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Advanced Biology

Introducción a la neurobiología del desarrollo

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An Introduction to Developmental Neurobiology

1.12: Neuronal Transfection Methods

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09:24 min

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April 30, 2023

Overview

Neurociencia del desarrollo es un campo que explora cómo está formado el sistema nervioso, desde las etapas embrionarias tempranas hasta la edad adulta. Aunque se sabe que las células progenitoras neurales seguir etapas predecibles de proliferación, diferenciación, migración y maduración, se entienden los mecanismos que controlan la progresión a través de cada etapa. Estudio de desarrollo no sólo es importante para entender cómo se ensamblan las estructuras complejas, pero también para la caracterización y tratamiento de los trastornos del desarrollo. Puesto que son similares a los que se producen en el desarrollo de procesos de reparación del daño, este campo también es una fuente prometedora de comprensión de Cuándo y cómo regeneran los tejidos del sistema nervioso.

Este video ofrece una breve descripción del campo de la neurociencia del desarrollo, incluyendo algunos experimentos claves que han avanzado en la comprensión de los mecanismos que controlan la formación de tejido neural temprana y la mayor especialización de esas células en subconjuntos discretos de neuronas. La discusión se centra en cuestiones importantes que biólogos del desarrollo están pidiendo y luego muestra algunos de los métodos que utilizan para investigar estas cuestiones. Finalmente, se presentan aplicaciones de las técnicas para proporcionar la penetración en lo que significa ser un neurocientífico del desarrollo hoy. La gama de experimentos demostró incluye manipulación genética del cerebro embrionario intacto, diferenciación dirigida de las células madre en células del sistema nervioso y tinciones que permiten la cuantificación de eventos específicos del desarrollo, como la formación de nuevas conexiones entre las neuronas.

Procedure

Neurobiología del desarrollo estudia cómo unas células embrionarias tempranas se pueden transformar en un intrincado organizado del sistema nervioso que controla un organismo entero.

Los científicos en este campo están interesados en cómo las células asumir identidades específicas, migran a regiones definidas y conectan para formar un sistema funcional. Estos procesos son importantes para entender cómo funciona el sistema nervioso así como el diagnóstico y tratamiento de una amplia gama de enfermedades neurológicas en un desarrollo anormal.

Este video le llevará en un breve recorrido por la historia de la neurobiología del desarrollo, preguntas clave en el ámbito del esquema y explorar métodos importantes utilizados para responder a esas preguntas. Por último, tenemos un vistazo a algunas aplicaciones prácticas de la investigación del desarrollo neurológico.

Vamos a empezar con algunos estudios de hito de la historia de la neurobiología del desarrollo.

Temprana neurodesarrollo investigación data del siglo XIX. En la década de 1880, Wilhelm su establecido el estudio de la histogénesis, o el origen embrionario del tejido. Fue una de las primeras personas en ver las neuronas en desarrollo ampliar procesos como axones y dendritas.

En 1924, embriólogos Hans Spemann y Hilde Mangold estudian la función de un grupo de células conocido como el organizador de Spemann. Encontraron que el trasplante del organizador a otro embrión induce la formación de tejido neural secundario.

Luego en la década de 1950, Rita Levi-Montalcini y Stanley Cohen observan que transplantar piezas de tumores en desarrollo de embriones de pollo condujo al crecimiento rápido de la neurona. Especula que el tumor secreta una sustancia que causa este crecimiento y pronto identificado esa proteína como factor de crecimiento nervioso, NGF, que es esencial para la supervivencia de la neurona.

En otro estudio de trasplante, Nicole Le Douarin había reemplazado partes de embriones de pollo con las codornices. Por las células de codorniz a través del desarrollo de seguimiento, mostró que un grupo altamente migratorio de las células, conocido como la cresta neural, da origen a madurar los nervios periféricos.

Unos años más tarde, Pasko Rakic estudió cómo las células del sistema nervioso central se arreglan en estructuras altamente ordenadas durante el desarrollo. Rakic etiquetadas dividir las células en el desarrollo de los fetos con nucleótidos radiactivos, lo que le permite determinar cuándo nacieron las células del cerebro y su destino final en el cerebro maduro.

Durante las últimas décadas del siglo XX, una nueva era de la investigación surgió que se centró en la célula y las señales moleculares de guiar el desarrollo del sistema nervioso.

Por ejemplo, a mediados de los 90, Tom Jessell demostró que ciertos factores de transcripción, o proteínas que ayuda a control la expresión génica, influenciaron en el desarrollo de únicos subtipos de neuronas en la médula de ratón en desarrollo. Tras este trabajo, los investigadores de hoy todavía están identificando nuevos genes que controlan el desarrollo neuronal.

Ahora que has visto pocos reflejos históricos, repasemos algunas preguntas clave en Neurobiología del desarrollo moderno.

Muchos investigadores estudian especificación de patrones y destino de las células del sistema nervioso. Por ejemplo, ellos están interesados en la programación genética que guía tempranas células madre a diferenciarse en neuronas o glia, que son las células de soporte del sistema nervioso. También pueden investigar señales secretadas que influyen en la identidad más especializados dentro de una clase de células o en lugares específicos.

Otro enfoque importante es cómo las neuronas y glia en desarrollo son capaces de organizarse y montar en el sistema nervioso madurito. Algunos investigadores estudian dinámica citoesqueleto de las células que migran desde su origen al sitio en el que funcionan. Otros están interesados en cómo las señales del ambiente extracelular influyen en comportamiento migratorio.

Neurocientíficos del desarrollo también evaluación cómo las conexiones entre las células se forman y refinadas a lo largo del desarrollo. Algunos estudios se centran en la función de los receptores de orientación axón, que son proteínas de superficie celular que detectan señales externas y guía de desarrollo de axones o neuritas, a sus células diana. Otro enfoque es el estudio de las conexiones físicas y químicas en sinaptogénesis, que es la formación de nuevas conexiones de señalización, o sinapsis, entre las células.

Ahora, echemos un vistazo a algunos prominentes métodos utilizados para responder a algunas de estas cuestiones de desarrollo neurológico.

Para estudiar el control genético de la identidad celular y patrones del sistema nervioso, es útil manipular la expresión de genes específicos en el desarrollo de embriones. Un método popular es en el útero la electroporación, en que el ADN exógeno se entrega en el cerebro de los roedores de desarrollo. Al exponer el útero de un ratón anestesiado, embarazado que ADN puede ser inyectado en el cerebro embrionario y actual aplica para forzar el ADN en torno a las células. Según el experimento, electroporated material puede utilizarse para promover la expresión del gen o prevenirlo, permitiendo a los investigadores a examinar el impacto de proteínas individuales en el desarrollo del cerebro.

Tejido explanted del sistema nervioso central comúnmente se utiliza para estudiar la migración de células durante el desarrollo. Esta técnica consiste en disecar pequeños pedazos de cerebro o la médula espinal y los cultivo in vitro. Una gran ventaja de este enfoque es que el tejido es muy accesible para la captura de movimientos de la célula vía proyección de imagen de Time-lapse. Además, los efectos de moléculas específicas en migración pueden estudiarse fácilmente en los explantes mediante aplicación de factores de crecimiento o inhibidores farmacológicos a los medios de cultivo.

Para estudiar las moléculas que son esenciales para la formación de redes neuronales, se puede utilizar la inmunohistoquímica. Esta técnica aprovecha la especificidad de los anticuerpos para marcar la localización de proteínas específicas en células y tejidos. Visualización de la localización de la proteína usando microscopia fluorescente puede ayudar a los investigadores a hacer hipótesis acerca de cómo estas moléculas influyen en la formación y función de estructuras como la sinapsis.

Ahora que estás familiarizado con algunos acercamientos al estudio de Neurociencia del desarrollo vamos a ver aplicaciones de la investigación en los laboratorios de hoy.

Un objetivo importante del estudio del neurodesarrollo es averiguar cómo se determinaron la morfología e identidad de la célula. Para estudiar el control genético del desarrollo neuronal, estos investigadores entregan construcciones knockdown de genes en el sistema nervioso en desarrollo de chick mediante electroporación. Electroporated las neuronas dentro del tubo neural fueron etiquetadas también por inyección de tinte, por lo que podría compararse con morfología de axón entre control y células genéticamente alteradas.

Para estudiar cómo las neuronas establecen conexiones, estos investigadores cultivan las neuronas extraídas de crías de rata joven. Después de varios días en cultivo, células eran fijas y teñidas con anticuerpos específicas de proteínas sinápticas, lo que permite la cuantificación de la formación de sinapsis en varias condiciones experimentales, como la sobreexpresión del gen, o cultura en crecimiento modificado medio.

Usando su conocimiento del programa conducción desarrollo neural, los investigadores de hoy ahora pueden forzar la primeras células embrionarias, como las células madre, por las vías de diferenciación específica en vitro. Estos investigadores trataron células madre humanas con el derivado de la vitamina A, ácido retinoico, que dio lugar a la expresión reducida de factores de transcripción que mantienen la identidad de la célula de vástago y mayor expresión de marcadores neuronales. Esta técnica ofrece a los investigadores una valiosa fuente de neuronas humanas para investigar los mecanismos detrás de enfermedad neurológica.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a la neurociencia del desarrollo. Este video repasa históricos destacados, preguntas claves por neurocientíficos del desarrollo y algunas de las técnicas que utilizan.

¡Gracias por ver!

Transcript

Developmental neurobiology explores how a few early embryonic cells can transform into an intricately organized nervous system that controls an entire organism.

Scientists in this field are interested in how cells take on specific identities, migrate to defined regions, and connect to form a functional system. These processes are important for understanding how the nervous system functions as well as the diagnosis and treatment of a broad range of neurological diseases rooted in abnormal development.

This video will take you on a brief tour of the history of developmental neurobiology, outline key questions in the field, and explore prominent methods used to answer those questions. Finally, we’ll have a look at some practical applications of neurodevelopmental research.

Let’s begin with some landmark studies from the history of developmental neurobiology.

Early neurodevelopmental research dates back to the 19th century. In the 1880s, Wilhelm His established the study of histogenesis, or the embryonic origins of tissue. He was one of the first people to watch developing neurons extend processes like axons and dendrites.

In 1924, embryologists Hans Spemann and Hilde Mangold studied the function of a cluster of cells known as the Spemann organizer. They found that the transplantation of the organizer to another embryo induced the formation of secondary neural tissue.

Then in the 1950’s, Rita Levi-Montalcini and Stanley Cohen observed that transplanting pieces of tumors onto developing chicken embryos led to rapid neuron growth. They speculated that the tumor secreted a substance that caused this growth, and soon identified that protein as nerve growth factor, or NGF, which is essential to neuron survival.

In another transplant study, Nicole Le Douarin replaced parts of chick embryos with those from quails. By tracking the quail cells through development, she showed that a highly migratory group of cells, known as the neural crest, gives rise to mature peripheral nerves.

A few years later, Pasko Rakic studied how cells of the central nervous system arrange themselves into highly ordered structures during development. Rakic labeled dividing cells in developing fetuses with radioactive nucleotides, allowing him to determine when brain cells were born and where their final destination was in the mature brain.

During the last decades of the 20th century, a new era of research emerged that focused on the cell and molecular signals guiding nervous system development.

For example, in the mid ‘90s, Tom Jessell showed that certain transcription factors, or proteins that help control gene expression, influenced the development of unique subtypes of neurons in the developing mouse spinal cord. Following on this work, today’s researchers are still identifying new genes that control neural development.

Now that you’ve seen a few historical highlights, let’s go over some key questions in modern developmental neurobiology.

Many researchers study patterning and fate specification of nervous system cells. For example, they are interested in the genetic programming that guides early stem cells to differentiate into either neurons or glia, which are the support cells of the nervous system. They may also investigate secreted signals that influence more specialized identities within a class of cells or in specific locations.

Another major focus is how developing neurons and glia are able to organize themselves and assemble into the mature nervous system. Some researchers study cytoskeletal dynamics of cells migrating from their origin to the site at which they function. Others are interested in how signals from the extracellular environment influence migratory behavior.

Developmental neuroscientists also evaluate how connections between cells are formed and refined over the course of development. Some studies focus on the function of axon guidance receptors, which are cell surface proteins that detect external cues and guide developing axons, or neurites, to their target cells. Another focus is the study of the physical and chemical connections involved in synaptogenesis, which is the formation of new signaling connections, or synapses, between cells.

Now, let’s look at a few prominent methods used to answer some of these neurodevelopmental questions.

To study the genetic control of cell identity and nervous system patterning, it is helpful to manipulate the expression of specific genes in developing embryos. One popular method is in utero electroporation, in which exogenous DNA is delivered into the brain of developing rodents. By exposing the uterus of an anesthetized, pregnant mouse DNA can be injected into the embryonic brains and current applied to force the DNA into surrounding cells. Depending on the experiment, electroporated material can be used to either promote gene expression or prevent it, allowing researchers to examine the impact of individual proteins on brain development.

Explanted central nervous system tissue is commonly used to study cell migration during development. This technique involves dissecting small pieces of brain or spinal cord and culturing them in vitro. A major advantage to this approach is that the tissue is highly accessible for capturing cell movements via time-lapse imaging. Additionally, the effects of specific molecules on migration can easily be studied in explants through application of growth factors or pharmacological inhibitors to the culture media.

To study the molecules that are essential to the formation of neuronal networks, immunohistochemistry can be used. This technique takes advantage of the specificity of antibodies to mark the location of specific proteins in cells and tissues. Visualization of protein localization using fluorescent microscopy can help researchers make hypotheses regarding how these molecules influence the formation and function of structures like the synapse.

Now that you’re familiar with some approaches to studying developmental neuroscience let’s look at applications of this research in labs today.

A major goal of the study of neurodevelopment is to figure out how cell identity and morphology are determined. To study the genetic control of neuron development, these researchers delivered gene knockdown constructs into the developing chick nervous system via electroporation. Electroporated neurons within the neural tube were also labeled by dye injection, so that axon morphology could be compared between control and genetically altered cells.

To study how neurons establish connections, these researchers cultured neurons extracted from young rat pups. After several days in culture, cells were fixed and stained with antibodies specific to synaptic proteins, allowing for quantification of synapse formation under multiple experimental conditions, such as gene overexpression, or culture in modified growth medium.

Using their knowledge of the program driving neural development, today’s researchers can now force early embryonic cells, like stem cells, down specific differentiation pathways in vitro. These researchers treated human stem cells with the vitamin A derivative, retinoic acid, which resulted in reduced expression of transcription factors that maintain stem cell identity and enhanced expression of neuronal markers. This technique provides researchers with a valuable source of human neurons for investigating the mechanisms behind neurological disease.

You’ve just watched JoVE’s introduction to developmental neuroscience. This video reviewed historical highlights, key questions asked by developmental neuroscientists and some of the techniques they use.

Thanks for watching!

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