Generación de pluripotentes inducidas Células Madre de la distrofia muscular pacientes: Eficiente Reprogramación-Integración libre de orina células derivadas

El objetivo general del siguiente experimento es generar de manera eficiente células madre pluripotentes inducidas o IPSC a partir de pacientes con distrofia muscular a partir de cultivos celulares derivados de la orina y un método de reprogramación libre de integración. Esto se logra recolectando primero muestras de orina de pacientes con distrofia muscular. Como segundo paso, las células de la orina se aíslan y se expanden en cultivos de células derivadas de la orina.

A continuación, las células derivadas de la orina se transducen con el virus de Sendai que contiene factores Yamanaka y emergen colonias pluripotentes típicas después de 12 días. En última instancia, por el pasaje 13, el estado libre de transgenes de las células madre pluripotentes puede confirmarse mediante el análisis R-T-P-C-R. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la reprogramación de fibroblastos aislados de piel mediante vectores lentivirales, es que con esta técnica, las células somáticas se pueden obtener de forma no invasiva de los pacientes y utilizarse para generar de forma eficiente los IPC utilizando un método de reprogramación viral de huella cero.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la distrofia muscular, como la forma en que estas condiciones se pueden modelar in vitro sin preocupaciones de seguridad para su aplicación en humanos. Para demostrar los procedimientos, Mohammad Zishan Al, becario postdoctoral Courtney Guesting, técnica, y Melanie Ryder, estudiante graduada, los tres de mi laboratorio. Para recolectar una muestra de orina, comience aconsejando al paciente que beba líquidos 30 minutos antes de la recolección para asegurarse de que se puedan recolectar alrededor de 30 a 40 mililitros de orina. Cuando el paciente esté listo, entréguele un kit de recolección de orina que contenga los siguientes artículos, instrucciones escritas sobre cómo obtener inodoros antibacterianos húmedos estériles o limpios, y un vaso de recolección de muestras estériles de 100 mililitros.

Cuando se haya recogido la muestra, coloque inmediatamente el recipiente de recolección en hielo y transfiera la muestra al laboratorio en una hielera. A continuación, utilice pipetas estériles para transferir la muestra de orina a tubos de centrífuga estériles de 50 mililitros y haga girar los tubos a 400 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, en una cabina de seguridad biológica BSL dos aspirar todo menos el último, mililitro del sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet.

A continuación, lave las células en siete mililitros de tampón de lavado y vuelva a centrifugar las células. Esta vez, aspirando todos menos los últimos, entre 0,2 y 0,5 mililitros del sobrenadante. Ahora reutilice el pellet en dos o tres mililitros de célula progenitora urinaria o medio UPC y transfiera la suspensión a cuatro a seis pocillos de una placa de 24 pocillos sin recubrimiento después de 72 horas, complemente el cultivo con 0,5 mililitros de medio UPC fresco por pocillo.

Monitoree el cultivo entre cuatro y seis días de incubación. Deben comenzar a aparecer pequeñas colonias de dos a cuatro células de células redondeadas o alargadas que representan células epiteliales renales de tipo uno o tipo dos, respectivamente. Continúe cambiando el medio cada dos o tres días.

Como las colonias experimentarán una fase de expansión rápida alrededor de los nueve a 15 días de cultivo, las células deben tener un 80 a 90% de confluentes en este punto, dividir las células en dos a cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos para una mayor expansión. Al marcar este cultivo como paso celular uno, las células de la orina se pueden caracterizar para marcadores específicos de linaje a través de análisis de citometría de flujo, tinción inmunohistoquímica o mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa para garantizar una reprogramación de alta eficiencia a días antes de la semilla de transducción, 60.000 células por pocillo. De un pasaje del uno al cinco cultivo en dos pozos de una placa de seis pocillos en el día cero.

Prepare el vector de reprogramación de Sendai agregando cada uno de los cuatro factores OSKM a un MLI apropiado para la reprogramación a un mililitro de medios UPC precalentados, aspire los medios de suspenso y agregue lentamente la suspensión del virus a un pocillo de las células de orina durante los próximos seis días. Reemplace el sobrenadante diariamente con medio UPC fresco en el quinto día en placas MES tratadas con semillas de mitomicina en placas de cultivo cuadradas de 100 milímetros recubiertas de gelatina en el sexto día. Disocie las células de orina con tripsina, vuelva a suspenderlas en medio UPC y póngalas en placas de cinco veces 10 de la cuarta a dos veces 10 de las quintas células por placa de alimentación de metanfetamina.

Al día siguiente, reemplace el medio UPC con medio en etapa embrionaria humana o medio HES y monitoree las células bajo un microscopio para observar las células transformadas alrededor de 12 a 18 días. Después de la transducción, las células deben formar agregados clonales con una morfología característica de adoquín y una mayor proporción de núcleo a citoplasma. Para identificar los clones de IPSC reprogramados, realice una tinción de células vivas para un anticuerpo TRA 180 1.

A continuación, utilice una aguja de media pulgada de calibre 26 para entresombrear los agregados clonales positivos TRA 180 1 en cuatro a seis piezas pequeñas de igual tamaño por clon. A continuación, utilice una punta de pipeta estéril para recoger y transferir de 10 a 20 piezas sombreadas cruzadas de varios clones a cada pocillo Una placa recubierta de matrigel de 24 pocillos con HESC. Medio, de 24 a 48 horas después de que los clones reprogramados se siembran en la superficie del matrigel.

Reemplace el medio con medio IPSC. Utilice una punta de pipeta para raspar manualmente cualquier célula diferenciada o celda alimentadora de metanfetamina contaminante para ayudar en la purificación de los clones de IPSC distróficos pluripotentes y completamente reprogramados. Después de que los clones hayan alcanzado un tamaño aproximado de 100 micrómetros, disocie las células con EDTA durante tres minutos y luego coloque agregados de células pequeñas del IPSC distrófico reprogramado, suspendidos en medio IPSC suplementado con inhibidor de la quinasa RO en una placa de 12 láminas recubierta de matrigel fresca

Finalmente, confirmar la pluripotencia de cada clon mediante análisis de expresión génica y tinción inmunohistoquímica. En el caso de los marcadores pluripotentes, la mayoría de las células aisladas de la orina humana son positivas para los marcadores progenitores y de células madre, como CD 44, CD 73 y CD 1 46. Las células también exhiben marcadores mesenquimales como el músculo liso alfa, la actina y el mentón.

R-T-P-C-R de las células aisladas proporciona evidencia de una población mixta de células en los cultivos. En que hay una expresión débil de citoqueratina siete y UIN uno A y tres marcadores a de células epiteliales euro. Las células de la orina se transforman de células alargadas de tipo dos en el día cero a un patrón de adoquines en el cuarto día de reprogramación.

Para el día 12, se observan clones pluripotentes típicos y son capaces de mantener su morfología pluripotente en condiciones libres de alimento. La tinción de células vivas para TRA 180 1 se puede utilizar para identificar los clones reprogramados. Para confirmar la generación de vectores y transgenes, clones pluripotentes libres, se puede realizar el uso de cebadores contra el genoma del virus de Sendai y cada uno de los factores exógenos OSKM.

La expresión génica exógena ya no se detecta en el pasaje 13, pero se puede observar la regulación positiva de los factores endógenos. La tinción inmunofluorescente confirma la expresión de marcadores pluripotentes en los IPC, pero no en las células urinarias. La expresión de la proteína y el gen de la distrofina puede verificarse mediante tinción inmunofluorescente adicional, Western blot y R-T-P-C-R, respectivamente, como se demuestra con estas imágenes representativas de una línea celular distrófica y de control de tipo salvaje.

Una vez dominada, esta técnica se puede emplear para lograr una reprogramación libre de UCS. A las pocas semanas de seguir este procedimiento, podemos diferenciar los IPC en cardiomiocitos o miocitos esqueléticos para profundizar en los mecanismos detrás de la distrofia muscular.