Name: La caracterización de la composición de los motores moleculares sobre el logro axonal Cargo Uso del análisis Mapeo de carga (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprende a caracterizar la composición de motores moleculares asociados con cargas vesiculares en neuronas de hipocampo de ratón. Este método correlaciona la dirección del transporte axonal con tipos y cantidades de proteínas motoras.

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Agradecemos a Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman y Daniel Whisler por su ayuda en la adaptación y desarrollo del software para cuantificar los análisis de mapeo de carga, y a Emily Niederst por su ayuda en la fabricación de los dispositivos microfluídicos. Este trabajo fue financiado en parte por la subvención de los NIH-NIA AG032180 a L.S.B.G. y al Instituto Médico Howard Hughes. L.S. fue apoyado en parte por una beca de capacitación en bioinformática de los NIH T32 GM008806, S.E.E. fue respaldada por una beca de la Fundación de Investigación del Cáncer Damon Runyon, una subvención de capacitación en neuroplasticidad de los NIH AG000216, y por una subvención del Premio New Scholar in Aging de la Fundación Médica Ellison, G.E.C. fue apoyada por un TR001114 de premios NIH/NCATS 1 TL1 y por la fundación Achievement Rewards for College Scientists.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo que aquí se presenta permite la correlación de direccionalidad del movimiento de las partículas de carga en movimiento basado en microtúbulos fluorescentes individuales con el tipo de relación y la cantidad de proteínas motoras asociadas en las neuronas vivas. Anteriormente, la composición total de cargas del motor axonal vesiculares fue ensayada en poblaciones heterogéneas de vesículas y orgánulos 9,15 bioquímicamente purificados. Sin embargo, la caracterización de la composici...

Transporte intracelular es crítico en todos los tipos de células para el suministro de proteínas, membranas, orgánulos, y moléculas de señalización a varios dominios celulares 1. Las neuronas son células altamente especializadas con proyecciones largas y polarizadas que dependen críticamente de transporte intracelular de las cargas esenciales para su entrega a larga distancia a diferentes microdominios axonal. Este transporte está mediado por kinesins y dyneins - dos grandes familias de proteínas motoras moleculares - que se unen a las cargas y realizar un seguimiento a lo largo de los microtúbulos polarizados en direcciones anterógrada y retrógrada, respectivamente. Mientras movimiento retrógrado está mediada principalmente por la dineína, el movimiento en la dirección anterógrada se ve facilitada por una gran familia, diversidad funcional de los motores de quinesina. En consecuencia, el transporte axonal anterógrado de cargas podría estar mediado por diversos miembros de la familia de la superfamilia kinesin 1-5. Aunque algunas cargas se mueven persistentemente en cualquier dirección, ma mayoría de las cargas se mueven de forma bidireccional y revertir con frecuencia en su camino a su destino final 1,5-13. Además, se ha demostrado que los motores de oponerse a la direccionalidad asociado simultáneamente a las cargas, planteando la cuestión de cómo el movimiento regulado de cargas está coordinado por motores de polaridad opuesta 5-7. En conjunto, el transporte de cargas axonal es un proceso concertado que está regulada por la composición de los motores y sus actividades bioquímicas específicas, las cuales a su vez dependen de diversos adaptadores y parejas de unión de regulación 14. Para describir fielmente el mecanismo de transporte axonal para una carga específica y para descubrir la regulación subyacente de que el transporte, es de suma importancia para determinar la composición de las proteínas de motor y de sus compañeros de unión regulatorios asociados con cargas individuales durante su transporte en vivo. Otros métodos, como por ejemplo los enfoques bioquímicos, proporcionan estimaciones de mot promedioo composiciones en las poblaciones heterogéneas de vesículas purificadas, pero estas estimaciones no revelan el tipo o la cantidad de motores asociados a vesículas móviles individuales. Además, la reconstitución de transporte de vesículas a lo largo de los microtúbulos premontados in vitro permitió medir la cantidad de un tipo de motor en un solo nivel de la vesícula 15. Sin embargo, estos experimentos no se correlacionaron directamente la cantidad de motores con las características de transporte de estas vesículas, y se midió el transporte en ausencia de factores reguladores celulares. Un protocolo es presentado aquí, que determina la composición de motor (tipo y cantidad relativa de motores) de las vesículas móviles individuales de inmunofluorescencia (IF) de datos de medición de forma endógena expresaron proteínas motoras, y correlaciona estos parámetros para el transporte directo de las mismas vesículas exactas en las neuronas 16. Este método implica el mapeo preciso de los datos de movimiento de carga SI-a-live. Esto se logra mediante growing neuronas del hipocampo de ratones en los dispositivos de microfluidos siguientes establecieron protocolos 17-19. Estos dispositivos permiten la identificación y correlación (&quot;mapeo&quot;) de los axones y las cargas móviles individuales en las modalidades de microscopía de luz fijas y en directo (Figura 1). Neuronas cultivadas se transfectaron con proteínas marcadas con fluorescencia de carga cuyo transporte está fotografiado en la alta resolución espacial y temporal para obtener información detallada movimiento que se traza en kymographs. Durante el curso de formación de imágenes, las neuronas se fijaron con paraformaldehído, y posteriormente se tiñeron con anticuerpos contra las proteínas motoras endógenos. De carga y de motor imágenes fijas se superponen en kymographs movimiento vivo de &quot;mapa&quot; (colocalize) a la carga viva movimiento trayectorias 16. Para correlacionar el movimiento vivo de las cargas con la asociación de proteínas motoras, colocalización se analiza el uso de un paquete de software MATLAB encargo llamado &quot;Motor Colocalización &quot;16,20. Cargas y motores marcados con fluorescencia generan características puntiformes de difracción limitada que pueden superponerse parcialmente. Para resolver la situación de los puntos lagrimales se superponen, el software se adapta automáticamente primero las funciones de Gauss para cada función de dispersión, lo que representa puncta fluorescente individuo, para determinar su posición exacta XY sub-píxel coordina e intensidad amplitudes 21-23. Las posiciones de los motores y las cargas son posteriormente se comparan entre sí para determinar colocalización 16,20. Por lo tanto, este método asigna más precisamente colocalización entre puncta fluorescente en comparación con otros métodos 24. La fuerza de este método es la capacidad de evaluar la colocalización de los motores con carga individual en células fijadas, para el que las trayectorias de movimiento en vivo (por ejemplo, la dirección en la que se movían en el momento de la fijación) han sido recorded. Con este método, se encontraron kinesins y dyneins para asociar simultáneamente a vesículas que llevan la proteína priónica normal (PrP C -Celular), una carga neuronalmente enriquecido que se mueve bidireccionalmente o permanece estacionario en los axones 16. Este análisis permitió la formulación de un modelo de trabajo para la regulación de la PrP C en la que el movimiento de vesículas anterógrada (kinesina) y (dineína) motores retrógradas coordinan sus actividades con el fin de mover las vesículas en cualquier dirección o permanecer estacionario mientras asociada a la carga . Otro punto fuerte de este método es su aplicabilidad potencial amplio para la caracterización de colocalización / asociación de muchas cargas marcados con fluorescencia que se mueven en virtualmente cualquier tipo de célula, con cualquier otra proteína (s) de interés. Por lo tanto, la correlación en vivo / fijo potencialmente podría permitir la detección de transitorios interacciones proteína-carga, como muchos fluorescentemente marcado individuo partículas en movimiento puede ser analizada sobre un p deseadaeriodo de tiempo. Dada la amplia aplicabilidad y el tipo de preguntas que este método puede abordar, este protocolo será de interés para una amplia audiencia de los biólogos celulares, incluyendo los que estudian el tráfico y el transporte en las neuronas o en otros tipos de células.

<table><tbody><tr><td>poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P5899-20mg</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM (Dulbecco' s Modified Eagle Medium) Alta glucosa, con L-glutamina, sin piruvato de sodio (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Suero Fetal Bovino)</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Medio Neurobasal-A (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento sin suero</td> Life <td>Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I Suplemento (100x)</td><td>Life Tecnologías</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x) (Hank' s Solución salina equilibrada)</td><td>Life Technologies</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato, sin magnesio, sin calcio (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro Agua para cultivo celular&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT46000CM</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>USB Corporation</td><td>19925</td><td></td></tr><tr><td>DL-cisteína HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9768</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albúmina sérica bovina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>ADNasa I grado II</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Tecnologías de la Vida</td><td>&nbsp; </td><td></td>11668027</tr><tr><td>Solución de formaldehído 16% EM Grado Fisher</td><td>Scientific</td><td>50980487</td><td>Precaución: Nocivo por inhalación, en contacto con la piel y si se ingiere. Irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel. Deséchelo de acuerdo con las regulaciones oficiales.</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-0121</td><td></td></tr><tr><td>Libre de ácidos grasos BSA e IgG</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2403-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 1 1/2. 24 x 40 mm</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>Eje dispositivo microfluídico, 450 y micro; m</td><td>Millipore</td><td>AX450</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U&nbsp;</td><td>Cámara Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coolsnap HQ&nbsp;</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 150 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos utilizados:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cadena ligera anti-Kinesina, V-17</td><td>Santa Cruz &nbsp;</td><td>especificidad de sc-13362</td><td>verificada mediante neuronas KLC1-/- (Ref. 16), dilución recomendada 1:100.</td></tr><tr><td>Cadena Pesada Anti Dynein 1, R-325</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>especificidad sc-9115</td><td>verificada utilizando shRNA contra DYN1HC1 (Ref. 16), dilución recomendada 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit Anti-Rabbit IgG Anti-Rabbit</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td>&nbsp; Dilución recomendada 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Burro Anti-Conejo IgG (H + L) Anticuerpo</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>&nbsp; Dilución recomendada 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Burro Anti-Cabra Anticuerpo IgG (H + L) Anticuerpo IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11057</td><td>&nbsp; Dilución recomendada 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Burro Anti-Cabra IgG (H + L) Anticuerpo</td><td>Life Technologies</td><td>A21447</td><td>&nbsp; Dilución recomendada 1:200.</td></tr><tr><td colspan="4">Plugins y Macros</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/index.html">&nbsp; http://imagej.nih.gov/ij/index.html.&nbsp; </a></td></tr><tr><td>ImageJ Kymograph Plugin</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.</a></td></tr></tbody></table>

la caracterización de la composición de los motores moleculares sobre el logro axonal cargo uso del análisis &quot;mapeo de carga&quot;

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

La comprensión de los mecanismos por los cuales los motores moleculares coordinan sus actividades para el transporte de cargas vesiculares dentro de las neuronas requiere el análisis cuantitativo de las asociaciones de motor / carga a nivel de la vesícula sola. El objetivo de este protocolo es el uso de microscopía de fluorescencia cuantitativa para correlacionar (&quot;mapa&quot;) la posición y la direccionalidad del movimiento de la carga en vivo a las cantidades relativas de composición y motores asociados con la misma carga. &quot;Mapeo de carga&quot; se compone de imágenes en vivo de las cargas marcados con fluorescencia que se mueven en los axones cultivadas en dispositivos de microfluidos, seguido por fijación química durante la grabación de movimiento en vivo, y la posterior inmunofluorescencia (IF) tinción de las mismas regiones axonal exactas con anticuerpos contra los motores. Colocalización entre las cargas y los correspondientes motores se evalúa mediante la asignación de la posición de sub-píxel coordina a los canales de motor y de carga, por las funciones de ajuste de Gauss a la difracción de lifunciones de dispersión de punto mited representan fuentes puntuales fluorescentes individuales. De carga y de motor imágenes fijas se superponen posteriormente a parcelas de movimiento de carga, al &quot;mapa&quot; a sus trayectorias seguidas. La fuerza de este protocolo es la combinación de datos en vivo y SI para grabar tanto en el transporte de cargas vesiculares en células vivas y para determinar los motores asociados a estas mismas vesículas exactas. Esta técnica supera los desafíos anteriores que utilizan métodos bioquímicos para determinar la composición media del motor de las poblaciones de vesículas purificadas a granel heterogéneos, ya que estos métodos no revelan composiciones sobre cargas móviles individuales. Además, este protocolo se puede adaptar para el análisis de otras vías de transporte y / o trata de personas en otros tipos de células para correlacionar el movimiento de las estructuras intracelulares individuales con su composición de proteínas. Las limitaciones de este protocolo son el relativamente bajo rendimiento debido a las bajas eficiencias de transfección de cultaneuronas primarias y un campo de visión limitado disponible para imágenes de alta resolución. Las aplicaciones futuras podrían incluir métodos para aumentar el número de neuronas que expresan cargas marcados con fluorescencia.

La Figura 1 muestra una visión general del dispositivo de microfluidos utilizadas para el cultivo de neuronas del hipocampo (Figura 1A, B). Las neuronas se sembraron en el depósito 1. El tamaño de los microcanales impide la difusión de los cuerpos celulares (soma) en el compartimiento axonal, mientras que la longitud de los canales impide proyecciones dendríticas de cruzar todo el camino hasta el compartimiento axonal. Después de ~ 2-3 días en cultivo, las neuronas comienzan a extender ...

El transporte intracelular de cargas, como vesículas u orgánulos, se lleva a cabo mediante proteínas motoras moleculares que se desplazan por microtúbulos polarizados. Este protocolo describe la correlación de la direccionalidad del transporte de las partículas de carga individuales que se mueven dentro de las neuronas, con la cantidad relativa y el tipo de proteínas motoras asociadas.

La caracterización de la composición de los motores moleculares sobre el logro axonal Cargo Uso del análisis &quot;Mapeo de carga&quot;

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

El objetivo general del mapeo de carga es determinar la cantidad relativa y el tipo de proteínas motoras moleculares que se asocian con las cargas vesiculares y las mueven, y correlacionar esta composición de motores con la direccionalidad del movimiento de la carga viva. Esto se logra haciendo crecer primero las neuronas primarias del hipocampo de ratón en dispositivos microfluídicos para que los axones crezcan relativamente rectos y registrando el movimiento intracelular en vivo de las proteínas de carga marcadas con fluorescencia en los axones de las neuronas transfectadas transitoriamente. El segundo paso consiste en fijar las neuronas durante el curso de las imágenes de carga en vivo y, posteriormente, teñir los axones con anticuerpos contra las proteínas motoras moleculares, como la kinesina y las dines, seguido de imágenes de microscopía de inmunofluorescencia.A continuación, las imágenes fijas de la carga y el motor se alinean con los gráficos del movimiento de la carga a lo largo del tiempo, también llamados krafts, para correlacionar el movimiento de la carga en vivo con los motores asociados teñidos según lo determinado por la tinción inmunofluorescente. El paso final co

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Servicio de transporte molecular que consiste en deslizarse sobre los microtúbulos funcionalizados superficie adherido kinesin proteínas motoras pueden servir como un sistema de transporte a nanoescala. En este caso, el montaje de un sistema de transporte típico se describe.

Las operaciones de carga en Kinesin molecular Traslados Desarrollado

A continuación, se presenta un protocolo para identificar Kinesin-1 cargamentos. Un mutante sin motor de la Kinesin-1 de cadena pesada (KIF5B) agregados en el citoplasma e induce la agregación de sus cargas. Ambos agregados se detectan bajo microscopía de fluorescencia. Una estrategia similar se puede emplear para identificar cargamentos de otras proteínas de motor.

Identificación de Kinesin-1 Cargos El uso de microscopía de fluorescencia

Aquí describimos un método in vitro de imágenes en vivo para visualizar el transporte intracelular de orgánulos y el tráfico de proteínas de membrana plasmática en astrocitos murinos. Este protocolo también presenta una metodología de análisis de imágenes para determinar los itinerarios de transporte de carga y la cinética.

Visualización y análisis del transporte intracelular de organelos y otros Cargos en astrocitos

El objetivo de este protocolo es formar conjuntos de motores moleculares en nanoestructuras de origami de ADN y observar la motilidad del conjunto utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total.

Producción de Conjuntos de Motores de Dynein y Kinesin en Nanoestructuras de Origami de ADN para Observación de MoléculaS Simples

El deterioro del transporte mitocondrial y la morfología están involucrados en diversas enfermedades neurodegenerativas. El protocolo presentado utiliza neuronas anticerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas para evaluar el transporte mitocondrial y la morfología en paraplejia espástica hereditaria. Este protocolo permite la caracterización del tráfico mitocondrial a lo largo de los axones y el análisis de su morfología, lo que facilitará el estudio de la enfermedad...

Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria

Describimos métodos de fotoactivación de fluorescencia para analizar el transporte axonal de neurofilamentos en axones mielinados individuales de nervios periféricos de ratones transgénicos que expresan una proteína neurofilament fotoactivable.

Imágenes y análisis del transporte de neurofilamento en el nervio tibial de ratón extirpado

La kinesina-5 Cin8 mitótica bidireccional se acumula en grupos que se dividen y fusionan durante su motilidad. La acumulación en grupos también cambia la velocidad y direccionalidad de Cin8. Aquí, se describe un protocolo para ensayos de motilidad con Cin8-GFP purificado y análisis de propiedades móviles de moléculas individuales y grupos de Cin8.

Motilidad de moléculas individuales y grupos de cinesina-5 cin8 bidireccional purificada a partir de células de S. cerevisiae

Utilizando ratones fluorescentes transgénicos, se describen protocolos detallados para evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias dentro de los axones motores y sensoriales del nervio ciático intacto en animales vivos.

Ampliación del kit de herramientas para imágenes in vivo del transporte axonal

Este estudio detalla la purificación de KIF1A (1-393LZ), un miembro de la familia de la quinesina-3, utilizando el sistema de expresión de baculovirus Sf9. El análisis de deslizamiento in vitro de una sola molécula y multimotor de estos motores purificados mostró propiedades de motilidad robustas comparables a los motores de lisado de células de mamíferos. Por lo tanto, el sistema Sf9-baculovirus es susceptible de expresar y purificar la proteína motora de interés.

Análisis de una sola molécula de motores de la familia Kinesin-3 superprocesiva purificada Sf9

El artículo describe la optimización de los parámetros de adquisición de microscopía de fluorescencia para visualizar el transporte axonal de cargas endógenas marcadas con una resolución de una sola neurona en un nematodo vivo.

Optimización de la visualización del transporte axonal de carga endógena mediante microscopía de fluorescencia en Caenorhabditis elegans vivos

Aprende a caracterizar la composición de motores moleculares asociados con cargas vesiculares en neuronas de hipocampo de ratón. Este método correlaciona la dirección del transporte axonal con tipos y cantidades de proteínas motoras.

La caracterización de la composición de los motores moleculares sobre el logro axonal Cargo Uso del análisis "Mapeo de carga"

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