una lectura de dos a tres gramos. Una vez que todas las cámaras estén cubiertas, aspire el tampón de cada cámara y vuelva a llenarlas con cinco mililitros de tampón fresco. Después de que todas las secciones del recipiente se hayan equilibrado durante 1,5 horas para lograr una tensión de reposo estable de un gramo a 500 microlitros de cloruro de potasio 1,32 molar a una concentración final de 0,12 molar a la solución de 5,5 mililitros, bañando el recipiente.No ajuste la tensión manualmente, ya que la respuesta máxima al cloruro de potasio se utilizará para normalizar los datos del tratamiento, reemplace la solución con tampón ligero Krebs Henzel fresco en intervalos de 15 minutos hasta que la tensión haya vuelto al valor base de un gramo. Una vez que la tensión haya regresado a la línea de base, agregue los patrones en alícuotas de 25 microlitros a cada cámara de acuerdo con el protocolo experimental. Cuando se haya agregado el último estándar, inicie un temporizador de nueve minutos.Al final de la incubación, retire el tampón que contiene tratamiento de las cámaras y agregue cinco mililitros de tampón fresco a cada cámara. Luego inicie un temporizador de 2.5 minutos después de la finalización, repita este enjuague de 2.5 minutos. Una segunda vez al final del segundo enjuague, aspire las cámaras.Luego, después de agregar un búfer nuevo una vez más, inicie un temporizador de un minuto para realizar la cuenta regresiva hasta el comienzo de la segunda edición estándar. Como se observa en los períodos de incubación de nueve minutos ilustrados aquí, hay aumentos incrementales en la respuesta a los estándares de que con las concentraciones crecientes del tratamiento, la adición de cloruro de potasio al final del experimento es esencial, ya que confirma la viabilidad del tejido. Este bioensayo se puede utilizar para evaluar la actividad vaso de los compuestos experimentales en los vasos sanguíneos que suministran nutrientes al intestino delgado, así como en los vasos sanguíneos que transportan los nutrientes absorbidos.Por ejemplo, en este experimento, no se observaron diferencias en las respuestas contráctiles arteriales o venosas después del tratamiento con cinco hidroxitriptaminas. Por el contrario, la respuesta contráctil de la vena mesentérica al aumento de las concentraciones de norepinefrina fue mayor que la de la arteria mesentérica. Siguiendo este procedimiento, el método podría modificarse aún más para incluir agonistas o antagonistas en el tampón que fueran de interés específico para el investigador.Esto permitiría al investigador comprender mejor la implicación de receptores muy específicos y los mecanismos que subyacen a las respuestas vasculares observadas durante el experimento mio. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo recolectar, procesar y aislar vasos sanguíneos. Para un mi experimento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Adultos normales tejido vascularizado mamífero que carece de la angiogénesis fisiológica y que no ha sido expuesto a la intervención quirúrgica se utiliza para estudiar: (i) el inicio y desarrollo de la angiogénesis tras la administración intraperitoneal de agentes de prueba, y (ii) la modificación de la angiogénesis tras la administración sistémica de seleccionados agentes de pruebas.

Rata mesenterio ensayo angiogénesis

Un método automatizado para miografía las medidas de fuerza en las arterias mesentéricas aisladas se describe. Se emplea un miografía Auto Mulvany-Halpern alambre doble 510A para determinar las respuestas a la fenilefrina y el calcio extracelular. El método permite la determinación constante de respuestas a los agonistas isométricos en los pequeños vasos de diámetros de 60 a 300 micras, de forma independiente.

Contracción de la arteria mesentérica y Estudios de relajación con miografía cable automático

La Ex vivo Preparación aislada Microvessel esquelético para la Investigación de la reactividad vascular

Las mediciones de la KV7 (KCNQ) la actividad del canal de potasio en los miocitos aislados arteriales (patch clamp utilizando técnicas electrofisiológicas) en paralelo con las medidas de respuesta constrictor / dilatador (utilizando miografía presión) puede revelar información importante acerca de las funciones de los canales KV7 en la fisiología del músculo liso vascular y farmacología.

Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

Presentamos una preparación para la visualización y manipulación de la señalización del calcio en el endotelio microvascular intacta nativo. Tubos endoteliales recién aisladas de las arterias de resistencia de ratones que suministran el músculo esquelético a retener en la morfología vivo y señalización dinámica dentro y entre las células vecinas. Tubos endoteliales pueden prepararse a partir de los microvasos de otros tejidos y órganos.

Aislamiento de microvascular endotelial Tubos de arterias de resistencia Ratón

Miografía de presión se utiliza para evaluar vasoactividad de las pequeñas arterias que se desarrollan constricción sostenida cuando se presuriza. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para evaluar en segmentos aislados de pequeñas arterias mesentéricas de ratas, vasoactividad y el efecto de la presión intraluminal del diámetro vascular.

Evaluar Miogénica Respuesta y Vasoactividad En arterias mesentéricas Resistencia Usando Miografía Presión

La técnica de Landis modificada permite la medición emparejada de la conductividad hidráulica de microvasos individuales en el mesenterio de ratas normales y modificadas genéticamente en condiciones de control y prueba utilizando técnicas de microperfusión. Proporciona un método conveniente para evaluar los mecanismos que regulan la permeabilidad de los microvasos y el intercambio transvascular en condiciones fisiológicas.

Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Este protocolo describe el uso de preparaciones de tejido intestinal extirpado o "sacos intestinales" como modelo ex vivo de la función de barrera intestinal. Este modelo se puede utilizar para evaluar la integridad tanto de la barrera epitelial como de la capa de gel mucoso en sitios intestinales específicos en modelos animales de enfermedad digestiva.

Ex Vivo intestinal Sacs para evaluar la permeabilidad de la mucosa en modelos de enfermedad gastrointestinal

Este manuscrito describe en vitro protocolos video microscopia para evaluar la función vascular en las arterias de resistencia cerebral de rata. El manuscrito también describe técnicas para evaluar la densidad de microvessel con fluorescencia marcada perfusión lectinas y tejido mediante flujometría Doppler láser.

Evaluación de mecanismos de Control Vascular utilizando microscopia Video de arterias de resistencia aislada de ratas

La técnica del miógrafo de alambre se utiliza para investigar las funciones del músculo liso vascular y nuevos fármacos de la pantalla. Se presenta un protocolo detallado para medir la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón y para la detección de nuevos relajantes del músculo liso vascular.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

El protocolo describe el uso de la miografía por cable para evaluar la tensión isométrica transmural de las arterias mesentérica aisladas de los ratones, con especial consideración de la modulación por factores liberados de las células endoteliales y los tejidos adiposo perivasculares.

Evaluación de la capacidad de respuesta del tono vascular utilizando arterias mesentérica aisladas con un enfoque en la modulación por tejidos adiposo perivasculares

Aprenda a aislar arterias y venas mesentéricas bovinas para evaluar la vasoactividad de compuestos experimentales mediante multimiógrafo. Este bioensayo permite estudiar el flujo sanguíneo intestinal y la absorción de nutrientes.

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El aislamiento y uso de las Secciones de bovino mesentérica arteria y la vena como un bioensayo para la Prueba de Vasoactividad en el intestino delgado

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