Name: Estimulación Optogenética del nervio auditivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprende a estimular ópticamente el nervio auditivo en ratones mediante optogenética para investigación auditiva. Este método permite registrar respuestas del tronco cerebral y potenciales de campo local con alta resolución.

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Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (Bernstein Focus para Neurotechnology conceder 01GQ0810, a T. Moser, y MED-EL Alemania); la Fundación Alemana de Investigación a través del Centro de Nanotecnología Microscopía y Fisiología Molecular del Cerebro (FZT 103, T. Moser) ya través de la SFB889, a N. Strenzke y T. Moser).

Todos los experimentos presentados en este trabajo se llevaron a cabo con los estándares éticos definidos por la ley alemana de protección de los animales de experimentación. La junta de la Universidad de Goettingen para el bienestar animal y la oficina de bienestar animal del estado de Baja Sajonia aprobaron los experimentos. 1 Preparación de μLED-estimulador <ol><li> Para μLEDs, primero preparar el estimulador μLED. Utilizar LEDs azules con 200 por 200 m de superficie activa (μLED, consulte la Tabla de Materiales). </li><li> Cables de soldadura a la μLED. Entonces, encapsular el μLED y las conexiones con pegamento epóxico. Deje el dispositivo durante la noche para permitir que el cura epoxi. </li><li> Para la estabilidad mecánica y el aislamiento eléctrico de los cables de embudo a través de un capilar de vidrio fino, usar 1 mm de diámetro exterior capilares de borosilicato y sellar la unión con epoxi (Figura 1D) de manera que el capilar se puede montar en un manipulador mecánico. NOTA: Taquí es una solución de compromiso de hacer de la cápsula lo suficientemente gruesa como para conseguir un buen aislamiento eléctrico (evitando artefactos de estimulación), pero lo suficientemente delgada como para permitir que el LED se mueven libremente dentro de la bulla y ubicarlo en el cocleostomía. Es una buena práctica para preparar más de un LED. </li><li> Para confirmar un buen aislamiento eléctrico, primero preparar un plato de Petri con 0,9% de NaCl y dip 3 alambres de cobre desnudos finalizados en el líquido. Esto sirve para simular un animal con electrodos ABR. Conecte los cables al amplificador-ABR y de allí a un osciloscopio. </li><li> A continuación, conecte el LED al estimulador y sumergirlo en la solución hasta que esté totalmente cubierto. Conducir el LED con pulsos (consulte el paso 3.1.1) a la corriente máxima permitida por más de 20 minutos y compruebe si hay artefactos de estimulación. Si aparecen, deseche el LED y probar uno nuevo. </li></ol> 2. Procedimiento Quirúrgico <ol><li> Utilice 4-10 ratones transgénicos semanas de edad, que expresan ChR2 bajo el promotor Thy1.2 (línea 9en Wang et al. 13). Para manipular el animal y realizar la cirugía, siempre use las herramientas quirúrgicas limpias y bien identificados. </li><li> Anestesiar a los animales con una inyección ip de una mezcla de uretano (1,32 mg / kg), xilazina (5 mg / kg), y la buprenorfina 0,1 mg / g diluido en solución de NaCl al 0,9% estéril y colocar el ratón sobre una placa de calentamiento para mantener el cuerpo la temperatura a 37 ° C. Con esta dosis, la anestesia normalmente dura para toda el protocolo experimental. <ol><li> A partir de 10 minutos después de la hora inicial de inducción de la anestesia para detectar signos de la excitación por el reflejo de retirada de la pata. En caso de movimientos, aplicar dosis de mantenimiento de uretano (0,66 mg / kg) y buprenorfina (0,05 mg / g) diluido en 0,9% de solución NaCl estéril (sin xilazina). Vean de nuevo el reflejo de retirada de la pata y proceder sólo si el reflejo está ausente. </li></ol></li><li> Afeitarse cuidadosamente el área retroauricular en la preparación de la incisión. Use un retroauricularabordar para llegar a la bulla (cavidad del oído medio que contiene aire). <ol><li> Con un micro fórceps diseccionar cuidadosamente y / o eliminar parte de los músculos del cuello, por ejemplo, cutáneo del cuello, esternocleidomastoideo y escalenos. </li><li> Encuentra y exponer la bulla (Figura 1A). Identificar la bulla como una estructura ósea con una forma esférica característica con un anillo en la superficie bulla que indica la inserción de la membrana timpánica (Figura 1A). Hacer un agujero con la punta de una aguja de insulina justo debajo de este anillo. Empezar por ahí, retirar el hueso que cubre la ampolla con una fina Pinzas (gnawer) o microforceps de tal manera que el Promontorium de la cóclea está expuesto (Figura 1B). </li></ol></li><li> Para el cocleostomía, afeitarse suavemente la cápsula ósea para abrir una pequeña ventana (cocleostomía: ~ 500-800 micras), teniendo cuidado de dejar intacto el laberinto membranoso (Figura 1B). Realice el cocleostomía en el segundo coclearvuelta ya que es lo suficientemente lejos de la arteria estapedial y desde el vértice. La apertura de los ápice podría producir la rotura de la cóclea incluyendo una fractura de la modiolo. </li><li> Para una inserción ventana redonda de una fibra óptica o μLED-implante a escala timpánica, agrandar cuidadosamente el nicho de la ventana redonda por rascarse el nicho óseo con la punta de un bisturí afilado (un número cuchilla 11 es una buena opción). Utilice siempre una nueva cuchilla o bisturí. Tenga mucho cuidado ya que la arteria estapedial corre muy cerca de la ventana redonda (Figura 1B). </li></ol> 3. óptico Estimulación aplicando dos criterios <ol><li> Para la estimulación transcoclear, uso μLEDs o un láser de fibra acoplada. <ol><li> Montar el capilar que lleva el μLED en un manipulador mecánico y cuidadosamente coloque el μLED sobre la cocleostomía. Uso oABR, provocada por la estimulación a largo 3-10 mseg a partir de una fuente de corriente (típicamente 5-40 mA a 2,7 V) a 1-5 Hz, como un medio para optimizar la posición y oientation del μLED. </li><li> Para la estimulación láser, utilizar una nm láser de onda continua 473 y una fibra óptica de 250 micras (ver Materiales). Pareja de la fibra óptica a una fuente de láser azul que, idealmente, ofrece un control analógico rápido de potencia (bien utilizar un dispositivo acústico-óptico o una obturación rápida para definir el estímulo óptico). El uso de un micromanipulador, localizar la punta de la fibra directamente sobre la cocleostomía y fijarlo allí con cemento dental (estimulación transcoclear). </li></ol></li><li> Para la estimulación intracoclear, inserte la fibra a través de la ventana redonda en la rampa timpánica. A continuación, utilice 3-10 pulsos láser ms de 10 a 30 mW (potencia de salida de la fibra) a 1-5 Hz para obtener oABR. La gran amplitud de oABR permite al experimentador observar oABR evocada por estímulos individuales en el osciloscopio para optimizar la posición y orientación del emisor (μLED o fibra) utilizando oABR amplitud como una lectura de salida. </li><li> Una vez bien oABR haberse logrado, fijar la fibra con cyanoacrpegamento ylate o cemento dental y esperar hasta que el pegamento es sólido. NOTA: Es normal observar un poco de líquido que sale de la cóclea. Sin embargo, para evitar problemas con la polimerización del cemento, es aconsejable secar la región utilizando mechas de algodón finas. </li></ol> 4. Grabaciones de oABR <ol><li> Insertar electrodos de aguja debajo de la oreja, en el vértice y en la parte posterior cerca de las piernas y conectarlos al amplificador. </li><li> Amplificar la diferencia de potencial entre el vértice y mastoides agujas subdérmicos. Muestra a una velocidad de 50 kHz y el filtro (1-10.000 Hz). Visualizar la diferencia de potencial en un osciloscopio idealmente cerca de la configuración de la grabación para la optimización de la posición del estimulador óptico. Utilice promedio de la señal (50-1,000x) y almacenar los datos en un ordenador para análisis fuera de línea. </li></ol> 5. Grabaciones de Potenciales Evocados ópticamente Campo Local <ol><li> Colocar el animal en un marco estereotáxico. Con unas pinzas cientorally de tirar de la piel que cubre el cráneo y realizar una incisión media con unas tijeras que se extiende aproximadamente desde entre los ojos hasta el punto que los músculos del cuello se unen al cráneo. <ol><li> Reflejar la piel lateralmente. Cortar el periostio longitudinalmente a lo largo de la sutura sagital y retírela hacia los lados frotando suavemente el hueso craneal expuesta con un hisopo de algodón. </li></ol></li><li> Coloque una placa de metal por encargo en el cráneo expuesto dejando aproximadamente 1 mm de espacio entre el extremo caudal de la placa y lambda. Con un diámetro de 0,7 mm perforar cuidadosamente perforar un agujero en el hueso parietal. </li><li> Tornillo suavemente en un tornillo de diámetro de 0,85 mm - para servir como referencia para potenciales registrados desde el colículo inferior (IC) - que sostiene el tornillo con fórceps, siempre y cuando el tornillo no esté bien sujeta. Asegurar un buen contacto entre el tornillo y la duramadre sin penetrar el cerebro. Pegar el tornillo y la placa de metal en el cráneo con pegamento de cianoacrilato. </li><li> Afloje el nEck músculos suavemente desde el cráneo. Tire de los músculos del cuello en sentido caudal para alrededor de 1-2 mm. Identificar la intersección del seno sagital superior, (SSS) y el seno transversal (TS). Si es necesario, aumentar la transparencia del cráneo humedeciendo el hueso con solución fisiológica de NaCl. <ol><li> Identificar la IC en ratones como mentir directamente caudal a la intersección SSS y TS. Después de la identificación de la ubicación de la IC lenta y cuidadosamente realizar una ca. extiende trepanación 0,5 mm a 1,5 mm rostral caudal a la TS y aproximadamente 3 mm lateralmente. </li><li> Evite cualquier daño a la SSS y TS ya que impediría un experimento exitoso. Aquí, probar si el hueso trepanned ha aflojado por suavemente empujándolo. Utilizando unas pinzas lentamente quitan el hueso. </li></ol></li><li> Con un adaptador adecuado adjuntar una matriz multicanal y cabezal de la platina en un micromanipulador. Para evitar la destrucción de la matriz de grabación multicanal durante la inserción en la IC, retire con cuidado la duramadrecon una punta doblada de una pequeña aguja hipodérmica de partida cerca de un borde de hueso. <ol><li> Quite el animal del marco estereotáxico. Fije la placa de metal sobre una barra de permanecer fijación estereotáxica. Coloque la sonda de grabación sobre el IC y la inserta bajo control microscópico de tal manera que el canal superior más es apenas visible en la superficie. </li></ol></li><li> Amplificar la diferencia de potencial entre los canales individuales de la matriz de grabación y el tornillo de referencia en el hueso parietal, muestra a una velocidad de 32 kHz, filtro de paso bajo (300 Hz) y almacenar en un ordenador para análisis fuera de línea. </li><li> Todos los animales deberán ser sacrificados humanitariamente al final del procedimiento antes de la recuperación anestésica de acuerdo con las directrices pertinentes de la eutanasia. Los métodos apropiados de eutanasia pueden incluir dislocación cervical o inhalación de CO2. </li></ol>

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<li>Arenkiel, B. R., Peca, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Transgenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).</li>
<li>Tomita, H., Sugano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Properties+of+Transgenic+Rats+Harboring+the+Channelrhodopsin-2+Gene+Regulated+by+the+Thy-1.2+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22+PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter.</a> PLoS ONE. 4 (11), e7679(2009).</li>
<li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li>
<li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).</li>
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<li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li>
<li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los experimentos descritos demuestran la estimulación optogenética de las NEG, y pueden, en principio, también pueden utilizarse para estimular las células ciliadas internas y / o externas, siempre que la expresión de opsinas. Estos experimentos requieren mucha paciencia y cuidado. Como se ha mencionado antes, los pasos más críticos son una buena cocleostomía inserción / ventana redonda, así como una posición adecuada y la orientación de la fuente de luz. Existen limitaciones con estimulació...

Según la Organización Mundial de la Salud, 360 millones de personas en todo el mundo sufren de pérdida de la audición. En los sujetos sordos, la estimulación eléctrica directa de NEG por IC, permite la comprensión del habla abierta en la mayoría de ellos 1,2,4,5. A pesar de que las entidades de crédito han sido implantadas en más de 200.000 personas, siendo así la neuroprótesis más exitoso, codificación de sonido conducido por los actuales implantes cocleares es limitado. IC se basan en la estimulación eléctrica por un cierto número de electrodos donde cada uno se activa una región tonotópico del nervio auditivo evitando así el órgano sensorial disfuncional de Corti en la cóclea. Oyentes con audición normal pueden discriminar más de 2000 frecuencias, sin embargo los IC de hoy utilizan sólo hasta 12-22 canales de frecuencia 4. Esto es debido al flujo de corriente generalizada de cada electrodo de estimulación 7,9, la activación de un gran número de NEG que representan muchas diferentes frecuencias de sonido 8,15. Estelimitación se puede mejorar utilizando la estimulación multipolar pero a costa de un mayor consumo de potencia 16,17. Su salida de rango dinámico para la intensidad del sonido también es limitado, por lo general por debajo de 6-20 dB 4,18. Por estas razones, la mejora de la frecuencia y la intensidad de la resolución son objetivos importantes para aumentar el rendimiento del IC para mejorar el reconocimiento de voz en entornos ruidosos, comprensión de la prosodia y la percepción musical. Una opción diferente para estimular el nervio auditivo es la estimulación óptica. La luz puede ser convenientemente centrado para apuntar a una pequeña población SGN, prometiendo mejor confinamiento espacial, el aumento de resolución de frecuencia y también ampliar el rango dinámico, lo que resulta en una mejor resolución intensidad. De hecho, la estimulación coclear con luz infrarroja ha demostrado una excelente resolución de frecuencia en modelos animales 10,11,19. Una desventaja de este tipo de estimulación es que requiere energías más altas que la estimulación eléctrica <sup&gt; 10,11. Por otra parte, las preocupaciones sobre la capacidad del método para estimular directamente las neuronas auditivas se han planteado 12,20. Como alternativa a la estimulación infrarroja, empleamos la optogenética para hacer NEG sensible a la luz. Optogenética es un nuevo enfoque que combina técnicas genéticas y ópticas de manera no invasiva y controlar específicamente las células con alta precisión temporal (opiniones del 21 al 23). La modalidad actualmente más frecuentemente utilizado emplea la expresión del gen microbiana canalrodopsina 2 (ChR2) de Chlamydomonas reinhardtii y variantes de la misma, que codifica un canal de cationes de luz cerrada 24. ChR2 es una proteína transmembrana-7-hélice que, cuando se transduce en neuronas y activado por la luz azul, actúa como canal de cationes no selectivo, por lo tanto las células despolarizante de 24 27. ChR2 ha sido bien caracterizado 24,28- 31 y muchas variantes se han desarrollado para modificar action del espectro, de compuerta y permeabilidad propiedades 32,33. El objetivo de nuestro trabajo es establecer la optogenética coclear para la activación de la vía auditiva. Tomamos nota de que el enfoque optogenética para estimular el nervio auditivo requiere manipulación genética del ganglio espiral para la expresión de canalrodopsina. Trabajando con ratones y ratas permite el uso de animales transgénicos disponibles 13,34,35, que proporcionan la expresión de canalrodopsina con poca variabilidad a lo largo del eje tonotópico y animales a través de 36. Combinando alelos condicionales 37 con Cre-líneas apropiadas proporciona la expresión específica de la célula. La transferencia de genes en el ganglio espiral de otros animales requiere el uso de virus tales como el virus adeno-asociado que es un enfoque estándar en optogenética 38 y que hemos demostrado que funciona bien en ratones 36. La manipulación y la expresión de transgenes que codifican proteínas exóticas oso riesgos de efectos adversos tales como IMMU genéticarespuestas y / o proliferación ne, estado comprometido o incluso la muerte de las células manipuladas genéticamente. Para el propósito de esta demostración usamos ratones transgénicos que expresan ChR2 en las neuronas del ganglio espiral bajo el promotor Thy-1 13 para estimular ópticamente la vía auditiva. Observamos que otras variantes canalrodopsina se pueden utilizar para el mismo propósito que hemos demostrado utilizando la transferencia mediada por virus de la variante de captura 14 en NEG 39. Mientras que la optogenética coclear requiere la manipulación genética, ofrece tuning molecular para optimizar la estimulación SGN y promesas mejoró la frecuencia y la intensidad de la resolución en comparación con la estimulación eléctrica. Estimulación optogenética de la vía auditiva es muy relevante para la investigación de la audición. Por ejemplo, promete avances en los estudios de la refinamiento dependiente de la actividad de tonotopia durante el desarrollo, en el análisis de los requisitos de integración espectral en localizat sonidode iones y de la extensión de la interacción entre las proyecciones aferentes frecuencia específica en el sistema auditivo central.

<table><tbody><tr><td>Uretano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U2500-100G</td><td>Anestésico</td></tr><tr><td>Xilacina HCl</td><td>RXV</td><td></td><td>Sedante y analgésico</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td>Analgésico</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Se utiliza para sujetar tejidos duros, por ejemplo, huesos o materiales. Nunca los use para sujetar pañuelos suaves y delicados&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Solo para ser utilizado para sujetar tejidos blandos</td></tr><tr><td>Tijeras finas - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>Para abrir la piel y ayudar con la disección muscular</td></tr><tr><td>Lempert Rongeurs&nbsp;</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>16004-16</td><td>Son muy útiles para eliminar fácilmente el hueso de la bulla láser de</td></tr><tr><td>473 nm&nbsp;</td><td>Changchun New Industries</td><td>MLL-III473</td><td>100 mW estado sólido 473 nm</td></tr><tr><td>láser Controlador láser&nbsp;</td><td>Changchun New Industries</td><td>DPSSL MLL 100 mW</td><td>TTL operado por láser</td></tr><tr><td>driver 250 y micro; m fibra óptica</td><td>Cualquier comercial; por ejemplo, Thorlabs</td><td>M42L05</td><td></td></tr><tr><td>Modulador acústico-óptico</td><td>Crystal Technology, Inc.</td><td>PCAOM VIS</td><td>Controla la cantidad de luz acoplada a la fibra desde el</td></tr><tr><td>láser Controlador para modulador acústico-óptico</td><td>Crystal Technology, Inc.</td><td>160T1-8SAR-24-0.8</td><td>Controle el modulador acústico-óptico</td></tr><tr><td>Solo2 medidor de potencia y energía láser</td><td>Gentec-EO</td><td></td><td>Se utiliza para medir la intensidad de la luz del LED y el láser acoplado a la fibra</td></tr><tr><td>Azul y micro; LED</td><td>Cree</td><td>C470UT200</td><td>Es necesario construir varios &mu; Dispositivos LED porque se dañan fácilmente o el aislamiento no es lo suficientemente bueno</td></tr><tr><td>Sistema TDT&nbsp;</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td>RZ6-A-P1</td><td>Se puede utilizar cualquier sistema para la generación de estímulos&nbsp; presentación y adquisición</td></tr><tr><td>de datos Sonda de silicio de 16 canales de un solo vástago</td><td>Neuronexus</td><td>a1x16-5mm-100-177-CM16LP&nbsp;</td><td>Estos son dispositivos frágiles, deben manipularse con cuidado y limpiarse después de su uso</td></tr><tr><td>Omnidrill</td><td>World Precision Instruments</td><td>503598</td><td>Realizar craneotomías para grabaciones de circuitos integrados e implantación de tornillos de referencia</td></tr><tr><td>Micro Drill Steel Burrs</td><td>cualquier comercial; p. ej. Fine Science Tools</td><td>19007-07</td><td></td></tr><tr><td>Tornillo óseo autorroscante</td><td>cualquier comercial; p. ej. Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td>Micromanipulador</td></tr> <tr><td></td><td>de tornillo de referenciacualquier comercial; p. ej. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 ejes</td><td></td><td>Posicionamiento de la sonda de registro</td></tr></tbody></table>

estimulación optogenética del nervio auditivo

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

La estimulación eléctrica directa de las neuronas del ganglio espiral (NEG) por implantes cocleares (IC) permite la comprensión del habla abierto en la mayoría de los sujetos sordos implantados 1-6. No obstante, la codificación de sonido con IC actuales tiene mala frecuencia y la resolución de intensidad debido a la amplia difusión actual de cada contacto de electrodo activación de un gran número de NEG lo largo del eje tonotópica de la cóclea 7 9. Estimulación óptico se propone como una alternativa a la estimulación eléctrica que promete más espacialmente confinada activación de NEG y, por tanto, una mayor resolución de frecuencia de la codificación. En los últimos años, la iluminación de infrarrojos directa de la cóclea se ha utilizado para evocar respuestas en el nervio auditivo 10. Sin embargo se requiere de altas energías que la estimulación eléctrica 10,11 y la incertidumbre se mantiene en cuanto al mecanismo subyacente 12. Aquí se describe un método basado en la optogenética para estimular NEGcon la luz azul de baja intensidad, el uso de ratones transgénicos con expresión neuronal de canalrodopsina 2 (ChR2) 13 o la expresión mediada por virus de la ChR2 variante Catch 14. Utilizamos micro-diodos emisores de luz (μLEDs) y láseres de fibra acoplada para estimular NEG ChR2 expresan a través de una pequeña abertura artificial (cocleostomía) o la ventana redonda. Analizamos las respuestas por las grabaciones del cuero cabelludo de los potenciales evocados (luz optogenética de respuesta auditiva del tronco cerebral: oABR) o mediante grabaciones de microelectrodos de la vía auditiva y los comparamos con la estimulación acústica y eléctrica.

Un cocleostomía óptima es crítica y aumenta la probabilidad de un experimento exitoso. Esto significa que la ventana es regular, pequeña, y no hay ninguna lesión de las estructuras internas cocleares. Por ejemplo, sangrado indica daño de la estría vascular. Un buen ejemplo se presenta en la Figura 1B. Utilizando ratones transgénicos ChR2, ChR2 se expresa en las NEG dentro de la cóclea (Figura 1C). Azul de luz de iluminación, ya sea por μLED ...

Los implantes cocleares (IC) permitir la audición por la estimulación eléctrica directa del nervio auditivo. Sin embargo, la mala frecuencia y la intensidad de la resolución limita la calidad de la audición con entidades de crédito. Aquí se describe la estimulación optogenética del nervio auditivo en ratones como estrategia alternativa para la investigación auditiva y el desarrollo de las futuras entidades de crédito.

Estimulación Optogenética del nervio auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

El objetivo general de este procedimiento es estimular ópticamente el nervio auditivo de animales con neuronas ganglionares espirales modificadas optogenéticamente. Esto se logra preparando primero un estimulador micro LED azul o una fibra óptica acoplada a un láser azul. El siguiente paso del procedimiento es evaluar la cóclea mediante un abordaje microquirúrgico retroauricular.El tercer paso es colocar el estimulador óptico para registrar las respuestas evocadas ópticamente del tronco encefálico. El paso final es acceder al colo inferior para registrar la actividad evocada ópticamente. En última instancia, los resultados pueden mostrar una estimulación exitosa del sistema auditivo a través de registros de las respuestas auditivas del tronco encefálico y los potenciales de campo local.En el colículo inferior Estimulación optogenética del nervio auditivo. Como alternativa a los implantes eléctricos, los implantes cocleares prometen una mejor resolución de frecuencia e intensidad. Esto es de gran interés para la investigación de auditores, pero las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una mejor restauración de la audición en los sordos.Este método puede ayudar a responde

optogenetic-stimulation-of-the-auditory-nerve

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La aplicación de un paradigma temor condicionamiento clásico de comportamiento para auditivo protésico investigación en ratas se ha descrito. Este paradigma proporciona un mecanismo para identificar tanto la detección de, y la discriminación entre, acústica diferente y los estímulos eléctricos utilizando la frecuencia cardíaca como medida de resultado.

Determinación del comportamiento de discriminación de estímulos acústicos par de estímulos auditivos y de corriente mediante el condicionamiento clásico y el enfoque del ritmo cardíaco

Fuente: Kozin, E. D., et.al. Visualización directa del núcleo coclear dorsal murino para la estimulación optogenética de la vía auditiva. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra la transferencia de genes mediada por virus al núcleo coclear dorsal (DCN) del ratón para permitir la estimulación auditiva inducida por la luz. Un vector viral que codifica opsina, un canal iónico sensible a la luz, se inyecta en el DCN después de una craneotomía y aspiración cerebelosa para acceso directo. Las opsinas...

Transferencia de genes mediada por virus al núcleo coclear dorsal del ratón para estimulación auditiva inducida por luz

Este video muestra un protocolo para estimular la raíz del nervio auditivo y registrar las corrientes postsinápticas en las neuronas olivocochleares mediales en cortes de cuña de cerebro de ratón.

Estimulación de la raíz nerviosa auditiva y registros de corriente postsináptica en un corte de cuña de cerebro de ratón

Fuente: Badran, B. W., et al. Administración de laboratorio de estimulación transcutánea del nervio vago auricular (taVNS): técnica, orientación y consideraciones. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra la estimulación transcutánea del nervio vago auricular (taVNS), un método no invasivo para modular la actividad cerebral. Los electrodos se colocan en la pared anterior del canal auditivo externo y el trago, dirigidos a la rama auricular del nervio vago (ABVN). Cuando se estimula, el impulso...

Estimulación transcutánea del nervio vago auricular en el oído humano

Fuente: Akil, O., et al., Método quirúrgico para la administración de genes mediados por vía viral al oído interno del ratón a través de la membrana de la ventana redonda. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el procedimiento de administración de un gen terapéutico en el oído interno de un cachorro de ratón con pérdida auditiva inducida genéticamente. Usando un vector viral adenoasociado (AAV), el gen se inyecta a través de la membrana de la ventana redonda, lo que permite que las partículas...

Terapia génica basada en vectores virales para la restauración de la audición en un modelo de ratón

El objetivo de este protocolo es esbozar un enfoque quirúrgico para proporcionar acceso directo al núcleo coclear dorsal en un modelo murino.

La visualización directa de la murino Dorsal coclear Núcleo de optogenética La estimulación de la vía auditiva

El órgano auditivo media la audición. En este trabajo presentamos un método modificado de microelectroporación in ovo optimizado para el estudio de la proliferación y diferenciación de células progenitoras auditivas en el órgano auditivo de pollo en desarrollo.

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Presentamos una técnica de administración localizada de fármacos a través de la ruta trans-timpánica en la cóclea. Administración de fármacos por esta vía no interferiría con la eficacia de la lucha contra el cáncer de los medicamentos quimioterapéuticos como el cisplatino.

Trans-timpánica fármaco para el tratamiento de la ototoxicidad

Modelos animales de implantes cocleares pueden avanzar el conocimiento de los fundamentos tecnológicos de tratamiento de la pérdida permanente de audición neurosensorial con estimulación eléctrica. Este estudio presenta un protocolo quirúrgico de implantación coclear de una matriz de electrodos en ratones, así como la evaluación funcional con respuesta auditiva del médula oblonga y agudo ensordecedor.

Cirugía de implante coclear y eléctricamente evocada médula oblonga auditivo respuesta grabaciones en ratones C57BL/6

La integración de diversas entradas sinápticas a las neuronas se mide mejor en una preparación que preserva todos los núcleos presinápticos para la sincronización natural y la plasticidad del circuito, pero las rebanadas cerebrales suelen cortar muchas conexiones. Desarrollamos una rebanada cerebral modificada para imitar la actividad del circuito in vivo mientras mantenemos la capacidad de experimentación in vitro.

In Vitro Wedge Slice Preparación para imitar la conectividad del circuito neuronal In Vivo

La estimulación electroacústica (EAS) con electrodos más largos puede ofrecer una cobertura coclear más amplia y varios tipos de mapas en casos de pérdida auditiva de alta frecuencia. La combinación de cirugía menos invasiva, electrodos flexibles de pared lateral y administración de esteroides permite una inserción más profunda con poco o ningún trauma quirúrgico, lo que resulta en una buena preservación de la audición.

Cobertura coclear mejorada y preservación de la audición en la pérdida auditiva de alta frecuencia mediante estimulación electroacústica con electrodo más largo

Aprende a estimular ópticamente el nervio auditivo en ratones mediante optogenética para investigación auditiva. Este método permite registrar respuestas del tronco cerebral y potenciales de campo local con alta resolución.

Estimulación Optogenética del nervio auditivo

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