Name: La inmunoterapia sublingual como alternativa para inducir protección contra las infecciones respiratorias agudas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 56 s
Description: Aprende a usar la inmunoterapia sublingual para potenciar la inmunidad innata pulmonar y proteger contra la neumonía neumocócica en ratones. Este método ofrece una alternativa segura a la administración intranasal.

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Agradecemos al Dr. Jean-Claude Sirard del Centro de Infección e Inmunidad de Lille, Instituto Pasteur de Lille-Francia, por proporcionar amablemente la flagelina purificada y a la Dra. Teresa Camou, Directora del Laboratorio Nacional de Referencia, Ministerio de Salud de Uruguay por proporcionar amablemente la cepa neumocócica. 
Los autores desean expresar su reconocimiento a los Sres. Diego Acosta e Ignacio Turel de BichoFeo Producciones-Uruguay por su compromiso y arduo trabajo durante toda la producción y edición del video. 
Este trabajo fue apoyado por las becas PR_FCE_2009_1_2783 y BE_POS_2010_1_2544 de la Agencia Nacional de Investigación e Innovación, ANII de Uruguay, el Programa para el Desarrollo de las Ciencias Básicas, PEDECIBA de Uruguay y la Comisión Sectorial de Investigación Científica, CSIC-Universidad de la República, Uruguay.

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Los autores no tienen nada que revelar.

La administración sublingual de agentes terapéuticos ha demostrado como un medio útil para modular la respuesta inmune en el tracto respiratorio. La principal ventaja de SLIT para el tratamiento de afecciones respiratorias es que no implica la entrega directa de los compuestos en los pulmones o la nariz, siendo más seguro que los tratamientos basados ​​en la administración intranasal 31. La inmunoterapia sublingual puede utilizarse para modular la respuesta inmune de diferentes maneras, ya sea para la inducción de respuestas reguladoras que pueden mejorar los síntomas de la inflamación alérgica y el asma o 32 para inducir la activación transitoria de mecanismos inmunes innatas para tratar infecciones pulmonares agudas como se muestra aquí. El modelo de ratón se presenta en este vídeo es un método conveniente para la detección de diferentes compuestos como agentes terapéuticos para SLIT. Este modelo animal ofrece un medio útil para determinar el impactode SLIT en la respuesta inmune de los pulmones, así como en otros órganos (por ejemplo., ganglios linfáticos de drenaje o de los sitios de la mucosa distales) que no puede ser imitado por el uso de modelos in vitro. Aunque hay varios artículos que describen los resultados obtenidos con la inmunoterapia sublingual, métodos de desarrollo para los procedimientos de administración sublingual no se han facilitado todavía. Además, el modelo se puede utilizar para la evaluación de las vacunas sublinguales con el objetivo de conferir protección sistémica así como local en el tracto respiratorio. Como se muestra en el vídeo adjunto, la administración sublingual de los compuestos es un procedimiento simple que puede ser realizado fácilmente sin la necesidad de una amplia formación. Por lo general, una persona competente en el manejo de animales requerirá 1 hora para realizar la ITSL en un grupo de 10 ratones utilizando anestésicos inyectables como se describe en este protocolo. Si reto neumocócica se realiza, así, se requerirá 90 min adicional para prepararla suspensión bacteriana y realizar desafío intranasal de los animales. Los protocolos de FACS presentados aquí permiten la caracterización adecuada de impacto de la ITSL en el sitio local de la administración, ganglios linfáticos de drenaje, así como sus efectos sobre la dinámica celular de los pulmones. El análisis separado de la broncoalveolar parénquima pulmonar contenido y es importante para discriminar residente inmune de las vías respiratorias y de la infiltración de los tipos de células de las que quedan dentro del tejido. El análisis del contenido BAL permite el estudio de la facturación de los macrófagos alveolares, así como la dinámica de reclutamiento células en los espacios alveolares inducidas por diferentes tratamientos, por ejemplo., PMN, eosinófilos, monocitos. BAL también se puede utilizar para evaluar la presencia de citocinas y quimiocinas secretadas por el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o la detección de anticuerpos IgA secretados inducidos después de la vacunación sublingual. Estudio de los tejidos de los pulmonespermitirá caracterización de otros tipos de células, células dendríticas Clásicamente, las células T y células B. Preparación de muestras de BAL y los ganglios linfáticos para el análisis FACS es simple. Después de la recogida de la muestra, se requieren normalmente de 60 minutos para completar el protocolo de tinción durante 10-20 muestras. En contraste, el aislamiento de las células de los pulmones o el tejido sublingual requerirá más tiempo ya que se requiere la digestión de la matriz extracelular. La absorción del agente terapéutico administrado por vía sublingual puede abordarse mediante el seguimiento de las moléculas con fluorescencia o marcadas radiactivamente utilizando en los sistemas de formación de imágenes in vivo. La inmunoterapia sublingual es un método atractivo para inducir eficazmente las respuestas inmunes en el tracto respiratorio, así como sistémicamente que puede ser utilizado para tratar o prevenir enfermedades respiratorias. La elucidación de los mecanismos que determinan la activación vs tolerancia de la respuesta inmune en el tracto respiratorio después de SLIT ies crucial para permitir el diseño racional de nuevas estrategias terapéuticas que podrían ser utilizados solos o en combinación con tratamientos disponibles contra diferentes condiciones respiratorias.

El objetivo general de este trabajo es ilustrar los beneficios de la inmunoterapia sublingual para el tratamiento de las infecciones respiratorias agudas (IRA) y presentar las ventajas de esta vía de administración en comparación con otras vías de administración, a saber, la intranasal.
ARI causan millones de muertes cada año, especialmente en niños menores de cinco años. Streptococcus pneumoniae sigue siendo uno de los principales agentes etiológicos de la neumonía bacteriana en lactantes y ancianos1,2. En la actualidad, el principal tratamiento disponible se basa en el uso de antibióticos, pero continuamente surgen cepas resistentes3,4.
SLIT induce amplias respuestas a nivel sistémico y también a nivel de la mucosa, particularmente en el tracto respiratorio5. Tiene eficacia comprobada contra la infección por influenza, promoviendo la protección a largo plazo con la producción de respuestas humorales y celulares6,7. Además, se ha demostrado que el tratamiento profiláctico con lisados bacterianos administrados por vía sublingual redujo las exacerbaciones de la bronquitis obstructiva crónica en ancianos8 y previno infecciones respiratorias recurrentes en niños9. La SLIT ha sido ampliamente utilizada para el tratamiento de las alergias y el asma. Los estudios clínicos no solo han demostrado su eficacia para modular la respuesta inmune en las vías respiratorias, sino también su seguridad10. A pesar del creciente interés de las compañías farmacéuticas y los investigadores en SLIT, los mecanismos implicados en la inducción de respuestas inmunitarias de la mucosa después de la administración sublingual de compuestos siguen siendo oscuros. Recientemente, la atención se ha centrado en los mecanismos que promueven la tolerancia asociados con la desensibilización a los alérgenos. Se ha propuesto que las células residentes y reclutadas en la mucosa sublingual, como las células dendríticas y los macrófagos, pueden promover la tolerancia después de SLIT11-13. Las células dendríticas de la mucosa oral pueden promover las células T auxiliares productoras de IFN-gamma e IL-1011, así como recircular a la mucosa genital distal y promover las células T CD8+ 14. Sin embargo, se sabe poco sobre el impacto de SLIT en las células innatas o su capacidad para mejorar la eliminación de patógenos durante las infecciones respiratorias agudas.
El control natural de la infección neumocócica en los pulmones depende en gran medida de la activación eficiente y rápida de las defensas innatas locales. Anteriormente demostramos que la mejora de la inmunidad innata de los pulmones mediante una dosis intranasal única de flagelina (FliC), un agonista de TLR5 y NLRC4, protege al 75-100% de los ratones desafiados con una dosis letal de un aislado clínico de Streptococcus pneumoniae serotipo 1. Se demostró que esta protección depende del reclutamiento local de células GR1+ (probablemente neutrófilos polimorfonucleares, PMN) y no depende de anticuerpos, células B o T15. 
La flagelina es el componente estructural del flagelo bacteriano. En su forma monomérica es reconocido por dos receptores de reconocimiento de patógenos (PRR), el TLR5 que detecta el FliC16 extracelular y el inflamasoma NLRC4/NAIP5 que detecta la flagelina intracelular17,18. Cuando los PRR detectan FliC, se desencadena una respuesta inflamatoria importante. Nosotros y otros hemos demostrado que la instilación de FliC purificado de Salmonella enterica serovar Typhimurium en los pulmones impulsa la producción rápida de quimiocinas y citocinas, especialmente cuando son reconocidas por el epitelio de los pulmones que a su vez orquestan el reclutamiento de células inmunitarias en las vías respiratorias, principalmente PMNs15,19-21. Aunque transitoria, la infiltración sustancial de neutrófilos que tiene lugar en las vías respiratorias después de la administración nasal de FliC podría ser una preocupación si se avanza hacia terapias clínicas para uso humano. La inflamación excesiva podría ser perjudicial para la función de los pulmones. Además, se ha demostrado que la administración intranasal de moléculas inmunoestimuladoras puede causar parálisis facial y/o toxicidad cerebral22-24. 
La inmunoterapia sublingual ofrece una alternativa más segura para modular la respuesta inmunitaria en el tracto respiratorio en comparación con la vía intranasal. Es no invasivo, indoloro, sencillo y tiene un buen cumplimiento por parte del paciente25. Además, como se mencionó anteriormente, puede inducir respuestas protectoras en la mucosa respiratoria sin los riesgos asociados a la administración directa intranasal o intrapulmonar de formulaciones. La vía sublingual podría usarse alternativamente para administrar moléculas que tienen grandes efectos sobre el sistema inmunológico del pulmón, pero que se ha demostrado que son tóxicas o provocan una gran inflamación cuando se administran por vía intranasal. Además de estas ventajas, las formulaciones para la inmunoterapia sublingual tienen un menor costo de fabricación, ya que los productos no estériles se pueden administrar por esta vía y el choque endotóxico no es una preocupación para la SLIT. Por otro lado, vale la pena notar que son necesarias dosis más altas de los compuestos inmunoestimulantes en comparación con las utilizadas por vía intranasal o parenteral para inducir una respuesta inmune en los pulmones; también se necesitan soluciones altamente concentradas cuando se utiliza el modelo de ratón de SLIT, ya que el sitio anatómico donde se depositan las formulaciones es pequeño. 
Basándonos en nuestros datos publicados anteriormente, desarrollamos un modelo de protección utilizando inmunoterapia sublingual con flagelina como inmunoestimulante modelo. Demostramos que una dosis única de flagelina indujo una supervivencia del 60% contra la neumonía neumocócica invasiva causada por la cepa del serotipo 1, mientras que todos los ratones del grupo de control murieron por infección en un plazo de 5 días. El análisis de citometría de flujo mostró que se recluta un mayor número de PMN en las vías respiratorias de los animales protegidos después del tratamiento sublingual con flagelina, lo que sugiere que estas células podrían estar involucradas en el mecanismo de protección inducido por la inmunoterapia sublingual. 
Este video muestra en detalle cómo realizar inmunoterapia sublingual y también cómo recuperar tejido relevante de la mucosa sublingual, drenando los ganglios linfáticos, así como los pulmones y las vías respiratorias para realizar análisis adicionales. Además, ilustra la técnica general de preparación celular para el análisis de FACS y muestra brevemente cómo preparar suspensiones de Streptococcus pneumoniae y cómo realizar infecciones intranasales en ratones para configurar el modelo de infección aguda.

<table><tbody><tr><td>Solución de ketamina (50 mg/ml)</td><td>Pharma Service, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de xilacina (2 %)</td><td>Portinco S.A., Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa estéril de 1 ml</td><td>Modern, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aguja estéril de 27 g</td><td>Modern, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>General Electric Health Care</td><td>E15885</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>ATCC</td><td>302020</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina/estreptomicina</td><td>SIGMA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PBS estéril sin Ca2+/Mg2+</td><td>PAA</td><td>H21002</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo I</td> Life <td>Technologies/Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>desoxirribonucleasa I (ADNasa-I)</td><td>SIGMA</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 rata conjugada anti ratón IgG2b anti CD11b</td><td>BD</td><td>550993</td><td>Clon M1/70</td></tr><tr><td>APC conjugado hámster anti ratón IgG1 anti CD11c</td><td>BD</td><td>550261</td><td>Clon HL3&nbsp;</td></tr><tr><td>APC-Cy7 rata conjugada anti ratón IgG2a anti Ly6G</td><td>BD</td><td>560600</td><td>Clon 1A8</td></tr><tr><td>Solución salina estéril</td><td>Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar de soja tríptico</td><td>BD Difco, Francia</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Sangre de oveja desfibrinada</td><td>Biokey, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri Estériles</td><td>Greiner</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>p10 Pipeta</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>p20 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000097</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta</td><td>Capp</td><td>C200</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de filtro estériles p10</td><td>Greiner</td><td>771288</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de filtro estériles p200</td><td>Greiner</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de filtro estériles p1000</td><td>Greiner</td><td>750288</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BIOSAN</td><td>V1-plus</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de punta fina de acero inoxidable&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>Z168785/Z168777</td><td>Curvas y rectas</td></tr><tr><td>Pinza de tejido de vendaje</td><td>SIGMA</td><td>F4392</td><td>Longitud 8 pulgadas</td></tr><tr><td>Pinzas de microdisección</td><td>SIGMA</td><td>F4017</td><td>Recta&nbsp;</td></tr><tr><td>pinza de microdisección</td><td>SIGMA</td><td>F4142&nbsp;</td><td>curvo</td></tr><tr><td>Tijeras de mayo</td><td>SIGMA</td><td>Z265993&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>SAKIRA MEDICAL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopsia estéril Punch & Oslash; 3mm</td><td>Stiefel Laboratories Ltd.</td><td>2079D</td><td>de 5 mm de diámetro también se puede utilizar</td></tr><tr><td>Tubos estériles de 1,5 ml</td><td>Deltalab</td><td>200400P</td><td></td></tr><tr><td>Estériles de 15 ml Tubos</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Estériles de 50 ml Tubos</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estériles 5 ml</td><td>Greiner</td><td>606160</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estériles 10 ml</td><td>Greiner</td><td>607160</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estériles 25 ml</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica, clase II</td><td>Serie Thermo Scientific</td><td>1300, microaislador tipo A2</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Bastidor</td><td>RAIR&nbsp; IsoSystem&nbsp;</td><td>76144W</td><td>Super&nbsp; Ratón&nbsp; 1800 AllerZone&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>Legend Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Heraeus</td><td>Biofuge-pico</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorval ST40R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora&nbsp;</td><td>Modelo Thermo</td><td>Scientific&nbsp; 3111</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas pasteur estériles de punta fina</td><td>Deltalab</td><td>D210022</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas pasteur estériles</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>Placa estéril de 24 pocillos</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Solución azul de tripano&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Contador automático de celdas - Countess</td><td>Life Technologies</td><td>C10227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de cámara de recuento de células Countess</td> Life <td>Technologies</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de citometría de flujo</td><td>BD</td><td>343675</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo - FACS Canto-II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de PCR en tiempo real - Rotor Gene Q o ABI 7900</td><td>Qiagen / Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>Molecular Grado Biológico</td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>Life Technologies</td><td>18068-015</td><td>Biología Molecular Grado</td></tr><tr><td>ADNasa-I Buffer 10X</td><td>Life Technologies</td><td>18068015</td><td>Biología Molecular Grado</td></tr><tr><td>EDTA 25 mM</td><td>Life Technologies</td><td>18068015</td><td>Grado de Biología Molecular</td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td> Life <td>Technologies</td><td>10977</td><td>Biología Molecular Grado</td></tr><tr><td>RNAse Out</td><td>Life Technologies</td><td>100000840</td><td>Grado de Biología Molecular Imprimadores</td></tr> de <tr><td>Hexámero Aleatorio</td><td>Life Technologies</td><td>N8080127</td><td>Biología Molecular Grado</td></tr><tr><td>M-MLV-RT TAMPÓN</td><td>Life Technologies</td><td>18057-018</td><td>Biología Molecular Grado</td></tr><tr><td>M-MLV-RT enzima</td><td>Life Technologies</td><td>28025-021</td><td>Biología Molecular Grado</td></tr><tr><td>QuantiTect Syber Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td>Biología Molecular Grado</td></tr><tr><td>Específico de Biología Molecular&nbsp;</td><td>Grado de Biología Molecular</td> <td>de Life Technologies</td><td></td></tr></tbody></table>

la inmunoterapia sublingual como alternativa para inducir protección contra las infecciones respiratorias agudas

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

La ruta sublingual se ha utilizado ampliamente para introducir pequeñas moléculas en el torrente sanguíneo y modular la respuesta inmunitaria en diferentes sitios. Se ha demostrado que induce eficazmente respuestas humorales y celulares en sitios sistémicos y mucosos, es decir, los pulmones y el tracto urogenital. La vacunación sublingual puede promover la protección contra las infecciones en el tracto respiratorio inferior y superior; También puede promover la tolerancia a los alérgenos y mejorar los síntomas del asma. La modulación de la respuesta inmunitaria pulmonar mediante inmunoterapia sublingual (SLIT) es más segura que la administración directa de formulaciones por vía intranasal porque no requiere la administración de moléculas potencialmente dañinas directamente en las vías respiratorias. A diferencia de la administración intranasal, los efectos secundarios que implican toxicidad cerebral o parálisis facial no son promovidos por la SLIT. Los mecanismos inmunitarios subyacentes a la SLIT siguen siendo difíciles de alcanzar y su uso para el tratamiento de las infecciones pulmonares agudas aún no se ha explorado. Por lo tanto, es necesario desarrollar modelos animales apropiados de SLIT para explorar más a fondo sus posibles ventajas. 
Este trabajo muestra cómo realizar la administración sublingual de agentes terapéuticos en ratones para evaluar su capacidad de protección contra la neumonía neumocócica aguda. Se ilustran los aspectos técnicos de la manipulación del ratón durante la inoculación sublingual, la identificación precisa de la mucosa sublingual, el drenaje de los ganglios linfáticos y el aislamiento de tejidos, el lavado broncoalveolar y los pulmones. Se describen en detalle los protocolos para la preparación de suspensiones de una sola célula para el análisis FACS. Se discuten otras aplicaciones posteriores para el análisis de la respuesta inmune. También se explican los aspectos técnicos de la preparación del inóculo de Streptococcus pneumoniae y la provocación intranasal de ratones.
SLIT es una técnica sencilla que permite el cribado de moléculas candidatas para modular la respuesta inmunitaria de los pulmones. Los parámetros que afectan el éxito de SLIT están relacionados con el tamaño molecular, la susceptibilidad a la degradación y la estabilidad de las formulaciones altamente concentradas.

La inmunoterapia sublingual puede ser utilizado con éxito para modular la respuesta inmune pulmones. Hemos demostrado que una sola dosis de flagelina, el agonista de TLR5 y NLRC4, puede inducir la regulación al alza significativa del ARNm que codifica el CXCL1 quimiocinas, CCL20 y la citoquina IL-6 en comparación con los controles tratados con solución salina. Dobla la inducción de los niveles de mRNA alcanzó un máximo de 8 horas después de la ITSL y volver a los niveles basales después de 20 horas (Figura 1). Sin embargo, cuando SLIT se realizó 2 horas antes de la infección intranasal con S. Pneumoniae, los niveles de CXCL1 e IL6 mRNA permanecieron significativamente upregulated incluso 24 horas después de SLIT comparación con los animales no tratados (Figura 2). Análisis de las poblaciones de células en el BAL y tejido pulmonar por FACS reveló que los animales tratados con FliC por vía sublingual habían aumento del número de neutrófilos en las vías respiratorias, pero no en el tejido de los pulmones (Figura 3). la Figura 4, la SLIT con flagelina promovió la protección y el aumento de la supervivencia contra la neumonía neumocócica aguda. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.7in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig1highresV2.jpg" width="680"> Figura 1. Cinética de perfil transcripcional de los pulmones después de la inmunoterapia sublingual con flagelina. Ocho a 10 semanas de edad ratones BALB / c (n = 4) fueron tratados con 10 g de flagelina o solución salina por vía sublingual bajo anestesia. Los pulmones se recogieron en diferentes puntos de tiempo y se colocaron en conservante de ácido nucleico. Extracción de RNA total se realizó y se sintetizó ADNc. niveles de mRNA fueron evaluados por PCR en tiempo real utilizando los cebadores específicos enumerados en Table 1. cuantificación relativa se realizó de acuerdo? Ct método usando niveles Actb de ARNm para la normalización. Los resultados se muestran como veces mayor en comparación con el grupo de solución salina tratada como mediana ± SEM. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p &lt;0,05), calculado de acuerdo con la prueba de Mann-Whitney. Los resultados son representativos de 2 experimentos independientes. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6.2in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig2highresV2.jpg" width="660"> Figura 2. perfil transcripcional pulmones durante la neumonía neumocócica después de la inmunoterapia sublingual con (n = grupo tratado para n = 4 para el grupo control y 7) flagelina. Ocho a 10 semanas de edad ratones BALB / c fueron tratados con 10 g de flagelina o solución salina por vía sublingual bajo anestesia. 2 horas más tarde los ratones se expusieron por vía intranasal con la dosis letal mínima (MLD), causando 100% de mortalidad de un aislamiento clínico de S. pneumoniae serotipo 1 E1585, correspondiente a 4x10 5 UFC / l 50. Se recogieron los pulmones 24 h después del desafío y se almacenan en conservante de ácido nucleico hasta la extracción de ARN y síntesis de ADNc se llevaron a cabo. PCR en tiempo real se llevó a cabo (Ver la lista de cebadores en la Tabla 1) y la cuantificación relativa se realizó de acuerdo? Ct método utilizando niveles de ARNm Actb para la normalización. Los resultados se muestran como veces mayor en comparación con el grupo de solución salina tratada como mediana ± SEM. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p &lt;0,05), calculado de acuerdo con la prueba de Mann-Whitney. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig3highresV2.jpg" width="680"> Figura 3 Análisis de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) el reclutamiento en el tejido de las vías respiratorias y pulmones después de la ITSL. Ocho a10 semanas de edad ratones BALB / c (n = 4) fueron tratados con 10 g de flagelina o solución salina por vía sublingual bajo anestesia. 2 horas más tarde los ratones se expusieron por vía intranasal con la MLD de S. pneumoniae serotipo 1 E1585. 24 horas después de la exposición, BAL se realizó y los pulmones se procesaron para el análisis FACS. PMN se identificaron como células CD11b Ly6G altas / alta / CD11c negativos y basado en el perfil FCS-SSC. Los resultados se expresan como porcentaje de PMN con respecto del número total de células en BAL o los pulmones. Las barras representan media ± SEM. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p &lt;0,05), calculado de acuerdo con una sola vía de Mann-Whitney. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.3in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig4highresV2.jpg" width="530"> Figura 4. SLIT con flagelina protege a los ratones contra la neumonía neumocócica aguda. S. pneumoniae serotipo 1 E1585. La supervivencia se evaluó sobre una base diaria. Las curvas de Kaplan-Meier se compararon según test de Log-rank (Mantel-Cox). Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p &lt;0,05) .Results son representativos de 2 experimentos independientes. <table align="center" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td> Nombre </td><td> Secuencia 5'-3 ' </td><td> Longitud del producto de PCR (pb) </td></tr><tr><td> mB-actin_F </td><td> GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT </td><td rowspan="2"> 68 </td></tr><tr><td> mB-actin_R </td><td> CGTCATCCATGGCGAACTG </td></tr><tr><td>mCCL20_F </td><td> TTTTGGGATGGAATTGGACAC </td><td rowspan="2"> 69 </td></tr><tr><td> mCCL20_R </td><td> TGCAGGTGAAGCCTTCAACC </td></tr><tr><td> mCXCL1_F </td><td> CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA </td><td rowspan="2"> 84 </td></tr><tr><td> mCXCL1_R </td><td> ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT </td></tr><tr><td> mIL-6_F </td><td> GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA </td><td rowspan="2"> 78 </td></tr><tr><td> mIL-6_R </td><td> AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA </td></tr><tr><td> mTNFalpha_F </td><td> CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA </td><td rowspan="2"> 63 </td></tr><tr><td> mTNFalpha_R </td><td> CCTCCACTTGGTGGTTTGCT </td></tr><tr><td> mCxcl2_F </td><td> CCCTCAACGGAAGAACCAAA </td><td rowspan="2"> 72 </td></tr><tr><td> mCxcl2_R </td><td> CACATCAGGTACGATCCAGGC </td></tr></tbody></table> Tabla 1 lista Primer utilizado para el análisis de PCR en tiempo real. Secuencias de cebadores específicos utilizados para el análisis qPCR. Adelante y cebadores para ACTB ratón revertir, Cccl20, CXCL1, Il6, TNFa y CXCL1 se presentan como secuencias 5'-3 'y la longitud de producto esperado se indica en pares de bases (pb).

El presente trabajo ilustra la conveniencia de utilizar la inmunoterapia sublingual para estimular la respuesta inmune innata en los pulmones y conferir protección contra la neumonía neumocócica aguda en ratones.

La inmunoterapia sublingual como alternativa para inducir protección contra las infecciones respiratorias agudas

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la inmunoterapia sublingual para estimular la respuesta inmunitaria innata en los pulmones y brindar protección contra la neumonía neumocócica letal. En ratones, el primer paso consiste en administrar una solución con el agente inmunoestimulante bandera en la mucosa sublingual de un ratón anestesiado. A continuación, una suspensión que contiene una dosis letal de una cepa génica de neumonía por estreptococo se instila por raíz intranasal a ratones anestesiados previamente tratados con línea plana o solución salina como control.El broncobilar se realiza para analizar la subpoblación que se infiltra en las vías respiratorias y se procesa el tejido pulmonar para obtener una suspensión unicelular para la caracterización fenotípica de la población celular. Mediante la citometría de flujo multiparamétrica mandibular, los ganglios linfáticos mandibulares accesorios, así como el tejido sublingual, también se pueden procesar para realizar citometría de flujo u otros análisis posteriores. Poblaciones celulares que se infiltran en las vías respiratorias.Los pulmones o la mucosa sublingual se pueden identificar mediante fenotipado inmune y citometría de flujo multiparamétrica La activación inmune en diferentes tejidos después de la inmunoterapia sublingual también se puede analizar mediante el estudio del perfil de transcripción mediante PCR en tiempo real. Bienvenidos al Laboratorio de Investigación de Vacunas en el Departamento de Biotecnología, estamos asignando la facultad de medicina, universidad de U.U. Uno de los principales intereses de nuestro laboratorio es generar nuevas estrategias para de intervención inmune contra infecciones respiratorias. La vía interna se ha utilizado con éxito para la administración de agentes inmunoestimuladores para tratar o prevenir infecciones pulmonares o de diferentes tipos.Hemos demostrado que la administración intranasal, el componente del gel bacteriano, se puede utilizar eficazmente para combatir la infección pulmonar en curso causada por ratones STO. Aunque la raíz intranasal normalmente requiere una dosis baja del agente terapéutico e induce una fuerte respuesta en el tracto respiratorio, tiene algunos inconvenientes como la posibilidad de toxicidad en el sistema nervioso central y parálisis de la facia asociada con la absorción de compuestos inmunoestimulantes a través de los nervios oratorios. Por lo tanto, hemos establecido un modelo de inmunoterapia UAL como alternativa para inducir inmunidad protectora contra la neumonía neumocócica.La inmunoterapia sublingual ofrece una alternativa más segura en comparación con la instalación intranasal. Es no invasivo, indoloro y sencillo. Aunque puede requerir dosis más altas de un agente terapéutico, se puede utilizar para administrar NA o productos farmacéuticos para, en última instancia, modular la respuesta inmunitaria en la duración.A continuación, le mostraremos cómo realizar la administración sublingual en ratones utilizando el halagador como agente terapéutico. La inmunoterapia con halagos puede eventualmente proteger a los ratones de un desafío intranasal letal con una neumonía por estreptococo al desencadenar una respuesta inmune innata en el pulmón. También abordaremos la caracterización de la longitud, la respuesta innata durante la infección y después de la inmunoterapia sublingual mediante geometría fluida y PCR en tiempo real.Finalmente, le mostraremos cómo recolectar ganglios linfáticos de grano local y tejido sublingual para un análisis más detallado. Después de preparar la solución del agente estimulador que se va a probar, anestesiar a los animales administrando 200 microlitros de la solución de Ketamina OSI por Inyección Interperitoneal Pet la solución que contiene el inmunoestimulante en un volumen máximo de 10 microlitros. A continuación, tome el ratón con la mano izquierda y sujételo con el pulgar y el índice con la mano libre.Coloque suavemente las pinzas cerradas debajo de la lengua y manténgala en su lugar. Con los dedos medio y anular, tome la pipeta y administre la solución en el suelo de la boca y en la parte dorsal de la lengua. Retire las pinzas y deje que la boca descanse durante tres a cinco minutos antes de volver a colocarla en la jaula.Las características clave de esta técnica son el volumen total utilizado para tratar a los animales y la anestesia. El pequeño tamaño de los ratones de cavidad oral limita el volumen máximo que se puede aplicar a la relación sublingual a 10 microlitros. Una vez decidida la dosis, hay que ajustar la concentración de la muestra a ese volumen máximo.Los volúmenes más grandes podrían resultar en una deglución o aspiración no deseada de la solución. La anestesia es crucial para evitar la deglución y permitir la penetración de las sustancias a través del epitelio. Le aconsejamos que no utilice la inhalación para anestesiar ya que los ratones se despertarán demasiado pronto.Ten en cuenta que algunos anestésicos inyectables pueden inducir la salivación en ratones. Si eso sucede, use un pequeño trozo de papel o papel para eliminar el exceso de salivación antes de aplicar la solución con el agente terapéutico, se debe ajustar la dosis del agente terapéutico para maximizar su efecto y se recomienda encarecidamente probar varias dosis. Si anteriormente usa su compuesto por raíz intranasal, una dosis de cinco a 10 veces mayor sería un buen punto de partida para probar.Pruebe su agente terapéutico por la raíz sublingual. Tenga en cuenta que la absorción a través del epitelio estará limitada por Tamaño de la molécula descongelar Una alícuota de material de trabajo previamente preparado de neumonía por estreptococo de número de UFC bacteriana conocida centrifugar durante cinco minutos a 2, 500 Gs y desechar el supernado Suspender en un mililitro de solución salina y centrífuga. De nuevo, desecha el sobrenadante y luego descansa.Suspender el pellet en el volumen adecuado de solución salina estéril para obtener una suspensión de cuatro veces 10 a las cinco UFC en 50 microlitros, que corresponde a la dosis bacteriana mínima del serotipo particulado utilizado que causa el 100%de mortalidad en bulbo C.Los ratones toman 50 microlitros de la suspensión bacteriana e instilan cuidadosamente el volumen total en las fosas nasales de un ratón previamente anestesiado. Sostenga el mouse en posición vertical durante dos minutos y déjelo reposar en posición dorsal durante dos minutos más. Después del desafío, se confirmaron los números de UFC en la suspensión bacteriana mediante la dilución en serie de diez veces la suspensión y se colocaron en la sangre.Placa de agar Incubar durante la noche a 37 grados con 5% de CO2 muco. Las colonias de etnogramas se pueden distinguir por el alo verde característico de las bacterias alfa hemolíticas. Cuente las unidades formadoras de colonias y registre el uso de la dosis de desafío.Después de sacrificar al animal, abra la cavidad torácica hasta el cuello. Haga una incisión a lo largo de las patas delanteras para exponer la tráquea y el área sublingual. Identificar los ganglios linfáticos mandibulares.Por lo general, aparecen como estructuras de forma ovalada blanquecina que se encuentran sobre las glándulas salivales. Con las pinzas curvas de punta fina, tire suavemente hacia arriba del tejido sublingual y exponga el lado dorsal del suelo de la boca. Tome los ganglios linfáticos mandibulares tirando suavemente hacia arriba con las pinzas de punta delgada central para liberarlos del tejido.Colóquelos en un tubo que contenga C-R-P-M-I o una solución de conservante de ácido nucleico de acuerdo con el procedimiento posterior. Eso se llevaría a cabo más adelante. Ahora identifique los ganglios linfáticos más pequeños ubicados más profundamente a ambos lados de la garganta y sáquelos.Estos son los ganglios linfáticos mandibulares accesorios. Abrir la cavidad torácica para exponer el pulmón y extirpar el timo. Cortar el ACV binna inferior y eliminar el exceso de sangre con un tejido absorbente para realizar el broncolavado.Primero, exponga la tráquea. A continuación, haz una pequeña incisión con un bisturí e introduce una punta fina. Transfiera peppe previamente llenado con un mililitro de PBS sin calcio y magnesio más un milimolar EDA Instilar cuidadosamente y aspirar el volumen total al menos tres veces.A continuación, aspire y transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 mililitros. Perfundir los pulmones inyectando cinco mililitros de PBS sin calcio y magnesio más un milimolar de EDTA en el ventrículo derecho del corazón para eliminar todos los glóbulos rojos y las células inmunitarias presentes en los vasos sanguíneos de los pulmones. Si la perfusión se realizó correctamente, el color de los pulmones cambiará de rosa a blanco.Extraer el corazón, tomar los pulmones perfundidos y colocarlos en medio completo o en una solución conservante de ácido nucleico dependiendo del análisis posterior a realizar. Si desea analizar la población celular en la mucosa sublingual, aísle la cabeza del animal y retire las glándulas salivales y adjunte el tejido blando. Realizar una incisión a cada lado de la boca hasta llegar a la articulación de la mandíbula y separar la mandíbula inferior junto con la lengua y el suelo de la boca.Con un par de pinzas romas para dientes de rata, levanta la lengua y haz una incisión donde la base de la lengua se une con el suelo de la boca. Esta zona constituye la mucosa sublingual. Corte y retire la lengua con un punzón de biopsia, fórceps y tijeras.Corte el tejido de la mucosa sublingual y colóquelo en un tubo limpio. Transfiera los pulmones a una placa de 24 pocillos y hágalos con unas tijeras limpias. Añadir un mililitro de medio de digestión, pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces e incubar a 37 grados y 5%CO2 durante 40 minutos después de la incubación.Pipetear hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que la mayoría de las células se hayan liberado del tejido. Transfiera la suspensión de celdas a un colador de celdas de malla 40 micro y lávelo con cinco mililitros de PBA. Centrífuga EDTA de cinco milimolares a 2.500 GS cinco minutos.Reus suspende células en un mililitro fax EDTA compuesto por PBS sin calcio, magnesio, un milimolar de EDTA y un 1% de suero fetal boing. Tome una QU y haga una dilución doble de las células con trip y blue y cuente, suspenda las células de Reus a una concentración de dos por 10 a las siete células por mililitro y agregue 50 microlitros por tubo. Agregue 50 microlitros de una mezcla de anticuerpos dos veces a cada tubo para el análisis inmunofenotípico.Incubar durante 30 minutos en hielo en la oscuridad después de lavar tres veces con facts. EDTA resuspende las células en 200 microlitros de EDTA y analiza en un citómetro, el mismo procedimiento se puede utilizar para analizar la población celular en el tejido sublingual mediante el uso de medios de digestión que contienen este espacio. La colagenasa y la inmunoterapia sublingual DS one con línea plana purificada, un agonista de TLR cinco y LC cuatro, indujeron una regulación positiva significativa de los niveles de ARNm de quimiocinas y citocinas involucradas en el reclutamiento de neutrófilos en los pulmones.Esto también se observó durante la infección. El reclutamiento de PMN en los pulmones se confirmó mediante citometría de flujo. El tratamiento sublingual con cinco agonistas de TLR se correlacionó con una mayor supervivencia de los animales y protección contra la neumonía neumocócica.Hemos demostrado que la inmunoterapia sublingual es un medio eficaz para inducir la protección de las líneas contra la neumonía neumocócica PNE invasiva. Esto se logró mediante la instalación sublingual de lain, un sastre cinco agonistas que no es producido por la histo neumonía. La instalación sublingual de lain indujo una regulación positiva de la quimiocina C Xcl L en las líneas, así como la infiltración de neutrófilos.Un tipo de células que son cruciales para eliminar el neumococo, la inmunoterapia sublingual con agonistas TLR podría usarse para tratar infecciones solas o en combinación con terapias actuales como el tratamiento con antibióticos para prevenir la diseminación bacteriana y el desarrollo de formas graves de infección. La raíz sublingual también se puede utilizar para administrar la vacuna y se ha demostrado que es eficaz para inducir inmunidad protectora mucosa y sistémica. Esta estrategia es de particular interés en el caso de las infecciones respiratorias y especialmente para las bronneumonías, ya que no solo podría prevenir la enfermedad de base, sino también la colonización asal bloqueando las bacterias en el deporte de entrada.En general, creemos que la vía sublingual es una alternativa atractiva para desarrollar nuevas estrategias de tratamiento o prevención de infecciones respiratorias. Te animamos a que pruebes esta técnica.

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Procedimientos experimentales para la posterior extracción de los tejidos linfáticos para probar la activación de las células dendríticas linfoides se describen después del tratamiento de un nanomaterial inmunoestimulante.

Evaluación de inmunoestimulantes agente: Linfoide inyección y extracción de tejido dendrítico de la célula dependiente de la ruta de activación

Descrito es la preparación de nanopartículas liposómicos antigénicas y su uso en estimular la activación de células B en vitro e in vivo. Respuestas de anticuerpos consistente y robusto condujeron al desarrollo de un nuevo modelo de la alergia del cacahuete. El protocolo para la generación de liposomas antigénicas puede ampliarse a los diferentes antígenos y vacunas.

Liposomas antigénicos para la generación de anticuerpos específicos de la enfermedad

Aquí presentamos un elegante protocolo para la evaluación en vivo de la vacuna eficacia y anfitrión inmunorespuestas. Este protocolo puede ser adaptado para modelos de vacuna que estudian viral, bacteriana o parásitos patógenos.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para inducir una lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacáridos intratraqueales y para realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar y tejido pulmonar. La mínima invasividad, el manejo simple, la buena reproducibilidad y la valoración de la gravedad de la enfermedad son ventajas de este enfoque.

Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal

Este artículo describe y demuestra la administración de vacunas intranasales y la colección de leche de los conejos lactantes (Cuniculus de Oryctolagus) como medios de evaluar inmunidad de la mucosa en un modelo traslacional apropiado de la inmunización maternal.

Inmunización intranasal y recolección de leche en estudios de inmunización materna en conejos blancos de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus)

En este estudio, se ha demostrado que una técnica no invasiva de instillación endotraqueal desarrolla AL en ratas utilizando un laringoscopio básico para asegurar una entrega precisa de LPS a los pulmones. El LPS se administra mediante un tubo endotraqueal mediante un laringoscopio. La magnitud de la lesión pulmonar se evalúa en varios momentos.

Administración endotraqueal no invasiva de lipopolisacáridos para inducir daño pulmonar agudo en roedores

Aprende a usar la inmunoterapia sublingual para potenciar la inmunidad innata pulmonar y proteger contra la neumonía neumocócica en ratones. Este método ofrece una alternativa segura a la administración intranasal.

La inmunoterapia sublingual como alternativa para inducir protección contra las infecciones respiratorias agudas

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