Name: Generación de pluripotentes inducidas Células Madre de la distrofia muscular pacientes: Eficiente Reprogramación-Integración libre de orina células derivadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas de pacientes con distrofia muscular usando células derivadas de orina y virus Sendai sin integración. Este método no invasivo permite obtener iPSCs libres de transgenes en 13 pasajes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El desarrollo de este protocolo fue apoyado por Advancing a Healthier Wisconsin y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales de los Institutos Nacionales de Salud, a través de la subvención número 8UL1TR000055. Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los NIH.

NOTA: Los pacientes y / o sus tutores deben dar su consentimiento informado para participar en una Junta de Revisión Institucional aprobado estudio. 1. Los tampones y Preparaciones Medios <ol><li> Tampón de lavado: Para preparar 100 ml de tampón de lavado, añadir 1 ml de la pluma de 100x / Solución estreptocócica (100 U / ml de penicilina + 100 g / ml de estreptomicina) a 99 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Urinario Progenitor Cell (UPC) Medio: Para preparar medio UPC, mezclar volúmenes iguales de queratinocitos sin suero (FCE) Medio + Progenitor medio celular. <ol><li> KSF Medio: Para preparar el medio de queratinocitos, añadir 5 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 50 ng / ml de extracto de pituitaria bovina (BPE), 30 ng / ml de toxina del cólera, y solución de penicilina / estreptomicina (100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina) a 500 ml de medio KSF. </li><li> Medio Progenitor Cell: Añadir tres cuartas partes de DMEM con un cuarto de los medios de Ham-F12 y complementar con 10% de FBS, 0,4 mg / ml de hidrocortisona, 0,1nM toxina del cólera, 5 ng / ml de insulina, 1,8 x 10 -4 M adenina, 5 g / ml de transferrina, 2 x 10 -9 M tironina triyodo, 10 ng / ml de EGF, y pen / strep solución. </li></ol></li><li> hES Medio: Añadir 20% de reemplazo KO-suero (K-SR), 1x MEM aminoácidos no esenciales, 2 mM L-glutamina, 100 mM β-mercaptoetanol, 20 ng / ml de bFGF y penicilina / estreptomicina a 400 ml de DMEM / medio F12. </li></ol> 2. Muestra de orina Colección <ol><li> Instruir a los pacientes a beber líquidos 30 minutos antes de la recolección de orina para asegurarse de que una cantidad adecuada (~ 30 a 40 ml) de orina se pueden recoger. </li><li> Dar a los pacientes y / o sus tutores un kit de recogida de orina que contiene los siguientes elementos: (1) las instrucciones escritas sobre cómo obtener la muestra de orina estéril o limpia, (2) toilettes antibacterianas húmedas, y (3) a 100 ml estéril taza de la recogida de muestras. Indique a los pacientes a tomar la muestra. </li><li> Coloque inmediatamente las muestras de orina en el hielo y la transferencia a la laboratoria en un refrigerador. Procesar la orina para el aislamiento de células inmediatamente. Si un retardo es inevitable, almacenar la muestra en hielo durante hasta 4 horas con una mínima pérdida de la viabilidad celular. </li></ol> 3. El aislamiento y la expansión de las células de orina NOTA: Realice los pasos siguientes en condiciones estériles en una cabina de seguridad biológica BSL2. <ol><li> El uso de pipetas estériles, las muestras de orina para la transferencia estéril tubos de centrífuga de 50 ml. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a TA. </li><li> Aspirar el sobrenadante dejando 1 ml en el tubo; tener cuidado de no perturbar el sedimento celular. </li><li> Resuspender y combinar los gránulos de múltiples tubos en 7 ml de tampón de lavado y repetir la centrifugación a 400 xg durante 10 min a TA. </li><li> Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, dejando el sedimento celular y ~ 0,2-0,5 ml de sobrenadante. Volver a suspender en 2-3 ml de orina de células progenitoras (UPC) a medio y transferir la suspensión en 4-6 pocillos de una ONUplaca de 24 pocillos recubierta. </li><li> Después de 72 horas, suplementar el cultivo con 0,5 ml de medio fresco UPC por pozo y cambiar de medio cada 2-3 días después. Los eritrocitos y células escamosas que no se adhieren a la placa se eliminarán con los cambios de medio. </li><li> Supervisar la cultura después de 4-6 días. NOTA: Las pequeñas colonias de células 2-4 comenzarán a aparecer. Las células serán redondeadas o alargadas que representan tipo I o II del epitelio renal (RE) células respectivamente 3. </li><li> Cambie el medio cada 2-3 días desde que una vez que aparecen las células, se someterá a una fase de rápida expansión. </li><li> Una vez que las células alcanzan 80-90% de confluencia, alrededor de 9-15 días después de placas, disociar y el paso de las células (15,000-18,000 células / cm 2) en 2-4 pocillos de placa de pocillos 24 para una mayor expansión. Marque esto como paso célula 1 (P1). </li><li> Caracterizar las células de orina para las especificaciones de linaje a través del análisis de citometría de flujo, immunohistochemtinción iCal o mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). </li><li> Reprogramar células aisladas de orina (sección 4) o congelarlos en el medio de congelación (DMEM suplementado con 10% de suero y 10% DMSO) para almacenamiento criogénico a largo plazo. </li></ol> 4. La orina Reprogramación Celular Usando Sendai Virus NOTA: El manejo adecuado y el uso de los EPI (equipos de protección individual) se recomienda durante la manipulación de los agentes de transfección. Realice los pasos siguientes en condiciones estériles en una cabina de seguridad biológica BSL2. Se recomienda la eliminación adecuada de la transfección de células de agentes y / o transfectadas para evitar el riesgo de peligros ambientales y de salud. Para la reprogramación celular orina, use un Reprogramación Kit Sendai con modificaciones al protocolo de alimentación dependiente del fabricante como se detalla a continuación. <ol><li> Para garantizar una alta eficiencia de reprogramación con el virus Sendai, uso pasajes 1-5 de células de orina que son rápidasly dividiendo. Si las células no se replican bien o se vuelven senescentes, descartarlos ya que no se vuelva a programar de manera eficiente. </li><li> Seed 60.000 células por pocillo en dos pocillos de una placa de 6 pocillos. Marcar este como el Día de -2. Ajuste la densidad de siembra de células (5 x 04 al 09 10 x 10 4 células por pocillo) según sea necesario para llegar a un 80-90% de confluencia en el día 0. </li><li> En el Día 0 (48 h después de la siembra de las células), preparar los vectores de reprogramación Sendai (SeV) que contienen cada uno de los cuatro factores OSKM. Añadir cada uno de los vectores a 1 ml de medio UPC pre-calentado. Utilice una MOI de 1 a 1,5 (5-7,5 x 10 5 CIU), que es suficiente para que las células de orina reprogramación. Aspirar el medio y agregue lentamente el 1 ml UPC + VSe a un pocillo de las células de orina. Utilice el segundo así como el control negativo de transducción. </li><li> En el Día 1, sustituir el medio UPC + VSe con medio UPC fresco. Algunos muerte celular es visto después de 24 h debido a la citotoxicidad vírica. </li><li> En función de la eficiencia de clon reprogramadae formaciones y la morfología compacta, siguen cambiando el medio diariamente hasta el día 6 o 7. </li><li> Un día antes de la disociación de las células transducidas (día 5 o 6), preparar placas de alimentación MEF en placas Mitomicina-C (10 mg / ml durante 3 horas) tratados con MEFs a una densidad de 5 x 10 4 células / cm 2, en 0,1 % de gelatina recubierta platos 100 mm 2 de cultivo. </li><li> Al día siguiente (día 6 o 7), disociar las células con 0,25% de tripsina, resuspender las células en medio UPC y la placa 5 x 10 4 - placa de alimentador de 2 x 10 5 células / 100 mm 2 MEF. </li><li> Al día siguiente, cambiar a medio hES y cambiar el medio todos los días. Observar las células bajo un microscopio para controlar las células transformadas. NOTA: Las células forman agregados clonales con morfología característica de adoquines y tener mayor núcleo al citoplasma (12-18 días después de transducción). </li><li> Dentro de dos o tres semanas después de la transducción, recoger colonias y traslado a las nuevas placas de clonexpansión al. </li><li> Realizar tinción de células vivas para la selección de clones IPSC mediante la incubación de las células con TRA-1-81 anticuerpo durante 1 hora a 37 ° C en incubadora de CO 2 seguido por tinción con colorante fluorescente contador específico conjugado anticuerpo secundario durante 1 hora a 37 ° C en el incubador de CO2. </li><li> Use un G 1½ pulgada aguja 26 a interrogar a eclosionar los grandes TRA-1-81 clones positivos IPSC en pequeños trozos de igual tamaño (4-6 piezas por clon). </li><li> Utilice una pipeta de punta estéril para recoger y transferencia 10-20 piezas rayadas de varios clones en cada pozo de Matrigel (10 g / cm2) presenta el revestimiento de placa de 24 pocillos con medio hES. NOTA: Las piezas de un solo clon chapado en forma individual en un solo pozo no se expanden o mantener la pluripotencia. </li><li> Cambie de hES a medio IPSC 24-48 horas después de que los clones reprogramadas están unidos a la superficie de Matrigel. </li><li> Durante el mantenimiento en placas recubiertas con Matrigel, SCRA manualmentePE-off ningún células diferenciadas o contaminantes células alimentadoras MEF utilizando una punta de pipeta para enriquecer IPSC (MD-IPSC) clones distróficos totalmente reprogramadas y pluripotentes. </li><li> Después de clones individuales han alcanzado ~ 100 micras de tamaño, ampliar los clones disociando con EDTA 0,48 mM (ácido etilendiaminotetraacético) solución durante 3 minutos y enchapado pequeños agregados celulares de MD-iPSCs suspendidas en medio de IPSC (suplementado con 5 mM Y27632, Rho-cinasa inhibidor ) en matrigel fresco (10 g / cm 2) recubierto placa de 12 pocillos. Cambie medio IPSC diaria. </li><li> Reprogramación completa de cada clon se puede determinar por tanto el análisis de expresión génica de genes OSKM y tinción inmunohistoquímica de los marcadores de pluripotencia (Oct3 / 4 y TRA-1-81). Una evaluación rigurosa del potencial pluripotencia debe ser empleado para confirmar totalmente reprogramadas líneas IPSC pueden diferenciarse en tres capas germinales. Esto se puede lograr ya sea por el cuerpo embrioide (EB) formación y diferenciación de ensayo o un terensayo de formación atoma. </li></ol>

<ol><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-deficient+cardiomyocytes+derived+from+human+urine%3A+New+biologic+reagents+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).</li>
<li>Dick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+Skipping+and+Gene+Transfer+Restore+Dystrophin+Expression+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Cardiomyocytes+Harboring+DMD+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations.</a> Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+as+a+Model+for+Familial+Dilated+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+derived+cells+are+a+potential+source+for+urological+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction.</a> J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Nakanishi, M., Otsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Sendai+virus+vectors+and+their+potential+applications+in+gene+therapy+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine.</a> Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).</li>
<li>González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+nuclear+envelope+localization+of+dystrophin+Dp71+and+dystrophin-associated+proteins+%28DAPs%29+in+the+C2C12+muscle+cells%3A+DAPs+nuclear+localization+is+modulated+during+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis.</a> J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).</li>
<li>Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+dystrophin+Dp71+impairs+PC12+cells+cycle%3A+localization+in+the+spindle+and+cytokinesis+structures+implies+a+role+for+Dp71+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division.</a> PloS One. 6 (8), e23504(2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Modelado de las enfermedades cardiovasculares mediante iPSCs se está convirtiendo en un enfoque común de entender la contribución genética 4-6. Algunas dificultades no previstas de la obtención de muestras de células de los pacientes, especialmente los niños pequeños, se pueden evitar al ofrecer la opción de un método no invasivo, como una muestra de orina. En esta población joven paciente, a menudo es difícil recoger un volumen de orina suficiente para producir suficientes células de orina para la reprograma...

La cardiomiopatía es la segunda causa principal de muerte en pacientes con distrofia muscular de Duchenne y de Becker (MD). Aunque las mutaciones en el gen de la distrofina ligada al cromosoma X se producen en 1: 3.500 nacimientos de varones, se sabe muy poco acerca de los eventos moleculares y celulares que conducen al daño del músculo cardíaco progresivo. Las células madre pluripotentes inducidas humanas derivadas de pacientes con distrofia muscular se han convertido en una nueva herramienta para estudiar los mecanismos subyacentes de la enfermedad y que se utilizará para la detección de drogas 1,2. La incomodidad anticipada de biopsias de piel o muestras de sangre puede disuadir a los pacientes jóvenes y / o sus tutores para dar su consentimiento para participar en el estudio. Las muestras de orina son una fuente no invasiva de células somáticas que son modificables a los métodos de reprogramación. Recientemente hemos demostrado que las células de orina recogidas de pacientes con distrofia muscular pueden ser cultivadas y eficiente reprogramado en iPSCs utilizando la transducción retroviral con los factores de Yamanaka (Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-Myc; OSKM) 1. La desventaja del suministro de genes retrovirales es la integración aleatoria de los genes de reprogramación en los cromosomas del huésped. Para superar esta limitación, hemos utilizado el virus Sendai no integrante de la reprogramación celular orina. Este protocolo detalla la reprogramación de virus Sendai de células aisladas de orina de pacientes con distrofia muscular que a su vez pueden diferenciarse en cardiomiocitos u otros tipos de células para su posterior estudio. Este protocolo también se puede adaptar para otras enfermedades específicas del paciente.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>Materiales</fuerte></td></tr><tr><td>4 Oz. Vaso de Muestras con Tapa</td><td>STL Medical Supply</td><td>M9AMSAS340</td><td>para la Recolección de Muestras de Orina</td></tr><tr><td>15 ml Tubos BD-Falcon Fisher</td><td>Scientific</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubos BD-Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio redondos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reprogramación CytoTune-iPS Sendai Life Technologies</td><td></td><td>A1378-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep sin glutamina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Cálido en 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar B-27 Suplemento con insulina (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar B-27 Suplemento sin insulina (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>0050129SA</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Versene, 1:5,000</td><td>Life Technologies</td><td>15040066</td><td>Warm en 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>bFGF (10 &micro; g)</td> <td>Life Technologies</td><td>13256-029</td><td>Cálido en 37 &deg; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar Cell Counter Cartridges</td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum (500&nbsp; ml Botella)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Recuperación Cultivo celular Medio de congelación</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Queratinocitos-SFM (1x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td>Calentar en 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>DMEM, Alta glucosa, Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar Ham's F-12 Nutrient Mix &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>Cálido en 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>EGF Proteína humana recombinante, forma líquida</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311L</td><td>cálido en 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Insulina, Recombinante Humana, Zinc Soln</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar TeSR-E8</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5940</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>hESC Qualified Matrix, LVED Free</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iScript Kit de síntesis de ADNc</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>FBS-Qualified</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Adenina Biorreactivo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2786-5G</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar Toxina del cólera de Vibrio cholerae</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1G</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar Holo-transferrina de Sigma</td><td>humano Aldrich</td><td>T0665-50MG</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar 3,3',5-Triyodo-L-tironina sal de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397-100MG</td><td>Caliente en 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-3598</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Aquous medio de montaje</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehído</td><td>Alfa-Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Antibodies</td></tr><tr><td>Mouse anti CD44 - marcado con FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>560977</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti CD146 - marcado con PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti CD73 - marcado con PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-&alfa;-actina de músculo liso</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vimentina para ratones</td><td>Abcam</td><td>ab8978-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti para ratones - TRA-1-81</td><td>Life Technologies</td><td>411100</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti Oct 3/4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti Distrofina</td><td>Leica Biosystems</td><td>NCL-DYSB</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de pluripotentes inducidas células madre de la distrofia muscular pacientes: eficiente reprogramación-integración libre de orina células derivadas

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Cardiomiopatía distrófica es una consecuencia mal entendido de la distrofia muscular. Generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) de pacientes con distrofia muscular es una fuente inestimable para celular in vitro sistemas modelo de la enfermedad y puede ser utilizado para los estudios de detección de drogas. Células de orina derivados de los pacientes se han utilizado con éxito en la reprogramación de las células madre pluripotentes inducidas con el fin de modelar la miocardiopatía distrófica 1. Abordar los problemas de seguridad de la integración de sistemas de vectores, se presenta un protocolo utilizando un vector de virus Sendai no integrador para la transducción de Yamanaka factores en las células de orina recogidas de pacientes con distrofia muscular. Este protocolo genera clones reprogramado completamente dentro de 2-3 semanas. Las células pluripotentes son libre de vectores mediante el paso-13. Estos iPSCs distróficos pueden diferenciarse en cardiomiocitos y se utilizan ya sea para estudiar mecanismos de la enfermedad o para la detección de drogas.

La mayoría de las células progenitoras aisladas de orina humana son positivos para los marcadores progenitoras y de pericitos uroepithelial tales como CD44, CD73, y CD146 (97,37%, 97,09% y 97,3%, respectivamente; Figura 1A y 1B). Estas células también expresan otros marcadores mesenquimales tales como la actina alfa del músculo liso y vimentina (Figura 1B). Análisis de RT-PCR da evidencia de una población mixta de células en los cultivos en que hay una expresión débil d...

Este protocolo implica procedimientos detallados para el aislamiento de células derivadas de la orina de pacientes con distrofia muscular; su reprogramación eficiente y rápida a través de la transducción del virus de Sendai.

Generación de pluripotentes inducidas Células Madre de la distrofia muscular pacientes: Eficiente Reprogramación-Integración libre de orina células derivadas

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

El objetivo general del siguiente experimento es generar de manera eficiente células madre pluripotentes inducidas o IPSC a partir de pacientes con distrofia muscular a partir de cultivos celulares derivados de la orina y un método de reprogramación libre de integración. Esto se logra recolectando primero muestras de orina de pacientes con distrofia muscular. Como segundo paso, las células de la orina se aíslan y se expanden en cultivos de células derivadas de la orina.A continuación, las células derivadas de la orina se transducen con el virus de Sendai que contiene factores Yamanaka y emergen colonias pluripotentes típicas después de 12 días. En última instancia, por el pasaje 13, el estado libre de transgenes de las células madre pluripotentes puede confirmarse mediante el análisis R-T-P-C-R. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la reprogramación de fibroblastos aislados de piel mediante vectores lentivirales, es que con esta técnica, las células somáticas se pueden obtener de forma no invasiva de los pacientes y utilizarse para generar de forma eficiente los IPC utilizando un método de reprogramación viral de huella cero.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la distrofia muscular, como la forma en que estas condiciones se pueden modelar in vitro sin preocupaciones de seguridad para su aplicación en humanos. Para demostrar los procedimientos, Mohammad Zishan Al, becario postdoctoral Courtney Guesting, técnica, y Melanie Ryder, estudiante graduada, los tres de mi laboratorio. Para recolectar una muestra de orina, comience aconsejando al paciente que beba líquidos 30 minutos antes de la recolección para asegurarse de que se puedan recolectar alrededor de 30 a 40 mililitros de orina. Cuando el paciente esté listo, entréguele un kit de recolección de orina que contenga los siguientes artículos, instrucciones escritas sobre cómo obtener inodoros antibacterianos húmedos estériles o limpios, y un vaso de recolección de muestras estériles de 100 mililitros.Cuando se haya recogido la muestra, coloque inmediatamente el recipiente de recolección en hielo y transfiera la muestra al laboratorio en una hielera. A continuación, utilice pipetas estériles para transferir la muestra de orina a tubos de centrífuga estériles de 50 mililitros y haga girar los tubos a 400 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, en una cabina de seguridad biológica BSL dos aspirar todo menos el último, mililitro del sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet.A continuación, lave las células en siete mililitros de tampón de lavado y vuelva a centrifugar las células. Esta vez, aspirando todos menos los últimos, entre 0,2 y 0,5 mililitros del sobrenadante. Ahora reutilice el pellet en dos o tres mililitros de célula progenitora urinaria o medio UPC y transfiera la suspensión a cuatro a seis pocillos de una placa de 24 pocillos sin recubrimiento después de 72 horas, complemente el cultivo con 0,5 mililitros de medio UPC fresco por pocillo.Monitoree el cultivo entre cuatro y seis días de incubación. Deben comenzar a aparecer pequeñas colonias de dos a cuatro células de células redondeadas o alargadas que representan células epiteliales renales de tipo uno o tipo dos, respectivamente. Continúe cambiando el medio cada dos o tres días.Como las colonias experimentarán una fase de expansión rápida alrededor de los nueve a 15 días de cultivo, las células deben tener un 80 a 90% de confluentes en este punto, dividir las células en dos a cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos para una mayor expansión. Al marcar este cultivo como paso celular uno, las células de la orina se pueden caracterizar para marcadores específicos de linaje a través de análisis de citometría de flujo, tinción inmunohistoquímica o mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa para garantizar una reprogramación de alta eficiencia a días antes de la semilla de transducción, 60.000 células por pocillo. De un pasaje del uno al cinco cultivo en dos pozos de una placa de seis pocillos en el día cero.Prepare el vector de reprogramación de Sendai agregando cada uno de los cuatro factores OSKM a un MLI apropiado para la reprogramación a un mililitro de medios UPC precalentados, aspire los medios de suspenso y agregue lentamente la suspensión del virus a un pocillo de las células de orina durante los próximos seis días. Reemplace el sobrenadante diariamente con medio UPC fresco en el quinto día en placas MES tratadas con semillas de mitomicina en placas de cultivo cuadradas de 100 milímetros recubiertas de gelatina en el sexto día. Disocie las células de orina con tripsina, vuelva a suspenderlas en medio UPC y póngalas en placas de cinco veces 10 de la cuarta a dos veces 10 de las quintas células por placa de alimentación de metanfetamina.Al día siguiente, reemplace el medio UPC con medio en etapa embrionaria humana o medio HES y monitoree las células bajo un microscopio para observar las células transformadas alrededor de 12 a 18 días. Después de la transducción, las células deben formar agregados clonales con una morfología característica de adoquín y una mayor proporción de núcleo a citoplasma. Para identificar los clones de IPSC reprogramados, realice una tinción de células vivas para un anticuerpo TRA 180 1.A continuación, utilice una aguja de media pulgada de calibre 26 para entresombrear los agregados clonales positivos TRA 180 1 en cuatro a seis piezas pequeñas de igual tamaño por clon. A continuación, utilice una punta de pipeta estéril para recoger y transferir de 10 a 20 piezas sombreadas cruzadas de varios clones a cada pocillo Una placa recubierta de matrigel de 24 pocillos con HESC. Medio, de 24 a 48 horas después de que los clones reprogramados se siembran en la superficie del matrigel.Reemplace el medio con medio IPSC. Utilice una punta de pipeta para raspar manualmente cualquier célula diferenciada o celda alimentadora de metanfetamina contaminante para ayudar en la purificación de los clones de IPSC distróficos pluripotentes y completamente reprogramados. Después de que los clones hayan alcanzado un tamaño aproximado de 100 micrómetros, disocie las células con EDTA durante tres minutos y luego coloque agregados de células pequeñas del IPSC distrófico reprogramado, suspendidos en medio IPSC suplementado con inhibidor de la quinasa RO en una placa de 12 láminas recubierta de matrigel fresca.Finalmente, confirmar la pluripotencia de cada clon mediante análisis de expresión génica y tinción inmunohistoquímica. En el caso de los marcadores pluripotentes, la mayoría de las células aisladas de la orina humana son positivas para los marcadores progenitores y de células madre, como CD 44, CD 73 y CD 1 46. Las células también exhiben marcadores mesenquimales como el músculo liso alfa, la actina y el mentón.R-T-P-C-R de las células aisladas proporciona evidencia de una población mixta de células en los cultivos. En que hay una expresión débil de citoqueratina siete y UIN uno A y tres marcadores a de células epiteliales euro. Las células de la orina se transforman de células alargadas de tipo dos en el día cero a un patrón de adoquines en el cuarto día de reprogramación.Para el día 12, se observan clones pluripotentes típicos y son capaces de mantener su morfología pluripotente en condiciones libres de alimento. La tinción de células vivas para TRA 180 1 se puede utilizar para identificar los clones reprogramados. Para confirmar la generación de vectores y transgenes, clones pluripotentes libres, se puede realizar el uso de cebadores contra el genoma del virus de Sendai y cada uno de los factores exógenos OSKM.La expresión génica exógena ya no se detecta en el pasaje 13, pero se puede observar la regulación positiva de los factores endógenos. La tinción inmunofluorescente confirma la expresión de marcadores pluripotentes en los IPC, pero no en las células urinarias. La expresión de la proteína y el gen de la distrofina puede verificarse mediante tinción inmunofluorescente adicional, Western blot y R-T-P-C-R, respectivamente, como se demuestra con estas imágenes representativas de una línea celular distrófica y de control de tipo salvaje.Una vez dominada, esta técnica se puede emplear para lograr una reprogramación libre de UCS. A las pocas semanas de seguir este procedimiento, podemos diferenciar los IPC en cardiomiocitos o miocitos esqueléticos para profundizar en los mecanismos detrás de la distrofia muscular.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-muscular-dystrophy

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Se presenta un protocolo para la reprogramación eficiente de las células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) utilizando vectores retrovirales que codifican Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-myc (OSKM) y la identificación de hiPSC correctamente reprogramado por tinción en vivo con Tra- 1-81 anticuerpo.

Selección y aislamiento de las colonias de humanos células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos adultos Reprogramado

Células madre pluripotentes inducidas (iPSC)-progenitores miógenos derivados son candidatos prometedores para las estrategias de terapia celular para tratar las distrofias musculares. Este protocolo describe el trasplante y las medidas funcionales necesarias para evaluar el injerto y la diferenciación de mesoangioblastos derivados de iPSC (un tipo de progenitores musculares) en modelos de ratón de regeneración muscular aguda y crónica.

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Aquí, se describe un protocolo basado en la reprogramación epigenética de células madre embrionarias humanas (hESCs) hacia la generación de una población homogénea de células progenitoras del músculo esquelético que bajo condiciones de cultivo permisivas formar grupos tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres), que recapitulan las características biológicas de la humana los músculos esqueléticos.

Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Este protocolo describe un método detallado para la generación eficiente de iPSCs libres de integración a partir de células de sangre periférica adultas humanas. Con el uso de cuatro vectores episomales basados en oriP/EBNA para expresar los factores de reprogramación, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 y SOX2, se pueden obtener miles de colonias de iPSC a partir de 1 mL de sangre periférica.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Aquí, presentamos un protocolo de eliminación exon23 basado en Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en iPSC a partir de fibroblastos cutáneos derivados del ratón Dmdmdx y diferenciar directamente los iPSC en células progenitoras miogénicas (MPC) utilizando el sistema de activación Tet-on MyoD.

Tecnología CRISPR/Cas9 en la restauración de la expresión de distrofina en progenitores musculares derivados de iPSC

El protocolo presenta la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica para inducir células madre neurales por infección por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas dopaminérgicas, trasplante de precursores de DA en el unilateralmente-lesioned Modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson, y evaluación de la seguridad y eficacia de los precursores de DA derivados de iNSC para el tratamiento de la DP.

Generación de células madre neuronales inducidas a partir de células mononucleares periféricas y diferenciación hacia precursores de neuronas dopaminérgicas para estudios de trasplante

En este artículo, describimos un protocolo detallado para el modelado eficiente del músculo de la distrofia muscular de Duchenne usando células derivadas de orina convertidas MYOD1para evaluar la restauración de los niveles de ARNm de distrofina y proteína según el exon.

Exon Skiping en Miotubos Directamente Reprogramados obtenidos de Células Derivadas de orina humana

Este protocolo describe la conversión de fibroblastos de piel en mioblastos y su diferenciación en miotubes. Las líneas celulares se derivan de pacientes con trastornos neuromusculares y se pueden utilizar para investigar mecanismos patológicos y para probar estrategias terapéuticas.

Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

El presente protocolo describe un método para aislar, expandir y reprogramar células derivadas de orina de primates humanos y no humanos a células madre pluripotentes inducidas (iPSC), así como instrucciones para el mantenimiento sin alimentador de las iPSC recién generadas.

Generación y mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas por primates derivadas de la orina

Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas de pacientes con distrofia muscular usando células derivadas de orina y virus Sendai sin integración. Este método no invasivo permite obtener iPSCs libres de transgenes en 13 pasajes.

Generación de pluripotentes inducidas Células Madre de la distrofia muscular pacientes: Eficiente Reprogramación-Integración libre de orina células derivadas (Video) | JoVE Journal

Generación de pluripotentes inducidas Células Madre de la distrofia muscular pacientes: Eficiente Reprogramación-Integración libre de orina células derivadas

Explorar más videos