Muestreo de suelos y aislamiento de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

El objetivo de este procedimiento es demostrar los métodos y técnicas comúnmente utilizados para el muestreo de suelos y el aislamiento de nematodos enteropatógenos. Esto se logra recolectando primero muestras de suelo mediante un enfoque de transecto o, como se ha demostrado, un enfoque de muestreo aleatorio. A continuación, las muestras de suelo se mezclan con insectos para recuperar selectivamente nematodos enteropatógenos.

El paso final es recolectar los nematodos de los insectos infectados utilizando una trampa blanca modificada. En última instancia, estas técnicas representan pasos clave para el establecimiento exitoso de cultivos de nematodos enteropatógenos en el laboratorio y forman la base para los bioensayos posteriores. La ventaja de la técnica de muestreo de suelo es que podemos ir al campo y recolectar estados maduros de nematodos patógenos.

En lugar de tomar muestras de insectos infectados con estos nematodos, que rara vez se encuentran. La estrategia de muestreo aleatorio que empleamos se usa comúnmente para evaluar la diversidad de nematodos patógenos de una gran región geográfica o área. Esta técnica fue descrita por primera vez por las apuestas en Accur en 1975.

Es un procedimiento selectivo basado en la premisa de que las etapas de vida libre serán atraídas por los insectos huéspedes y los parasitarán. La demostración de los procedimientos estará a cargo de un estudiante graduado de la Rue Orozco y Ming Mingle, técnico de investigación en mi laboratorio. Laboratorio. El sitio para la recolección de muestras debe tener un área mínima de dos metros cuadrados y, si es posible, ser superior a cuatro metros cuadrados.

Para cada muestra de suelo, tome al menos tres submuestras más pequeñas dentro del área de muestra DM a C. Las submuestras pueden combinarse si se cumplen los objetivos del estudio. Recoja las muestras de suelo a una profundidad de cero a 15 centímetros.

Cada muestra debe ser de 250 gramos a un kilogramo. Utilice suelo, CORA, paletas, palas manuales o herramientas similares, y recoja de al menos cinco sitios aleatorios dentro de cada área de muestreo seleccionada. Cada muestra debe estar en doble bolsa y etiquetada con un marcador a prueba de agua.

La etiqueta debe contener información sobre el sitio, la ubicación, la elevación, la fecha y las variables ambientales, como la descripción del hábitat con la vegetación asociada y la temperatura en el sitio. Toma nota de los insectos locales y otras especies de invertebrados. Recoja las especies que no se pueden identificar inmediatamente para su posterior identificación en el laboratorio entre los sitios de recolección. Lave a fondo las herramientas de recolección con agua, luego desinféctelas con etanol al 70% o lejía al 0,5%.

Guarde las muestras de suelo en una hielera a una temperatura de ocho a 15 grados centígrados para su transporte. CES aparte una porción de la muestra para analizar las características brutas del suelo, como su composición, textura, conductividad, etc. De cada muestra de suelo, retire los desechos que podrían provocar la contaminación de microbios seicos.

A continuación, humedece la tierra con agua para que los nematodos que contenga puedan moverse fácilmente. Cargue de 200 a 250 gramos de tierra húmeda en un recipiente de plástico con tapa. Luego agregue cebos para insectos.

De cinco a 10 insectos serán suficientes. Coloque la tapa, voltee el recipiente y colóquelo en la oscuridad. A temperatura ambiente, cada dos o tres días, retire los insectos muertos y, según sea necesario, reemplácelos con insectos sanos para aumentar el peso.

Si el cadáver del insecto es marrón u ocre, esto sugiere que Stein y Nema parasitan parit. Mientras que si el cadáver es de color rojo ladrillo a púrpura oscuro, anticipe hetero. Use una trampa blanca modificada para recolectar los nematodos que han parasitado los cebos de insectos.

Primero, coloque la tapa de una placa de Petri de 50 o 60 milímetros en la base de una placa de 100 milímetros. A continuación, coloque una hoja de watman circular. Papel de filtro número uno en el plato más pequeño.

Enjuague los cadáveres de insectos con agua esterilizada y transfiéralos al papel de filtro. Extiéndase para que no estén en contacto entre sí. Llene solo el plato más grande con unos 20 mililitros de agua destilada y cubra el conjunto con los platos más grandes. Tapa.

Etiquete los platos con el nombre del nematodo, la fecha de cebo para insectos y la fecha. La trampa está preparada. Mantenga las trampas a temperatura ambiente y vigile si hay nematodos infectivos juveniles o IJ que emerjan de los cadáveres de los insectos.

Esto puede tardar de 10 a 25 días y depende de la temperatura y el nivel de humedad del lugar donde se guarde la trampa. Si el nivel de agua de la trampa se ha evaporado, asegúrese de volver a llenarla en platos con IJ. Recoge el agua del plato más grande, que debe contener nematodos.

Deje que los nematodos se hundan durante unos minutos y luego decante lentamente el agua. Una vez que los nematodos permanezcan en un pequeño volumen de agua, enjuáguelos unas cuantas veces más agregando agua nuevamente y luego vertiéndola con cuidado. A continuación, se realizan diluciones en serie para estimar la población de nematodos.

En un matraz de cultivo de 250 mililitros, ajuste la concentración del nematodo entre uno y 3000 nematodos por mililitro. Almacene esta suspensión entre 10 y 20 grados centígrados. En general, en la naturaleza, las posibilidades de encontrar insectos parasitados por nematodos enteropatógenos son muy bajas.

Por lo tanto, el protocolo descrito utilizando larvas de melanoma G como cebo se utilizó para aislar dichos nematodos a un ritmo mucho más eficiente. Después de cinco días, los insectos estaban infectados y tenían una coloración roja. Las trampas blancas modificadas mostraron rastros de nematodos.

Después de 15 días de estas trampas, los nematodos se recolectaron en el agua, tenían una apariencia limpia y estaban libres de tejidos de insectos. Un solo ciclo de extracción con larvas de Melania con galio puede ser insuficiente para recuperar todos los nematodos patógenos de Oma que se encuentran en una muestra de suelo. Por lo tanto, recomendamos hacer esto varias veces.

Además, aconsejamos a los usuarios que consideren otros insectos en lugar de Galleria, lo que también mejorará las posibilidades de recuperación. El debate de muestras de suelo con insectos es una técnica que también se puede considerar para el aislamiento de otros patógenos de insectos como bacterias u hongos.