Estimulación Optogenética del nervio auditivo

El objetivo general de este procedimiento es estimular ópticamente el nervio auditivo de animales con neuronas ganglionares espirales modificadas optogenéticamente. Esto se logra preparando primero un estimulador micro LED azul o una fibra óptica acoplada a un láser azul. El siguiente paso del procedimiento es evaluar la cóclea mediante un abordaje microquirúrgico retroauricular.

El tercer paso es colocar el estimulador óptico para registrar las respuestas evocadas ópticamente del tronco encefálico. El paso final es acceder al colo inferior para registrar la actividad evocada ópticamente. En última instancia, los resultados pueden mostrar una estimulación exitosa del sistema auditivo a través de registros de las respuestas auditivas del tronco encefálico y los potenciales de campo local.

En el colículo inferior Estimulación optogenética del nervio auditivo. Como alternativa a los implantes eléctricos, los implantes cocleares prometen una mejor resolución de frecuencia e intensidad. Esto es de gran interés para la investigación de auditores, pero las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una mejor restauración de la audición en los sordos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación auditiva, como el papel de la actividad del patrón para el refinamiento del desarrollo ortopédico, el requisito de integración espectral en la localización celular y el grado de interacción entre las proyecciones de fotogramas específicos de frecuencia. En el sistema auditivo central, la demostración visual del procedimiento es fundamental, ya que el posicionamiento y la orientación adecuados del micro LED o la fibra óptica son difíciles de aprender. El estimulador micro LED utiliza un LED azul con una superficie activa de 200 micras cuadradas que suelda primero los cables al micro LED.

A continuación, utilizando un epoxi encapsula el LED y su conexión, déjalo secar durante la noche. Una vez curados, alimente los alambres a través de un diámetro exterior de un milímetro. Pedir prestado capilar de vidrio de silicato.

El vidrio proporciona estabilidad mecánica y aislamiento eléctrico. Selle la unión del capilar y el LED recubierto de epoxi con más epoxi, coloque el capilar para que pueda montarse en un manipulador. Ahora verifique las conexiones eléctricas.

Primero, prepare tres cables de cobre. Sumerja un extremo de cada uno en un baño de cloruro de sodio al 0,9%. A continuación, conecte sus otros extremos a un amplificador A BR.

Monitoree la señal con un osciloscopio. A continuación, conecte el micro LED al estimulador hecho a medida para la prueba. Sumerja el estimulador micro LED conectado en el baño y encienda el LED durante al menos 20 minutos.

Mientras estimula el LED, monitoree el osciloscopio en busca de artefactos. Deseche los LED defectuosos. Anestesia a un ratón de cuatro a 10 semanas de edad.

Este ratón expresa el canal opsina dos debajo del muslo 1.2 promotor 10 minutos. Después de inyectar los anestésicos, verifique el reflejo de retirada de los animales para confirmar un plano quirúrgico de anestesia. A continuación, aplique un ungüento en los ojos y comience la cirugía.

Primero, afeita con cuidado el área auricular retro para acercarte a la bullá, la cavidad del oído medio llena de aire. Coloque el mouse en una almohadilla térmica en el lado quirúrgico con micropinzas. Diseccione cuidadosamente los músculos del cuello, es decir, el platisma, el esternocleidomastoideo y los escalenos.

Ahora expone la bulla. Es una estructura ósea esférica con un anillo en la superficie donde se encuentra la membrana timpánica. Con una aguja de insulina, haga un agujero justo debajo del anillo desde el orificio.

Retira el hueso que cubre la bulla. Utilice Rons finos y micropinzas exponiendo el auditorio profesional de la cóclea en el proceso. A continuación, inicie la cóclea. Ostomía.

Primero afeita la cápsula ósea sin alterar el laberinto membranoso. Ahora abra una pequeña ventana de 500 a 800 micras en el segundo giro coclear, lejos de la arteria estabulada y de la abertura del ápice. El ápice podría romper la cóclea y fracturar el modis.

Prepárese para medir las respuestas optogenéticas auditivas del tronco encefálico (OABR, por sus siglas en inglés). Primero, inserte los electrodos de aguja en las siguientes ubicaciones debajo del pabellón auricular, en el vértice y en la parte posterior cerca de las piernas con los electrodos conectados a un amplificador. Amplifica el potencial de diferencia entre las agujas subdérmicas del vértice y la mastoides.

Muestrear a 50 kilohercios y filtrar las respuestas entre uno y 10.000 hercios para la estimulación transcoclear. Monta un micro LED o fibra, junto con el micro LED agarrado por un manipulador mecánico. Colóquelo con cuidado en su lugar.

Visualice el potencial de diferencia en un osciloscopio. Colóquelo cerca de la configuración de grabación para que sea fácil optimizar la posición del estimulador óptico. Utilice el promedio de señal y almacene los datos en una computadora para el análisis sin conexión.

Ahora optimice la posición y la orientación del micro LED utilizando respuestas a pulsos de corriente de tres a 10 milisegundos de uno a cinco hercios. Otra opción es la estimulación láser mediante un láser de onda continua de 473 nanómetros unido a una fibra óptica de 250 micrómetros. Esto requiere un control analógico rápido de la potencia del láser o de un dispositivo óptico.

Con un obturador rápido, coloque la fibra con un micromanipulador directamente sobre la ostomía de la cóclea y fíjela con cemento dental para la estimulación intracoclear. Inserte la fibra a través de la ventana redonda en el s Scala.Tempe. Optimice la posición y la orientación de la fibra provocando respuestas con pulsos de tres a 10 milisegundos de 10 a 30 milivatios de uno a cinco hercios.

La colocación del estimulador es el paso más crítico para el protocolo. El micro ED o la fibra óptica deben reubicarse pacientemente hasta que el OABR sea evidente. Una vez que se producen buenas respuestas optogenéticas y auditivas del tronco encefálico, fije la fibra con pegamento de cianoacrilato o con cemento dental.

Para este protocolo, use un marco estereotáxico y prepare un ratón abriendo el cráneo sobre el colo inferior. Con un microscopio, coloque una sonda de registro sobre el colo inferior e insértela de modo que el canal superior sea visible en la superficie. Ahora, amplifique el potencial de diferencia entre los canales individuales de la matriz de grabación y el tornillo de referencia y el hueso parietal.

Utilice una frecuencia de muestreo de 32 kilohercios, un filtro de paso bajo de 300 hercios y guarde los datos. Una ostomía óptima de la cóclea es fundamental y aumenta la probabilidad de éxito del experimento. Esto significa que la ventana es regular pequeña y no hay lesiones en las estructuras cocleares internas.

Por ejemplo, el sangrado indica daño de la ssis STR utilizando el canal Rodin de dos ratones transgénicos. El canal Rodin dos se expresa en las neuronas espirales del grupo dentro de la cóclea, la iluminación de luz azul, ya sea por micro LED o por láser, provoca grandes A BR optogenéticos, que difieren de los A BR acústicos en amplitud y forma de onda optogenética. Un BR tiene amplitudes mayores que el acústico A BR optogenético.

Por lo tanto, un BR es más comparable a un BR eléctrico. Ambos pueden reclutar más neuronas ganglionares espirales o provocar una activación más sincronizada de las neuronas ganglionares espirales. La propagación de la actividad a través de la vía auditiva se verificó mediante registros extracelulares en el sistema auditivo central. Por ejemplo, la estimulación optogenética de la cóclea provocó actividad neuronal en el mesencéfalo auditivo.

La estabilidad mecánica y los aislamientos eléctricos seguros de los estimuladores micro LED, así como evitar el flujo excesivo de carbono, son factores críticos para el uso exitoso de la optogenética de la cóclea. Al intentar este pro, es importante recordar que debe evitar lesionar la arteria de la distribución en el ébola. Una vez masterizadas, las grabaciones del colículo inferior se pueden hacer en unas tres horas si se realizan correctamente.

Siguiendo este procedimiento a, se pueden realizar métodos como el registro de una sola unidad en el colículo inferior. La estimulación optogenética de la vía auditiva allanará el camino para que las investigaciones en neurociencia auditiva se hagan preguntas que antes no podían abordarse con la estimulación acústica o eléctrica. También esperamos que esta técnica se traduzca en la rehabilitación clínica de la discapacidad auditiva.