La caracterización de la composición de los motores moleculares sobre el logro axonal Cargo Uso del análisis "Mapeo de carga"

El objetivo general del mapeo de carga es determinar la cantidad relativa y el tipo de proteínas motoras moleculares que se asocian con las cargas vesiculares y las mueven, y correlacionar esta composición de motores con la direccionalidad del movimiento de la carga viva. Esto se logra haciendo crecer primero las neuronas primarias del hipocampo de ratón en dispositivos microfluídicos para que los axones crezcan relativamente rectos y registrando el movimiento intracelular en vivo de las proteínas de carga marcadas con fluorescencia en los axones de las neuronas transfectadas transitoriamente. El segundo paso consiste en fijar las neuronas durante el curso de las imágenes de carga en vivo y, posteriormente, teñir los axones con anticuerpos contra las proteínas motoras moleculares, como la kinesina y las dines, seguido de imágenes de microscopía de inmunofluorescencia.

A continuación, las imágenes fijas de la carga y el motor se alinean con los gráficos del movimiento de la carga a lo largo del tiempo, también llamados krafts, para correlacionar el movimiento de la carga en vivo con los motores asociados teñidos según lo determinado por la tinción inmunofluorescente. El paso final consiste en determinar las posiciones de los subpíxeles de la carga y las proteínas motoras mediante un paquete de software de MATLAB desarrollado a medida llamado colocalización de motores. Este software proporciona las coordenadas XY precisas de cada carga y posición del motor, así como la cantidad relativa de intensidades de fluorescencia asociadas con las cargas y los motores.

En última instancia, la correlación de la microscopía de fluorescencia de cargas y motores vivos y fijos a nivel de resolución subpíxel proporciona información sobre los tipos de motores que están asociados con cargas específicas para las que se conoce la direccionalidad del movimiento. Por lo tanto, este método proporciona información sobre el mecanismo de transporte de exones. Se puede aplicar a otros estudios que correlacionan la microscopía de vida con la tinción inmunofluorescente, como la asociación de proteínas a microtubarios durante la dinámica microtubárica o el reclutamiento de proteínas durante la endocitosis.

La demostración visual de este método ayudará a realizar los pasos de fijación y análisis de imágenes, que de otro modo podrían ser difíciles de aprender, ya que requieren una configuración especializada. Las neuronas primarias del hipocampo de ratón para este procedimiento se preparan como se describe en el texto del protocolo y se resuspenden en el crecimiento de huevos neurobasales. Medio para colocar las neuronas en el dispositivo microfluídico.

Retire el medio del depósito microfluídico uno y uno cebado. Aplique 20 microlitros de células al depósito microfluídico y deje que fluyan a través de él. Coloque el dispositivo en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de CO2 durante 20 minutos.

Mire debajo del microscopio para asegurarse de que las células se hayan adherido al vidrio cubierto. Agregue neuro basal, un medio de crecimiento para completar todos los reservorios. Regrese el dispositivo con células a la incubadora antes del noveno día.

En cultivo, las neuronas extienden los axones a través de los microcanales y están listas para la transfección para la expresión de proteínas fluorescentes. Las imágenes en vivo de las neuronas primarias del hipocampo de ratón transfectadas se realizan en un microscopio de luz de epifluorescencia invertida, equipado con una incubadora de 37 grados Celsius y una cámara de control de CO2. Para comenzar este procedimiento, seleccione el objetivo de aceite 100 x.

Aplique aceite al objetivo y monte el cubreobjetos con las neuronas del hipocampo cultivadas en un dispositivo microfluídico en la platina del microscopio. Para evitar la muerte neuronal, trabaje rápidamente para mantener las muestras en el microscopio durante no más de una hora. Encuentra los axones de las células transfectadas que se extienden a través de los canales de la cámara microfluídica.

Registre el número de canales en los que se encontró el axón transfectado. Cuente el número de canales utilizando un contador manual para una grabación óptima del movimiento en directo y el posterior análisis de colocalización. Elija axones que crezcan relativamente planos a través de los canales para que las imágenes de la mayoría de las vesículas se puedan realizar con enfoque.

Para facilitar la alineación posterior de imágenes fijas con trayectorias de movimiento en el injerto chm. Alinee el borde derecho de los microcanales con el campo de visión durante la obtención de imágenes. Para fijar con éxito las células durante la obtención de imágenes en vivo, el procedimiento se realiza mejor con dos personas, una persona para agregar el fijador y otra persona para ajustar el enfoque.

También es importante tener todos los reactivos listos y a mano. Usando una pipeta de transferencia de plástico de un mililitro. Retire la mayor parte del medio de los depósitos dos y dos Prime Start para obtener imágenes del movimiento de la carga en vivo con especificaciones de lapso de tiempo específicas para la dinámica de transporte de la carga que se está analizando.

Después de que se hayan recopilado suficientes datos de movimiento en vivo, haga que una persona llene los depósitos dos y dos cebadores con fijador precalentado. Evite tocar el dispositivo microfluídico, ya que esto interrumpirá el enfoque de las imágenes en vivo. Pídele a la otra persona que ajuste el enfoque mientras se agrega el fijador.

De la misma manera, el llenado de los depósitos de uno y uno con la fijación fijadora es exitoso cuando se observa el cese inmediato del movimiento. Posteriormente, las neuronas fijadas se tiñen con anticuerpos contra las proteínas motoras endógenas y se obtienen imágenes como se describe en el texto del protocolo. Para comenzar el mapeo de la carga, genere un cromógrafo del movimiento de la carga utilizando un software de análisis de imágenes.

El complemento Image J desarrollado por Rich Dorf Insights se recomienda para generar Kraft utilizando software gráfico disponible en el mercado para alinear manualmente la imagen de inmunofluorescencia de la carga con el gráfico CHM del movimiento de la carga, superponiendo los puntos de carga a la posición de las trayectorias en el gráfico chm en el punto de fijación, de modo que cada punto de carga corresponda a una trayectoria específica en el gráfico CHM. Para obtener los mejores resultados de alineación, utilice la división Z que esté mejor enfocada para la carga asignada. Se pueden utilizar varios segmentos Z para cada imagen de la pila Z.

Determine las coordenadas XY y las amplitudes de intensidad para cada punto fluorescente utilizando un algoritmo establecido para ajustar gaussianos 2D a la función de dispersión de puntos que representa las fuentes puntuales en cada uno de los tres canales. Para obtener las coordenadas XY, se desarrolló un paquete de software de MATLAB personalizado llamado colocalización de motores, que incorpora un algoritmo de ajuste gaussiano desarrollado por Yakima DONA y sus colegas para cada uno de los puntos de carga individuales que se mapearon en las trayectorias móviles o estacionarias. En el gráfico de Kog, seleccione las coordenadas XY y las amplitudes de intensidad de los resultados del programa de colocalización motora.

Utilice varias imágenes de Zack para mapear más cargas que se encuentran en diferentes planos focales. Compare las coordenadas XY individuales para la carga mapeada con las obtenidas para cada uno de los canales del motor en el corte Z correspondiente. Determine y seleccione las coordenadas del motor XY que se encuentran dentro de un radio de 300 nanómetros de la carga para cargas y motores que han señalizado dentro del mismo plano focal.

Utilice el paquete de software de colocalización de motores para determinar los puntos que se encuentran dentro del radio de 300 nanómetros. El mapeo de carga se utilizó para correlacionar el transporte de vesículas portadoras de proteína priónica normal marcada con proteína fluorescente amarilla o Y-F-P-P-R-P-C con cantidades relativas de motores de kinesina y dina en los axones. Este gráfico muestra el movimiento de las vesículas F-P-P-R-P-C y la línea punteada indica el tiempo de fijación durante la obtención de imágenes en vivo.

Las imágenes de fluorescencia de las vesículas fijas Y-F-P-P-R-P-C, así como las correspondientes imágenes de inmunofluorescencia de Kinesin, Light Chain One y Din, se alinean con el cromógrafo. Esta ampliación muestra señales inmunofluorescentes de cada uno de los tres canales con asignaciones de funciones gianas 2D. Este gráfico representa la cuantificación de la COLOCALIZACIÓN entre las vesículas Y-F-P-P-R-P-C, la cadena ligera de kinesina uno y dine en neuronas de tipo salvaje y en neuronas que carecen de cadena pesada de quinesina.

La cantidad relativa de Kinesin Light Chain One y Dine asociada con las vesículas Y-F-P-P-R-P-C se obtiene de las amplitudes gaussianas y se traza para examinar las posibles correlaciones entre las cantidades motoras relativas y la direccionalidad del movimiento. Este ejemplo de neuronas de tipo salvaje indica que las vesículas Y-F-P-P-R-P-C, que son móviles o estacionarias, se asocian con KINESIN Light Chain One o Dine o ambas Una vez dominadas, esta técnica se puede realizar en tres días. Además de los aproximadamente 10 días de preparación de las imágenes previas a la EM de los dispositivos microflélicos y la neurona primaria, en tres días podrá realizar imágenes en vivo de la tinción inmunofluorescente y el análisis de datos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar el movimiento en vivo de cargas y neuronas marcadas con fluorescencia que se cultivaron en dispositivos microfluídicos. Cómo fijar las células C durante la obtención de imágenes, cómo analizar la colocalización como resolución de subpíxeles y cómo correlacionar la colocalización de una carga y proteínas motoras moleculares con el movimiento de la carga.