Name: Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprende a desarrollar un modelo de lesión pulmonar inducida por Pseudomonas aeruginosa en ratones mediante inyección intratraqueal. Este método permite estudiar la inflamación, muerte celular y reparación alveolar en lesión pulmonar aguda.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud HL105947-01 (YL), HL07829-16 (AM), HL090152 (AM).

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Protección de los Animales y de los Comités Institucionales de Bioseguridad de la Universidad de Illinois en Chicago. NOTA: Todos los procedimientos que involucran pseudomonas deben realizarse con nivel de bioseguridad 2 (BSL2) prácticas, que incluyen pero no se limitan a: la máscara, protección para los ojos, bata o mono, y guantes dobles. Trabajar en la certificación de Bioseguridad gabinete. Tratar a los instrumentos en contacto con las bacterias con desinfectante a base de lejía o cloro dióxido. Use una caja sellada para muestras de transporte. 1. P. aeruginosa cultura y Crecimiento <ol><li> Tienda P. aeruginosa PA103 como una acción bacteriana en un tapón de rosca criovial a -80 ° C. </li><li> Coloque el vial en un estante en una caja con un 70% de etanol mojado toallas de papel y llevarlo al laboratorio de Bioseguridad Nivel 2 (BSL2). </li><li> Racha de las bacterias sobre placas de agar sangre de oveja y crecen a 37 ° C durante ~ 15 horas en una incubadora. </li&gt; <li> En una campana BSL2, rayar las bacterias de la placa con el lazo bacterias y volver a suspender en 5 ml de PBS. </li><li> Guarde el archivo a 4 ° C durante un máximo de 3 meses. Sin embargo, determinar el título cada 2 semanas. </li><li> En serie diluir las bacterias en PBS (por lo general de 1:10 a 1:10 4 7) y la placa de la dilución conocida en placas de agar sangre de oveja. </li><li> Incubar las placas durante ~ 15 h. Recuento de las colonias y calcular formadoras de colonias Unidad (CFU) para determinar la concentración de bacterias. </li><li> Resuspender las concentraciones apropiadas (~ 5 x 10 3 UFC / l) en 0,5 ml de PBS en 1,5 ml crioviales estériles con tapón de rosca. Selle los crioviales y colocarlos en un estante criovial en desinfectantes toallas de papel cargado en una caja de tapa a presión. </li><li> Transporte el cuadro de instalación para animales BSL2. Una vez allí, abrir la caja en el armario BSL2. </li></ol> 2. P. aeruginosa instilación <ol><li> Lleve a cabo la cirugía aséptica supervivencia (guantes estériles, instrumentos estérilesy técnicas asépticas). Utilice un paño estéril para proporcionar una superficie de trabajo para (autoclave) los instrumentos quirúrgicos estériles. Esterilizar los instrumentos utilizando un esterilizador de cuentas caliente entre cada procedimiento de instilación traqueal. </li><li> Pesar los ratones antes de la anestesia. Anestesiar a los ratones con ketamina (100 mg / kg), xilazina (5 mg / kg), en 0,1-0,2 ml de PBS por vía intraperitoneal (ip). Determinar la eficacia de la anestesia por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie. Use un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia. </li><li> Restringir los ratones en un tablero quirúrgico en el gabinete BSL2. </li><li> Identificar el área para el corte hacia abajo. Afeitado esta área y preparar la piel con 3 veces alternando con el alcohol y povidona hisopos de yodo. </li><li> Tratar el área de la incisión con anestesia local (lidocaína), ya que la anestesia es suficiente para una cirugía menor, tales como una incisión en la piel para acceder a la tráquea. </li><li> Haga una pequeña incisión (aproximadamente 5 mm) en la línea media del cuello, y el uso de f romaorceps para mover suavemente el músculo para el acceso a la tráquea. Exponer la tráquea por la disección quirúrgica. </li><li> Dibuje solución de bacterias en una jeringa desechable de 1 ml con aguja 27 G. Para cada ratón, administrar 20-30 l de bacterias a la concentración apropiada (hasta 10 5 CFU cada ratón). </li><li> Insertar la aguja en la tráquea. Inyectar la solución lentamente en el traqueal. </li><li> Asegúrese de que los jadeos de los animales, que por lo general indica que la solución ha alcanzado en el pulmón. </li><li> Cierre la herida con suturas estériles (6-0 monofilamento) en condiciones asépticas. </li><li> Utilice 0,1 mg / kg de buprenorfina por inyección subcutánea como post-op analgesia para controlar el dolor post-quirúrgico. </li><li> Asegúrese de que el tiempo requerido desde la inducción anestésica inicial a la incisión de cierre es inferior a 15 min. </li><li> Después de la inyección, desechar las jeringas y agujas en un recipiente previsto apropiado. </li><li> Tratar a los instrumentos quirúrgicos con DISI basado dióxido de cloronfectant durante 15 minutos, enjuagar y volver al laboratorio para su esterilización y reutilizar cuando sea necesario. </li><li> La casa de los ratones individualmente en jaulas limpias en ambiente cálido. </li><li> Compruebe en el animal cada 30 minutos hasta que se recupera la conciencia y empieza a moverse; y posteriormente a intervalos de 12 h durante los primeros 3 días después de la cirugía. </li><li> Mantener los ratones en las instalaciones de BSL2 animales durante todo el experimento. Asegúrese de que sólo el tejido contenido en la caja sellada salgan de la instalación BSL2 animal. Si los ratones expresan cualquiera de los comportamientos moribundas (definido como dificultad respiratoria, letargo, falta de deambular en respuesta a la estimulación suave) en cualquier punto en el estudio, la eutanasia a los ratones mediante inhalación de CO2 de una fuente embotellada seguido por dislocación cervical. </li><li> La eutanasia el sujeto experimental por desangrado bajo anestesia. <ol><li> Recoger el tejido pulmonar de los ratones sacrificados. Llevar a cabo estos procedimientos en una capucha BSL2. Si es necesario, transferir la muestra utilizando tubos sellados colocados en un rack en desinfectantes toallas de papel cargado en una caja de tapa a presión para su posterior proceso. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El modelo de lesión pulmonar por Pseudomonas ratón que describimos aquí imita todo el proceso de la inflamación, lesión pulmonar, la reparación, y la resolución que se producen después de una lesión pulmonar aguda o neumonía. Tiene ventajas únicas en comparación con varios otros modelos de lesión, ya que es clínicamente relevante y relativamente seguro y fácil de manejar. El paso crítico en el procedimiento es que la inyección de solución de bacterias tiene que ser muy lenta. Si la inyección...

Los pulmones están expuestos a los patógenos ambientales y son susceptibles a la inflamación y lesión de 1-3. Durante condiciones patológicas tales como la neumonía o síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA), patógenos, así como los factores inflamatorios liberados por los leucocitos inducen lesiones y la muerte de las células alveolares 1-3. Es importante desarrollar modelos animales de lesión pulmonar aguda para facilitar el estudio de la patología de la lesión, así como mecanismo de reparación. En la actualidad, la mayoría de las personas utilizan modelos de lesión pulmonar hyperoxia y bleomicina ratón inducida 4. Sin embargo, los mecanismos de hiperoxia causaron daño no son los mismos que la mayoría de las lesiones pulmonares comunes que se producen durante la neumonía o el SDRA 5. La bleomicina lesión aguda inducida es raro en un contexto clínico 4. Aquí mostramos un modelo de lesión pulmonar de ratón utilizando la inyección intra-traqueal de P. aeruginosa 6,7. Este modelo es clínicamente relevante, e imita el procesos que suceden después de la neumonía 8. Como un patógeno oportunista, nosocomial de individuos inmunocomprometidos, P. aeruginosa típicamente infecta el tracto pulmonar, tracto urinario, quemaduras, heridas, y también causa otras infecciones de sangre 6. Las bacterias liberan factor de virulencia exotoxina A, se multiplican y desencadenan respuestas inmunes 6. Administración intra-de la tráquea de P. aeruginosa refleja la situación en la exposición humana a las bacterias que causan la neumonía y la patología es probable que sea diferente del modelo de lesión informado recientemente de virus de la gripe H1N1 pulmonar inducida 9. Desde P. aeruginosa es un patógeno oportunista, es relativamente seguro de manejar en comparación con algunos de los patógenos más virulentas. Aquí hemos utilizado la inyección intra-traqueal para administrar las bacterias porque se observó que este método introduce más bacterias en la región distal alvéolos del pulmón en comparación conalgunos otros procedimientos, tales como el uso de un catéter a través de la boca. En comparación con otros modelos de lesión pulmonar aguda, la P. aeruginosa modelo aquí descrito es adecuado para el estudio de la lesión pulmonar inducida por bacterias y por la inflamación excesiva. A diferencia de otros modelos animales que utilizan P. aeruginosa para inducir la sepsis 10,11, aquí utilizamos la inyección intra-traqueal de estas bacterias para inducir la lesión pulmonar aguda localizada.

<table><tbody><tr><td>Anestésico: Ketamina, xilacina, lidocaína, buprenorfina</td><td></td><td></td><td>aguja de grado farmacéutico</td></tr><tr><td>de 27 G</td><td>Jeringa de</td><td>1482648</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Tijeras 14823434</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>pinzas de herramientas</td><td></td><td></td>de Fine<td></td></tr><tr><td></td><td>Science Herramientas</td><td></td><td></td>de Fine Science</tr><tr><td>sutura&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>19-037-526</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de ojos, guante, bata</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de bioseguridad desinfectante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>a base de dióxido de cloro</td> Placas de agar sangre de oveja <td>Clidox</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Suministro Medex</td><td>HL-1160</td><td></td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar modelo

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Con el fin de estudiar la lesión pulmonar aguda humana y la neumonía, es importante desarrollar modelos animales para imitar varias características patológicas de esta enfermedad. Aquí hemos desarrollado un modelo de lesión de pulmón de ratón mediante inyección intra-traqueal de bacterias Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa o PA). Utilizando este modelo, hemos sido capaces de mostrar la inflamación pulmonar en la fase temprana de la lesión. Además, la barrera epitelial alveolar leakiness se observó mediante el análisis de lavado broncoalveolar (BAL); y la muerte celular alveolar se observó mediante el ensayo Tunel utilizando tejido preparado a partir de pulmones lesionados. En una fase posterior después de una lesión, se observó la proliferación de células requerido para el proceso de reparación. La lesión se resolvió 7 días desde el inicio de P. inyección aeruginosa. Este modelo imita el curso secuencial de la inflamación pulmonar, daño y reparación durante la neumonía. Este modelo animal clínicamente relevante es adecuado para el estudio de la patología, el mecanismo de reparación, fespués de la lesión pulmonar aguda, y también puede ser utilizado para probar agentes terapéuticos potenciales para esta enfermedad.

A partir de 24 a 72 h después de P. inyección aeruginosa, aumento de la celularidad se observó en secciones de pulmón (Figura 1A-D). El pulmón comenzó a recuperarse a partir de 96 horas después de la lesión (Figura 1E). A los 7 días después de la P. aeruginosa, la morfología normal de los alvéolos fue restaurada en gran medida (Figura 1F). Tinción Túnel secciones usando pulmonares prepararon a 24 h después de P. aeruginosa mostró la m...

Hemos desarrollado un modelo de lesión pulmonar en ratón mediante inyección intratraqueal de la bacteria Pseudomonas aeruginosa. Este modelo imita la lesión pulmonar durante la neumonía y es clínicamente relevante.

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

El objetivo general de este procedimiento es imitar la neumonía, condiciones de lesión pulmonar en el ratón por la administración de pseudomonas aerogen. Esto se logra preparando primero pseudomonas en la concentración adecuada para la inyección. En el segundo paso, la tráquea del ratón se expone cuidadosamente y luego las bacterias se administran a los pulmones mediante inyección intratraqueal.En el paso final, se monitorea cuidadosamente la progresión de la enfermedad en el ratón. En última instancia, la inflamación pulmonar, los cambios en la muerte celular en la barrera alveolar y la reparación pulmonar se pueden estudiar en el pulmón de ratón inyectado con pseudomonas aerogen. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la lesión pulmonar aguda causada por la neumonía.Como este modelo imita los procesos que siguen a la neumonía Para crear cuatrimestres de p Aerogen, PA 1 0 3 para la instalación comience transportando un vial criogénico de las bacterias a menos 80 grados Celsius, almacenamiento al nivel de bioseguridad dos o BSL dos laboratorio en un estante en una caja forrada con toallas de papel mojadas con etanol al 70%. Luego, bajo una raya de dos campanas BSL, las colonias bacterianas P aerogen PA 1 0 3 en placas de agar sangre de oveja, y crecen las colonias en una incubadora de 37 grados centígrados. Después de aproximadamente 15 horas, use un circuito de bacterias para transferir las colonias a cinco mililitros de PBS.Luego, diluya en serie las bacterias en más PBS a uno a 10, a cuatro, a uno a 10 a siete concentraciones y extienda la dilución en placas de agar sangre de oveja fresca. Luego, después de otras 15 horas de incubación, calcule las unidades formadoras de colonias para cada placa para determinar la concentración de bacterias. A continuación, Eloqua la cantidad adecuada de bacterias en 0,5 mililitros de PBS en 1,5 mililitros, viales criogénicos estériles con tapón de rosca y, a continuación, coloque los viales sellados en una rejilla de viales criogénicos sobre toallas de papel cargadas de desinfectante en una caja con tapa a presión en un armario de dos BSL, cubra suavemente los ojos del animal con ungüento de veto que funcione.Afeitar rápidamente la incisión y limpiar la piel utilizando hisopos alternos de alcohol y povidona yodada tres veces y confirmar la sedación con los dedos de los pies. Pellizque, sujete al ratón sobre una tabla quirúrgica después de tratar la piel con un anestésico local. A continuación, haga una pequeña incisión de cinco milímetros en la línea media del cuello del animal y utilice unas pinzas romas para mover suavemente el músculo y acceder a la tráquea.Cuando la tráquea haya estado expuesta, extraiga hasta una vez 10 a las cinco unidades formadoras de colonias de la bacteria en 20 a 30 microlitros de PBS en una jeringa desechable de un mililitro equipada con una aguja de calibre 27. A continuación, inserte la aguja en la tráquea e inyecte lentamente la solución. Asegúrese de que el animal jadee, lo que generalmente indica que la solución ha llegado al pulmón.Ahora cierre asépticamente la herida con seis suturas estériles sin monofilamento y administre la analgesia postoperatoria. Luego, deseche las jeringas y agujas en el recipiente apropiado para objetos punzocortantes de riesgo biológico después de que se haya inyectado a cada animal. ¿Cómo se comportan los Myers solos en jaulas limpias en un ambiente cálido?Revisar a los animales cada 30 minutos hasta que recuperen la conciencia y comiencen a moverse. Trate el instrumental quirúrgico con desinfectante de dióxido de cloro durante 15 minutos. A continuación, enjuague y devuelva las herramientas al laboratorio para su posterior esterilización según sea necesario.Aloje a los ratones en las instalaciones de dos animales de BSL durante todo el experimento y luego, después de la exanguinación bajo anestesia, recoja el tejido pulmonar de cada animal bajo una capucha de dos BSL. Finalmente, si se desea un procesamiento adicional, transfiera las muestras en tubos sellados colocados en una rejilla sobre toallas de papel cargadas de desinfectante en una caja con tapa a presión a la instalación de procesamiento adecuada. En este experimento representativo, a las 24 a 72 horas después de la inyección de electrógeno P, se puede observar un aumento de la celularidad en las secciones pulmonares.A las 96 horas, el pulmón ha comenzado a recuperarse y a los siete días, la morfología normal de los alvéolos se ha restablecido en gran medida. La tinción en túnel de secciones pulmonares preparada 24 horas después de la instalación del electrógeno P muestra muerte celular dentro de las células alvéolas para estudiar el proceso de reparación. En esta lesión, el modelo BRDU se puede inyectar en los ratones tres días después de la administración de p aerogen.Como se ilustra, los animales tratados con p aerogen exhiben hiperproliferación en el tejido pulmonar en comparación con los animales tratados con control. Para estudiar los cambios en la barrera, la permeabilidad y la inflamación después de una lesión, se puede recolectar lavado broncoalveolar o líquido intestinal en diferentes puntos temporales. Después de la inyección aerogénica, por ejemplo, la concentración de proteínas dentro del intestino aumenta significativamente a las 48 horas después de la instalación bacteriana, lo que indica fugas de la barrera epitelial en el número de células.El intestino también aumenta significativamente en este momento, lo que sugiere una respuesta inflamatoria a los cuatro o cinco días después de la inyección de P aerogen, tanto el nivel de proteínas intestinales como el número de células comienzan a disminuir, lo que sugiere recuperación. Además, el nivel de la proteína inflamatoria dos de los macrófagos, una citoquina implicada en la atracción de los neutrófilos, aumenta significativamente a las 48 horas y luego vuelve a los niveles basales a las 96 horas. En los lisados pulmonares sin p aerogen, solo se observa un pequeño número de monocitos en el líquido intestinal.Por el contrario, hay un gran número de neutrófilos presentes en el intestino, aislados a las 48 horas después de la inyección. A las 96 horas, la composición celular del intestino vuelve a los niveles de control después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el histológico, el seccionamiento o la recolección de lavado broncoalveolar, para responder preguntas adicionales, como ¿qué células o factores están involucrados en la inflamación y la reparación después de una lesión pulmonar aguda?

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se describe el método de agar-perlas para establecer la infección de las vías respiratorias persistente a largo plazo crónica de Pseudomonas aeruginosa en el modelo de ratón.

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

Se describe un método para inducir la inflamación pulmonar neutrofílica por desafío para el lipopolisacárido de aerosol por nebulización, para modelar la lesión pulmonar aguda. Además, también se describen técnicas quirúrgicas básicas para la separación de pulmón, la intubación traqueal y lavado broncoalveolar.

Un método para generar pulmonar Neutrofilia Usando aerosol lipopolisacárido

Mientras que el estudio in vitro de las interacciones huésped-patógeno permite la caracterización de respuestas inmunes específicas, se requieren modelos in vivo para observar los efectos de respuestas complejas. Utilizando la exposición a Candida albicans seguida de una infección pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, establecimos un modelo murino de interacciones microbianas implicadas en la patogenicidad de la neumonía asociada a la ventilación.

El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Varios métodos han sido descritos en la literatura para el modelado de la neumonía bacteriana en ratones. En este documento, se describe un método no invasivo, de bajo costo, rápida para inducir neumonía a través de aspiración (es decir, inhalación) de un inóculo bacteriano pipeteó en la orofaringe. métodos aguas abajo para la evaluación de la respuesta inmune innata pulmonar también se detallan.

Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Se describe un método para establecer infecciones pulmonares en roedores inmunocompetentes. Con habilidad, este método se puede realizar rápida y fácilmente para inducir una infección estable con muchos aislados de S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae y A. baumannii.

Un modelo de neumonía en inmunocompetentes robusta roedores para evaluar Eficacia antibacteriana contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; A. baumannii</em

Se describen métodos sencillos para la demostración de la producción de amiloides citotóxicos después de la infección del endotelio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa.

Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para inducir una lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacáridos intratraqueales y para realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar y tejido pulmonar. La mínima invasividad, el manejo simple, la buena reproducibilidad y la valoración de la gravedad de la enfermedad son ventajas de este enfoque.

Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal

Describimos un protocolo de inoculación retardada para generar infecciones crónicas por heridas en ratones inmunocompetentes.

Un modelo de inoculación tardía de la infección crónica por la herida de Pseudomonas aeruginosa

Este manuscrito describe el establecimiento de un modelo infeccioso de neumonía en ratones y la respectiva caracterización de la resolución de lesiones junto con métodos para el crecimiento de bacterias y la instilación intratraqueal. También se describe un enfoque novedoso que utiliza citometría de flujo de alta dimensión para evaluar el panorama inmunitario.

Modelo experimental para evaluar la resolución de la neumonía

En la actualidad hay una falta de modelos in vivo susceptibles de cribado de fármacos contra infecciones bacterianas crónicas. En este trabajo se describe un protocolo para la infección de heridas por un aislado clínico de Pseudomonas aeruginosa para generar una infección persistente en larvas de pez cebra.

Modelado de la infección persistente por Pseudomonas aeruginosa en larvas de pez cebra heridas

En este estudio, se ha demostrado que una técnica no invasiva de instillación endotraqueal desarrolla AL en ratas utilizando un laringoscopio básico para asegurar una entrega precisa de LPS a los pulmones. El LPS se administra mediante un tubo endotraqueal mediante un laringoscopio. La magnitud de la lesión pulmonar se evalúa en varios momentos.

Administración endotraqueal no invasiva de lipopolisacáridos para inducir daño pulmonar agudo en roedores

Aprende a desarrollar un modelo de lesión pulmonar inducida por Pseudomonas aeruginosa en ratones mediante inyección intratraqueal. Este método permite estudiar la inflamación, muerte celular y reparación alveolar en lesión pulmonar aguda.

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

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