El uso de MALDI-TOF espectrometría de masas y una base de datos personalizada para caracterizar bacterias indígenas a una cueva entorno único (Kartchner Cavernas, AZ, EE.UU.)

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar, aplicar y demostrar un procedimiento detallado para la identificación bacteriana basada en bibliotecas utilizando MALDI para espectrometría de masas. Esto se logra adquiriendo primero espectros de masas de bacterias utilizando un espectrómetro de masas Maloff. En este estudio se recogen espectros de masas de 15 bacterias aisladas de un ambiente cáustico, la forma de los picos resultantes, patrones característicos o huellas dactilares de las bacterias analizadas.

A continuación, estos espectros de masas se importan al software y se construye una base de datos de modelos. A continuación, los espectros de masas de referencia en la base de datos del modelo se procesan y analizan mediante análisis de conglomerados, coincidencia de picos y análisis estadístico. Por último, se recogen de nuevo los espectros de masas de las bacterias codificadas a ciegas, que se seleccionan aleatoriamente de estas 15 bacterias, y se comparan con los espectros de referencia en la base de datos del modelo para la identificación, los resultados muestran que las bacterias pueden identificarse correctamente en función de los coeficientes de similitud o de los posibles biomarcadores y clases de picos.

Comience este procedimiento con la deposición de un microlitro de extracto de proteína que no contenga células viables en una placa objetivo de maldi de acero inoxidable y deje que se seque. A continuación, superponga el extracto de proteína seca con un microlitro de solución de matriz y deje que se seque. A continuación, deposite un microlitro de patrón CBR en la placa objetivo después de que se seque, superponga el CBR con un microlitro de solución de matriz y deje que se seque.

Finalmente, deposite dos microlitros de solución de matriz en la placa objetivo como control negativo. Utilice el espectrómetro múltiple a masivo equipado con el láser de nitrógeno y operado con el software de control Bruker flex. Recoja cada espectro de masa en modo lineal positivo mediante la acumulación de 500 disparos láser en incrementos de 100 disparos.

Ajuste la fuente de iones un voltaje a 20, los kilovoltios la fuente de iones, dos voltajes a 18,15 kilovoltios y el voltaje de la lente a 9,05 kilovoltios. Estos parámetros son específicos del instrumento y pueden requerir optimización. Ajuste el rango de masa a carga para la evaluación automatizada del espectro de dos a 20 kilodaltons por carga.

A continuación, establezca el umbral de resolución mínima en 100. Seleccione el algoritmo de detección de picos de OID. Establezca el umbral de relación señal/ruido en dos y el umbral de intensidad mínima en 100.

Por último, establezca la acumulación máxima en 500 para el diseño de la base de datos. Cree una nueva base de datos en bionuméricos 7.1 utilizando el asistente para nueva base de datos. A continuación, cree un tipo de experimento de espectro, como maldi, mediante los comandos del panel Tipos de experimento.

A continuación, cree los niveles usando el panel de diseño de la base de datos, navegue hasta el menú de la base de datos y agregue nuevos niveles usando el comando de nivel agregar nuevo nivel aquí. Crear a nivel de especie, a nivel de réplica biológica y a nivel técnico. Para importar los espectros de masas sin procesar.

En primer lugar, exporte los espectros de masas sin procesar como archivos de texto mediante el análisis flexible navegando por el menú de archivos y haciendo clic en el comando exportar espectro de masas. A continuación, importe los espectros de masas sin procesar a la base de datos en el nivel de las réplicas técnicas. Procese previamente los espectros de masas en bruto importando y remuestreando mediante un algoritmo de ajuste cuadrático.

A continuación, realice una resta de línea base utilizando un disco rodante con un tamaño de 50 puntos, calcule el ruido utilizando la transformación de ondículas continuas o CWT. Suavize los espectros utilizando una ventana de Kaiser con un tamaño de ventana de 20 puntos y una beta de 10 puntos. A continuación, realice una segunda resta de línea de base utilizando un disco rodante con un tamaño de 200 puntos.

Por último, se detectan los picos utilizando el CWT con una relación señal/ruido mínima de 10 después del preprocesamiento de patrones característicos seguros de cada espectro de masas, como las listas de picos, que contienen tamaños de pico, intensidades de pico y relación señal/ruido. A continuación, cree espectros de masas compuestos a partir de espectros preprocesados utilizando el comando resumido en el menú de análisis. Elija la replicación biológica como nivel objetivo. Aquí.

Combine espectros de masas de 10 réplicas técnicas de la misma colonia para producir un espectro de masas compuesto para esa colonia, lo que da como resultado tres espectros de masas compuestos para ese aislado a nivel de replicación biológica. Por último, resuma los tres espectros compuestos para crear un espectro compuesto para ese aislado a nivel de especie. Para realizar el análisis de clústeres basado en similitudes y el escalado multidimensional, cree grupos con colores.

Primero, seleccione los tres espectros de masas compuestos biológicos y haga clic en el comando crear nuevo grupo a partir de selección en el menú del grupo para crear un grupo para el aislado correspondiente. A continuación, diseñe un color que se utilice automáticamente para estos tres espectros de masas. Realice el análisis de clústeres navegando por el menú de agrupación en clústeres y haciendo clic en el comando calcular análisis de clústeres.

En la configuración de comparación, página uno, seleccione la correlación de Pearson y deje otros parámetros como predeterminados. En la página dos, seleccione el método de grupo de pares no ponderados con media aritmética. A continuación, haga clic en finalizar.

Obtenga un gráfico de escala multidimensional utilizando el comando de escala multidimensional en el menú de estadísticas para realizar la coincidencia de picos. Haga clic en el tipo de espectro maldi en el panel de experimentos. A continuación, seleccione el diseño.

Mostrar imagen, se muestran picos individuales de espectros. A continuación, realice la coincidencia de picos utilizando el comando do coincidencia de picos en el menú de espectros para identificar las clases de picos, realice la agrupación bidireccional haciendo clic en la matriz de estadísticas. Minería. La intensidad de los picos coincidentes con las clases de picos se representa como un mapa de calor para identificar las bacterias utilizando el método basado en el coeficiente de similitud, crear una comparación y generar un rogram basado en espectros de masas en el nivel de replicación técnica como se realiza para el análisis de conglomerados, guarde el rogram para la comparación de similitud.

Seleccione un espectro de masas desconocido y haga clic en el análisis. Identifique las entradas seleccionadas. Aparece el cuadro de diálogo de identificación.

Seleccione el tipo de clasificador basado en comparación y haga clic en Siguiente. En la página siguiente, elija el gramo guardado como comparación de referencia y, a continuación, haga clic en Siguiente. Elija la similitud básica como método de identificación y, nuevamente, haga clic en siguiente, elija la similitud máxima como método de puntuación.

Escriba los valores de umbral adecuados y los valores de diferencia mínima para cada parámetro y, a continuación, haga clic en Siguiente. Una vez completados los cálculos, aparece la ventana de identificación en el panel de resultados. Se enumeran los miembros de la base de datos que mejor coinciden con lo desconocido.

Un rogram basado en el análisis de agrupamiento muestra una similitud entre cada aislado de la base de datos. El conjunto de datos contiene espectros de 15 especies diferentes con tres espectros compuestos para cada especie. El análisis de conglomerados bidireccional puede ayudar a los investigadores a identificar posibles biomarcadores para una especie o cepas dentro de una especie.

Aquí, la intensidad máxima está representada por colores, el verde significa baja intensidad y el rojo significa alta intensidad. Finalmente, sobre la base de estos análisis, se puede comparar el espectro de masas de una incógnita con el gramo y se logra una identificación basada en el coeficiente de similitud.