Name: Bienes Análisis Tiempo de perfil metabólico en Ex Vivo Culturas ratón intestinal Cripta organoides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprende a analizar el perfil metabólico en tiempo real de organoides de criptas intestinales de ratón usando el analizador de flujo extracelular XF 24. Este método permite estudiar la función metabólica in vitro con precisión fisiológica.

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Este estudio fue apoyado por becas SR1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 y P3013330 de los Institutos Nacionales de Salud. Nos gustaría dar las gracias a Michele Houston, Elena Dhima y la doctora Anna Velcich por sus valiosos comentarios en el desarrollo del protocolo de aislamiento cripta. También agradecemos a la Formación de la Diabetes y el Centro de Investigación del Colegio Albert Einstein de Medicina apoyado por el NIH P60DK20541, y el Dr. Michael Brownlee y el Dr. Xue Liang-Du, que dirigen y operan las instalaciones de Seahorse, respectivamente.

Este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentación Animal de la Einstein College de Medicina Albert. 1. Cripta Aislamiento y Cultura <ol><li> El aislamiento de las criptas del intestino delgado: <ol><li> Aislar criptas intestinales de cualquier modelo de ratones de interés. La eutanasia a los ratones con CO 2 seguido por dislocación cervical. </li><li> Abrir el abdomen longitudinalmente y llenar el intestino delgado (SI) con solución salina tamponada con fosfato enfriada en hielo, PBS (-Ca 2+; -Mg 2+) con 2x antibiótico-antimicótico (anti-anti). Rápidamente aislar intestino delgado. </li><li> Completamente diseccionar libre de grasa mesentérica utilizando un bisturí. Tenga cuidado de no perforar el tejido - en todo momento mantener el tejido húmedo con PBS enfriado con hielo. Abre inteStine longitudinalmente y lavar a fondo con helado de PBS. </li><li> Cortar el intestino delgado en dos secciones y aplanar con una punta de algodón húmedo, suavemente raspar las vellosidades utilizando una diapositiva pre-enfriado. Lave vigorosamente en PBS enfriado con hielo varias veces. </li><li> Incubar 3 min en 20 ml de 1x PBS por 3 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) /0.5 mM ditiotreitol (DTT) para la disociación no enzimática del tejido. </li><li> Cortar el tejido en trozos pequeños (2-4 mm) utilizando una cuchilla de afeitar en un portaobjetos pre-enfriado. Transferir las piezas en un tubo de 50 ml que contiene 20 ml de PBS helado. </li><li> Pipeta hacia arriba y abajo suavemente 10 veces con una pipeta desechable estéril de 10 ml. Deje que los fragmentos de tejido sedimentan por gravedad. Eliminar el sobrenadante con una pipeta. Repita tres veces más; asegúrese de sobrenadante es claro. </li><li> Añadir 20 ml de PBS por EDTA 2 mM. Remolino e incubar a 4 ° C durante 30 minutos con agitación suave. </li><li> Deje que los sedimentos del tejido y desechar el sobrenadante. Añadir 15 ml de hielo frío PBS y pipetaarriba y abajo 5x con una pipeta 10 ml. Dejar que los fragmentos de tejido de sedimentos y recoger el sobrenadante como la fracción 1 (F1). Repita la recogida de F2-F5, cada fracción mantenido separado. </li><li> Añadir 15 ml de hielo PBS frío y este batido tiempo vigorosamente a mano durante 15 segundos. Recoger F6 y F7 para repetir, F8. Si las piezas de tejido comienzan a flotar, toque para ayudarles a establecerse. </li><li> Inspeccionar una parte alícuota de cada fracción bajo el microscopio. Piscina aquellas fracciones que contienen criptas. </li><li> Pasar las fracciones reunidas a través de un filtro de células de 70 micras de nylon, la recogida de las criptas en un tubo de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C, se descarta el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 ml PBS enfriado con hielo con criptas anti-anti y transferencia 2X a un tubo de 15 ml. Repita el lavado una vez más. </li><li> Lavar las criptas una vez con 10 ml enfriado en hielo ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco &quot;s Medio Eagle Modificado / jamón&quot; s F-12) - 2x anti-anti. </li><li> Lavar las criptas una vez con 10 ml ADF - 1x anti-anti. </li><li> Cuente las criptas utilizando un hemocitómetro. Ajustar el volumen de la solución cripta y transferir a un tubo de 1,5 ml para que la concentración final cuando cripta resuspendió será 100-500 criptas por 50 l de mezcla de proteína gelatinosa (Matrigel). Centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C y volver a suspender las criptas en la mezcla de proteína gelatinosa. </li><li> Placa de 50 l de cripta - suspensión gelatinosa mezcla de proteína por pocillo en una placa de 24 pocillos (área de crecimiento: 2 cm 2), colocando cuidadosamente la caída de suspensión en el centro de cada pocillo. Mantener la placa en una CO 2, 37 ° C incubadora durante ~ 30 min hasta que la suspensión se solidifica. </li><li> Añadir 500 medios de comunicación helada l de cultivo completo (Advanced DMEM / F12 con 1x anti - anti, 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES), 1x GlutaMAX, Suplemento B27 1x, 1x N2 Suplemento, 1 mM N-acetil-L-cisteína (NAC), 50 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R-Spondin). <ol><li> Reconstituir factores de crecimiento en 0,1% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. </li></ol></li></ol></li><li> Cripta organoide cultura y Pasaje: <ol><li> Passage organoides cripta 14-21 días después de la siembra (o cuando sea necesario) como sigue: <ol><li> Cambio de los medios de comunicación todos los viernes y lunes. Los miércoles, reemplace la mitad de los medios de comunicación con los medios de comunicación fresca. </li></ol></li><li> Retire el medio de cultivo. Lavar la muestra dos veces con 500 l de PBS a intervalos de 5 min. </li><li> Retire PBS y romper suavemente la mezcla de proteína gelatinosa usando una punta micro pipeta P1000 estéril. </li><li> Añadir 1 ml de medios de cultivo completa a un solo pozo y resuspender las organoides en 1 ml de medio. </li><li> Interrumpir suavemente los organoides utilizando un P1000 pipeteando arriba y abajo 20-30x (comprobar bajo el microscopio para la disociación organoid adecuada con un buen rendimiento cripta hasta que una técnica consistente se desarrolla). </li><li> Transfiera las criptas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml;centrifugar a 100 xg a 4 ° C, 5 min. </li><li> Lavar el sedimento dos veces con 1 ml de medio de cultivo completo. </li><li> Split en una proporción de 1: 3 o 1: 6, según sea necesario, criptas resuspender en 50 l de Matrigel por pocillo. Proceda como se describe anteriormente (sección 1.1.16-18). </li></ol></li><li> Cripta de congelación organoide: <ol><li> Retire el medio de cultivo. Lavar la muestra en 500 l de PBS. </li><li> Dispersar la mezcla de proteína gelatinosa usando una punta de pipeta P1000. </li><li> Añadir 1 ml de medio a un solo pozo y resuspender las organoides en 1 ml de medio. </li><li> Romper suavemente hasta los organoides utilizando un P1000 pipeteando arriba y abajo 20-30x. </li><li> Transfiera los organoides a un tubo de 1,5 ml. Centrifugar a 100 xg a 4 ° C, 5 min. </li><li> Lavar el sedimento dos veces con 1 ml de medio de cultivo completo. </li><li> Criptas Resuspender en 500 l de congelación medios de comunicación. </li><li> Criptas transferencia a un criotubo, coloque el tubo en un recipiente de congelación y almacenar en un congelador a -80ºC overnilucha. </li><li> Transferencia de criptas a líquido del tanque N 2. <ol><li> Recuperar organoides cripta congelados descongelando rápidamente en un baño a 37 ° C. Lavar con 500 l medio completo de cultivo una vez, centrifugar a 100 xg, 5 min y resuspender en mezcla de proteína gelatinosa, y la cultura como se describe anteriormente. Para una mejor recuperación, añada inhibidor ROCA (Y-27632) a los medios de congelación. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Cripta organoide Metabolismo Ensayo <ol><li> 24 y Preparación de la placa: <ol><li> Aislar y contar criptas de acuerdo con el protocolo (ver sección 1.1 para el aislamiento de las criptas y la sección 1.2 para el paso cripta). </li><li> Criptas Resuspender en mezcla de proteína gelatinosa (100-200 criptas por 20 l). </li><li> Placa-cripta gelatinosa suspensión mezcla de proteínas en una placa de 24 pocillos de ensayo (asegúrese de que hay al menos por triplicado para cada muestra) y permita que la suspensión se solidifique a 37 ° C en un CO 2incubadora; a continuación, añadir 500 l de los medios de cultivo completo. </li><li> Criptas Cultura (como se describe en la sección 1.1) y observar al microscopio hasta criptas crecen en organoides plenamente desarrollados. </li></ol></li><li> Extracelular Ensayo de flujo: <ol><li> Cartucho Hidratación durante la noche en un 2 no-CO (0% de CO 2), 37 ° C incubadora. </li><li> Retire el medio de cultivo y se lava dos veces con 500 organoides l DMEM (sin: glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio; y con: rojo de fenol). Espere 5 min. </li><li> Añadir 675 l por pocillo de medio de ensayo (DMEM con 2 mM L-glutamina y 5 mM de D-glucosa) a cada pocillo. </li><li> Compruebe la morfología microscópica cripta organoides para asegurar que organoides y la mezcla de proteína gelatinosa están intactas después de los lavados. Incubar 1 hora en un no-CO2, 37 ° C incubadora. </li><li> Preparar 10 mM compuestos inyectables (oligomicina, cianuro de carbonilo-p-trifluoro-metoxi-fenil-hidrazona (FCCP), rotenone) en medio de ensayo. </li><li> Puesta en marcha del cartucho mediante la carga de 75 l de 10 mM compuestos inyectables en los puertos de la secuencialmente cartucho: Port A - oligomicina; Puerto B - FCCP; y Port C - rotenona (Las concentraciones finales durante el ensayo será de 1 M). </li><li> Incubar cartucho de 30 min - 1 hora a 37 ° C en una incubadora de 2-CO no. </li><li> Al mismo tiempo, active el XF Analyzer y crear la plantilla de protocolo de ensayo. </li><li> Coloque el cartucho y la placa de utilidad en el Analizador XF y ejecutar &quot;calibrar&quot; cartucho. </li><li> Compruebe organoides cripta microscópicamente para asegurarse de que están unidos a la mezcla de proteína gelatinosa. </li><li> Placa de cultivo de células de carga en protocolo de ensayo de instrumentos y de ejecución. </li></ol></li></ol>

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<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
</ol>

No hay revelaciones.

Hemos probado la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y el índice de acidificación extracelular (ECAR) de criptas aisladas a partir de 8 meses de edad los ratones y se hicieron crecer en organoides ex vivo. Después de la medición de la tasa basal, el metabolismo cripta se evaluó mediante la adición de oligomicina, cianuro de carbonilo -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) y rotenona, secuencialmente. Basal OCR y ECAR basal se registraron 0-29 min (Figura 2A y <stron...

El cáncer colorrectal (CCR) es la tercera causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos. Cáncer de colon esporádico - es decir, que surge más tarde en la vida (&gt; 50 años de edad) y sin factores genéticos predisponentes claras - las cuentas de ~ 80% de todos los casos, con una incidencia muy influida por los patrones de la dieta a largo plazo 1,2. Estos tumores exhiben un cambio metabólico hacia la dependencia de la glucólisis oxidativo, conocido como el efecto Warburg, lo que puede hacer, en parte, concentraciones más altas de bloques de construcción celular y la energía disponibles (a través de glutaminolysis) para permitir y tal vez conducir altas tasas de proliferación de células tumorales 3-5 . Estudios de cáncer de colon, así como otros cánceres gastrointestinales que incluyen cánceres pequeños intestino proporcionan información importante sobre la causa de la formación de tumores. La investigación de las diferencias metabólicas entre estados normales, pro-tumorigénicos y tumorigénicos de sistemas de órganos gastrointestinales pueden ayudar determination de riesgo relativo para el desarrollo del tumor así como la detección precoz de la neoplasia. Por otra parte, la comprensión de metabolismo bioenergético que involucra la respiración mitocondrial y la glucólisis proporcionará información fundamental en la forma en la fisiología celular, el envejecimiento y la enfermedad estado perturba la homeostasis intestinal. La utilización de la tecnología de ensayo de la bioenergética para el análisis de flujo extracelular puede evaluar las tasas de respiración mitocondrial y la glucólisis simultáneamente en las células que crecen en cultivo en tiempo real 6,7. Hasta hace poco, los estudios in vitro de intestino delgado se limitan a las líneas celulares derivadas de tumores benignos o malignos 8,9 y no representan la fisiología del epitelio intestinal normal y la influencia del microambiente en el que residen. En 2009, Sato et al. 10 introdujo un sistema ex vivo la cultura a crecer en tres dimensiones del ratón (3D) organoides epiteliales intestinales, o epithElial &quot;mini-tripas&quot;, apto para experimentales, diagnósticos y terapéuticos investigaciones 10,11. Por otra parte, criptas aisladas de ratones restricción calórica mantienen sus propiedades de crecimiento alterados como organoides en tales culturas 12. En comparación con las líneas celulares transformadas, culturas organoides de las criptas se pueden utilizar para generar datos fisiológicamente relevantes que presentan un mejor modelo para entender el estado in vivo. Hemos adaptado la tecnología de análisis bioenergético para analizar el metabolismo energético de las criptas intestinales organoides. Ratón organoides criptas intestinales fueron cultivadas ex vivo para desarrollar los estudios de metabolismo energético organoides cripta presentados. La tasa de consumo de oxígeno (OCR) y el índice de acidificación extracelular (ECAR) de organoides de las criptas se midieron en ausencia y presencia de dos diferentes inhibidores metabólicos (oligomicina, rotenona) y un portador de iones (cianuro de carbonilo-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). La orga criptarespuesta metabólica noid a estos compuestos químicos se refleja con éxito a través de cambiar ECAR y valores de OCR. Estudios bioenergéticos celulares tendrán dilucidar las interacciones recíprocas entre el estado metabólico y riesgo de enfermedad y fenotipo en el cáncer, la obesidad, la diabetes, los trastornos metabólicos y las enfermedades mitocondriales y ayudar a los métodos de detección de avance con implicaciones directas para la medicina traslacional. A continuación, describimos un protocolo detallado para aislar pequeñas criptas intestinales y de la cultura organoides cripta. Por otra parte, se introduce un nuevo método de usar las culturas organoides cripta para ensayos metabólicos.

<table><tbody><tr><td>BD Matrigel Matriz de Membrana Basal, GFR, Fenol Sin Rojo, Sin LDEV</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solución salina tamponada con fosfato), sin magnesio, sin calcio, pH 7.2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Avanzado DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Eagle&prime modificado; s Medio sin glucosa, L-glutamina, rojo de fenol, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Rojo de fenol sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>Concentración final 15 mg/l en DMEM (D5030) - <fuerte>paso 2.2.2</fuerte></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Concentración final 1x o 2x</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, liquid</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Concentración final 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; GlutaMAX&comercio; suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Concentración final 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; HEPES (ácido sulfónico N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Concentración final 10 mM</td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Concentración final 1 mM</td></tr><tr><td>100x N-2 suplemento, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Concentración final 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&reg; suplemento menos Vitamina A, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Concentración final 1x</td></tr><tr><td>Ratón recombinante R-Spondin 1, CF, 50 &mu; g</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Concentración final 500 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF murino recombinante, 100 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Concentración final 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinante Murine Noggin, 20 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Concentración final 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&reg; L-glutamina, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Concentración final 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&reg; glucosa en polvo</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>Concentración final 5</td></tr><tr><td>mM Ambion&reg; 0,5 M EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), pH 8,0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>Concentración final 3 mM para step 1.1.5; 2 mM para step 1.1.8</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DTT (ditiotreitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Concentración final 3 mM</td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0.1% en PBS</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1% en PBS</td></tr><tr><td>Recovery&trade; Medio de congelación para cultivos celulares</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ROCK (Y-27632)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Concentración final 10 &mu; M</td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>Concentración final 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Cianuro-p-trifluoro-metoxi-fenil-hidrazona de carbonilo (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Concentración final 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Concentración final 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Concentración final 0,1 N en PBS</td></tr><tr><td>XF24 Analizador de flujo extracelular (XF Analyzer)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bienes análisis tiempo de perfil metabólico en ex vivo culturas ratón intestinal cripta organoides

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

La mucosa del intestino delgado exhibe una arquitectura repetitivo organizada en dos estructuras fundamentales: vellosidades, que sobresalen en el lumen intestinal y compuestas de los enterocitos maduros, células caliciformes y células enteroendocrinas; y criptas, que residen proximal a la submucosa y la capa muscular, la acogida madre adultas y células progenitoras y células de Paneth madura, así como del estroma y las células inmunes del microambiente cripta. Hasta los últimos años, los estudios in vitro de intestino delgado se limitó a las líneas celulares derivadas de tumores benignos o malignos, y no representaban la fisiología del epitelio intestinal normal y la influencia del microambiente en el que residen. Aquí, se demuestra un método adaptado de Sato et al. (2009) para el cultivo de organoides de las criptas intestinales del ratón primarios derivados de ratones C57BL / 6. Además, se presenta el uso de cultivos de organoides cripta para analizar el perfil metabólico cripta en tiempo real por medidación del consumo basal de oxígeno, tasa glucolítica, la producción de ATP y la capacidad respiratoria. Organoides mantienen propiedades definidas por su origen y conservan aspectos de su adaptación metabólica se refleja en el consumo de oxígeno y las tasas de acidificación extracelular. Estudios metabólicos en tiempo real en esta cripta organoid sistema de cultivo son una poderosa herramienta para estudiar el metabolismo energético organoid cripta, y la forma en que pueden ser modulados por factores nutricionales y farmacológicos.

Organoides cripta se establecieron a partir de 8 meses de C57BL / 6 ratones alimentados con la dieta purificada roedor Instituto Americano de Nutrición 76A (AIN76A). Organoides criptas intestinales pueden ser cultivadas en cultivo durante períodos extendidos de un solo cripta (Figura 1A, sola flecha roja). Organoides surgen estructuras de cripta en 18-20 días en cultivo (Figura 1B, flechas rojas). Las criptas se pasaron cada 3 semanas y organoides recuperaron de manera eficiente después...

Pequeñas organoides las criptas intestinales cultivadas ex vivo proporcionan un sistema de cultivo de tejidos que recapitula el crecimiento de las criptas dependientes de células madre y su nicho. Hemos establecido un método para analizar el perfil metabólico en tiempo real en organoides cripta ratón primaria. Encontramos organoides mantienen propiedades fisiológicas definidas por su origen.

Bienes Análisis Tiempo de perfil metabólico en Ex Vivo Culturas ratón intestinal Cripta organoides

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

El objetivo de este procedimiento es analizar el perfil metabólico de los organoides primarios de las criptas de los ratones en tiempo real. Esto se logra recolectando primero el intestino delgado del ratón, seguido de aislando las criptas intestinales André doblándolas en matrigel. El segundo paso es cultivar las criptas hasta que formen organoides de cripta completamente desarrollados.El siguiente paso es la preparación de un ensayo de cartucho para estudios metabólicos. El paso final es cargar el cartucho y la placa de servicios en el analizador de flujo extracelular XF 24 y ejecutar un análisis de flujo extracelular para medir la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular de los organoides de la cripta K. En última instancia, este procedimiento permite estudiar el perfil metabólico de los organoides primarios de la cripta intestinal del ratón en tiempo real.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso de cultivos celulares para ensayos metabólicos, es que nos permite evaluar el metabolismo de los criptoórganos intestinales en tiempo real. Los cultivos de organoides imitan el estado inmunológico con mayor precisión, y esto ayuda a generar datos fisiológicos más relevantes. La técnica también se puede extender al análisis de otros cultivos de organoides XI 3D.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer, como la caracterización de los cambios metabólicos en el intestino delgado durante la tumorgénesis, y en la investigación de la diabetes y el metabolismo, como la comparación del metabolismo de los estados normales y de la enfermedad. Para comenzar este procedimiento, abra longitudinalmente el abdomen de un ratón sacrificado. Llene el intestino delgado con PBS helado, libre de calcio y magnesio y dos antibióticos antimicóticos.A continuación, aísle rápidamente el intestino delgado. Retira la grasa mesentérica con un bisturí. Tenga cuidado de no perforar el tejido y manténgalo húmedo con PBS helado durante todo el procedimiento.Abra el intestino y lávelo bien con PBS helado. Después de eso, corta el intestino delgado en dos secciones. Aplánalos con una punta de algodón húmeda.A continuación, raspe suavemente el VII con un portaobjetos preco. Lave los pañuelos vigorosamente en PBS helado varias veces. A continuación, incubarlos en 20 mililitros de un XPBS con tres milimolares de EDTA y 0,5 milimolares de DTT durante tres minutos.Después, corta los pañuelos en trozos de dos a cuatro milímetros en un portaobjetos preco. Con una cuchilla de afeitar, transfiera las piezas a un tubo de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de PBS helado. A continuación, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta desechable estéril de 10 mililitros.Después de que los fragmentos de tejido se asienten por gravedad, retire el SUP natum con una pipeta. Repita el procedimiento tres veces más y asegúrese de que el sobrenadante esté claro. Ahora, transfiera los trozos de tejido a un tubo de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de PBS con dos milimolares EDTA SW e incube la mezcla a cuatro grados centígrados durante 30 minutos con un balanceo suave.Después de eso, deje que el tejido se asiente y deseche el supinado. Agregue 15 mililitros de carbón helado, PBS y tuberías hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Deje que los fragmentos de tejido se asienten y recojan el supinato como fracción uno.Repita los procedimientos para recolectar de la fracción dos a la fracción cinco y mantenga las fracciones separadas. A continuación, agregue 15 mililitros de hielo llamado PBS y agite vigorosamente con la mano durante 15 segundos. Recoja la fracción seis y repita los procedimientos para la fracción siete y la fracción ocho.Si los pedazos de tejido comienzan a flotar, golpee el tubo para ayudarlos a asentarse. A continuación, inspeccione una alícuota de cada fracción en busca de crips bajo el microscopio. Este es un ejemplo de una fracción mala, y este es un ejemplo de una fracción buena.Junte los que contienen Crips. Después de eso, pase las fracciones extraídas a través de un colador de células de nailon de 70 micras y recoja los Crips en un tubo de 50 mililitros. Posteriormente, centrifugar la muestra a 100 veces G durante cinco minutos, cuatro grados centígrados, desechar el supinato y volver a suspender el PT en 10 mililitros de PBS helado con dos x antibiótico antimicótico.Luego transfiera los Crips a un tubo de 15 mililitros y repita el lavado una vez más. A continuación, lavar las criptas una vez con 10 mililitros de hielo frío, A DF advanced D-M-E-M-F 12 que contiene dos x antibiótico antimicótico. Posteriormente, lavar las criptas una vez con 10 mililitros de un DF que contenga un x antibiótico antimicótico.Después de eso, cuente las criptas con un hemocitómetro. Ajuste el volumen de la solución de la cripta y transfiérala a un tubo de 1,5 mililitros para que la concentración final de la cripta cuando se resuspenda sea de 100 a 200 criptas por mezcla de proteínas gelatinosas de 20 microlitros. A continuación, centrifuga la solución de la cripta a 100 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Retire el sen y vuelva a suspender las criptas en la mezcla de proteínas gelatinosas. A continuación, coloque 20 microlitros de la suspensión de la mezcla de proteínas gelatinosas de la cripta por pocillo en una placa de utilidad de 24 pocillos. Mantenga la placa en una incubadora de CO2 a 37 grados centígrados durante 30 minutos hasta que la suspensión se solidifique.A continuación, añada 500 microlitros de medio de cultivo completo y helado a cada pocillo y cultive los Crips hasta que se conviertan en los organoides completamente desarrollados. En este procedimiento, hidrate el cartucho durante la noche en una incubadora sin dióxido de carbono a 37 grados centígrados. A continuación, retire el medio de cultivo y lave los organoides dos veces con 500 microlitros de DMEM. Después de cinco minutos, agregue 675 microlitros de medio de ensayo a cada uno.Pues bien, compruebe la morfología microscópica de los organoides de la cripta para incubarlos en una incubadora sin dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, prepare 10 compuestos inyectables micromolares en el medio de ensayo. Configure el cartucho cargando 75 microlitros de 10 compuestos inyectables micromolares en los puertos del cartucho secuencialmente.A continuación, incube el cartucho durante 30 minutos a una hora en una incubadora sin dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Al mismo tiempo, encienda el analizador XF y cree la plantilla de protocolo de ensayo. Coloque el cartucho y la placa de utilidad en el analizador XF y ejecute el cartucho de calibración Después de eso, cargue la placa de cultivo celular en el instrumento y ejecute el ensayo.El protocolo que se muestra aquí son los organoides de la cripta derivados de un ratón C 57 negro seis de ocho meses de edad en dos días o 18 días. Cultura. En esta figura se muestra el ensayo metabólico utilizando organoides derivados de los ratones C 57 black six de ocho meses de edad en el que se presenta la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular. Las criptas se indican en rojo y el control se indica en azul.Los reactivos precargados en el cartucho se inyectaron secuencialmente como oligo micina, B-F-C-C-P y C rotenona. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del cáncer y el metabolismo exploraran los cambios metabólicos en los organoides de las criptas derivados de los pacientes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la cripta intestinal, el metabolismo de los organoides en tiempo real.Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.

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Bienes Análisis Tiempo de perfil metabólico en Ex Vivo Culturas ratón intestinal Cripta organoides

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