Name: El aislamiento, la criopreservación y cultivo de células epiteliales Amnion Humanos para Aplicaciones clínicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Aprende a aislar células epiteliales de amnios humanos sin productos animales siguiendo normas cGMP. Este método permite obtener células puras mediante digestión enzimática y filtración, ideales para aplicaciones clínicas y ensayos terapéuticos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores reconocen el apoyo financiero del Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa del Gobierno de Victoria.

NOTA: placentario debe recogerse de embarazos saludables simples, con una preferencia por las cesáreas electivas plazo. Escrito, el consentimiento informado debe darse para la recogida de su placenta. Su comité de ética de investigación en humanos pertinentes deberían homologación toda la colección y el uso de tejidos humanos. 1. Aislamiento de células epiteliales Amnion <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque la placenta sobre una superficie estéril dentro de una cabina de seguridad biológica de clase II. </li><li> Uso de madejas estériles solución salina equilibrada (HBSS), lavar tanta sangre como sea posible de la superficie de placenta y membranas. </li><li> Con la placenta colocado con el cordón umbilical hacia arriba, separar mecánicamente el borde exterior de las membranas de amnios y el corion. </li><li> Una vez separados, la tira manualmente la membrana amnios del corion la membrana de la placenta, trabajando alrededor del borde de la membrana, hacia el cordón umbilical. NOTA: Sea CAREFul para eliminar las piezas de la contaminación de la membrana del corion del amnios. </li><li> Usando tijeras estériles, cortar la membrana amnios aproximadamente 2 cm desde la base del cordón umbilical y el lugar en unos 500 ml sellado recipiente que contiene 250 ml de HBSS. </li><li> Lávese bien agitando el frasco sellado que contiene la membrana amnios. </li><li> Retire la membrana amnios del recipiente de recogida utilizando pinzas estériles, y el lugar en una placa de Petri de 15 cm. </li><li> Cortar la membrana amnios en trozos de aproximadamente 5 cm de largo (cuando se mantiene en posición vertical con fórceps), desechando pedazos sangrientos o rasgados. </li><li> Colocar en un contenedor sellado de 500 ml y lavar con 250 ml de HBSS aproximadamente 3-5 veces o hasta que la membrana amnios vuelve translúcida sin sangre contaminante. NOTA: la presencia de sangre puede reducir la eficiencia de la digestión enzimática solución. </li><li> Transfiera todas las piezas de la membrana amnios en un recipiente que contiene 50 ml de la solución de digestión enzimática, teniendo cuidado deminimizar el arrastre de HBSS. </li><li> Incubar las piezas amnios en enzimática digieren solución en un baño de agua o habitación caliente a 37 ° C durante 15 minutos con agitación suave para eliminar la sangre restante. </li><li> Retire las piezas de membrana amnios de la digestión enzimática solución y colocar en un nuevo recipiente estéril. </li><li> Añadir 100 ml de solución enzimática fresco digieren a la membrana amnios y se incuban a 37 ° C durante 60 minutos en un baño de agua o habitación caliente con agitación suave (primera digestión). </li><li> Retire las piezas de membrana amnios y colocar en nueva toma cuidado envase para permitir la digestión enzimática solución para drenar de cada pieza de membrana. NOTA: Esto puede conseguirse arrastrando piezas amnios lo largo del borde interior del recipiente. </li><li> Añadir 100 ml de solución enzimática fresco digieren a las piezas de membranas amnióticas e incubar 60 minutos en un baño de agua o habitación caliente a 37 ° C con agitación suave (segunda digestión). </li><li> Pase el Suspensiòn celulardesde 1,14 Paso a través de un filtro de 70 micras y se centrifuga a 1000 xg durante 10 min. </li><li> Retire y deseche el sobrenadante y resuspender el botón celular en 4 ml de HBSS que contiene 1 mg / ml de inhibidor a base de soja de la enzima. Pipetear suavemente varias veces con una pipeta de 1 ml para obtener una suspensión de células individuales. NOTA: En esta etapa las células se pueden dejar en hielo hasta que las células de la segunda digestión se encuentran en la misma etapa de procesamiento. </li><li> Retire las piezas de membrana amnios y colocar en nueva toma cuidado envase para permitir la digestión enzimática solución para drenar de cada pieza de membrana. NOTA: Esto puede conseguirse arrastrando piezas amnios lo largo del borde interior del recipiente. </li><li> Pasar la suspensión de células a partir del paso a través de un filtro de 1,18 micras y 70 centrifugar a 1000 xg durante 10 min. </li><li> Retire y deseche el sobrenadante y resuspender el botón celular en 4 ml de HBSS que contiene 1 mg / ml de inhibidor a base de soja de la enzima. Pipetear suavemente varias veces con un 1 ml de pipette para obtener una suspensión de células individuales. </li><li> Células piscina de los dos compendios o alternativamente mantienen digiere celulares separados hasta después de los recuentos de células. NOTA: Esto evita la mezcla de células potencialmente bajas de viabilidad con pilas de gran viabilidad. </li><li> Añadir HBSS a un volumen final de 10-20 ml y llevar a cabo el recuento de células usando azul de tripano para medir la viabilidad. </li><li> Confirme el fenotipo de las células epiteliales mediante citometría de flujo. Invente cócteles de anticuerpos adecuados utilizando anti-EpCAM-PE (dilución 1: 2) anti-CD90-PECy5 (1: 250) y anti-CD105-APC (1: 100) en HBSS. </li><li> Resuspender un subconjunto de células de uno o ambos digiere en el cóctel de anticuerpos a una concentración de 25 x 10 6 células / ml. </li><li> Para citometría de flujo, la mancha 1 x 10 6 células con los cócteles de anticuerpos que contienen controles de isotipo (por ejemplo. El control-PE isotipo IgG1 + anti-CD90-PECy5 + anti-CD105-APC). Mantenga ~ 1 x 10 6 células sin teñir para citómetro de flujo de configuración. </li><li> Se incuban las células en anticuerpocócteles a 4 ° C durante 60 minutos. </li><li> Lavar las células 3 veces en HBSS y se resuspende en 5 a 10 millones de células por ml para citometría de flujo. </li><li> Realizar citometría de flujo y los resultados de nota. Se espera que la pureza de la cepa aislada de células (el porcentaje de EpCAM positivo y CD90 / CD105 células negativas) para ser 90-95% y &lt;1%, respectivamente. </li><li> Ponga a un lado un número adecuado de células para la prueba de los criterios de control de calidad o de liberación, según lo determinemos aplicación final. NOTA: Esto puede incluir la enfermedad / detección viral u otra seguridad o criterios biológicos. </li><li> Para las células restantes, siga el protocolo de crioconservación, o alternativamente colocar directamente en la cultura (paso directo a la cultura 3.6). </li></ol> 2. Criopreservación de HAECs <ol style="margin-left: 40px;"><li> Determinar el número de células y la viabilidad mediante citometría de flujo de datos o el conteo manual con exclusión de azul tripán. </li><li> Centrifugar a 700 g durante 5 min. </li><li> Resuspender celulars entre 1 hasta 10 millones de células por ml en animales medios criopreservación-producto libre. </li><li> Verter un volumen adecuado de las células en viales de crioconservación O-anillos y coloque en un aparato de congelación velocidad controlada, donde se produce el enfriamiento a aproximadamente 1 ° C / min hasta -80 ° C se logra. </li><li> Transferencia viales en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 3. La descongelación y Cultura de Cyropreserved HAECs <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retire los viales de crioconservación de nitrógeno líquido y colocar en hielo. NOTA: Para transferir solamente - proceder rápidamente a la siguiente etapa. </li><li> Descongele los viales de crioconservación rápidamente a 37 ° C hasta que sólo una pequeña parte (~ 5 mm x 5 mm) de los restos de hielo. NOTA: Es importante que la solución de células no se calienta para reducir los efectos tóxicos de DMSO en los medios de crioconservación. </li><li> Diluir los medios de crioconservación 10 veces con frío (~ 4 ° C) medios libres de suero, añadido gota a gota en un tamaño adecuadod tubo o contenedor. </li><li> Centrifugar a 700 xg durante 5 min a TA. </li><li> Resuspender en medio libre de suero, a una concentración aproximada de 1 millón de células por ml. Determinar el número de células y la viabilidad mediante conteo automatizado o manual con exclusión de azul tripán. Esperado viabilidad después de la descongelación será un 5-10% menos de viabilidad antes de la criopreservación. </li><li> Células de la placa de cerámica de plástico de cultivo tratadas con células estándar, o bien, utilizar colágeno de tipo I a las superficies de cultivo de abrigo. </li><li> Por tipo I revestimiento colágeno seguir el protocolo de abajo <ol><li> Preparar ácido soluble tipo I colágeno de placenta humana (colágeno de 15 mg con 25 ml de agua desionizada y 50 ácido acético glacial l). </li><li> Cubra vaso con Parafilm y una agitación moderada a 37 ° C hasta que se disuelven fibras de colágeno. </li><li> Solución de colágeno filtro estéril utilizando un filtro de 0,22 micras. </li><li> Diluir el colágeno Stock 01:10 filtrada con agua destilada. Esta acción diluida es la conce trabajosolución ntration para superficies de plástico de recubrimiento y de membrana. </li><li> Plástico capa de colágeno, las superficies de cristal y de membrana durante 2 horas a temperatura ambiente a 37 ° C, o O / N a 2-8 ° C. </li><li> Retire el exceso de líquido de la superficie recubierta, y deje que se seque O / N. </li><li> Enjuague con agua de grado de cultivo de tejido estéril o HBSS antes de la introducción de células y el medio. </li></ol></li><li> HAECs placa a una densidad de 25.000 células / cm 2 en medio libre de suero, y permiten la conexión que se produzca durante 72-96 horas. </li><li> Después de la unión, cambiar el medio por aspiración con cuidado y reemplazar con un volumen adecuado de medio libre de suero cada 2-3 días. </li><li> Passage células utilizando el protocolo de abajo <ol><li> Aspirar los medios de cultivo celular y lavar con un volumen de 1x estéril HBSS </li><li> Añadir volumen 1x de la solución de análisis enzimático e incubar durante 5 a 15 minutos, o hasta que las células se observaron separe de la superficie de cultivo de células. </li><li> Recoger digerido enzimático solución que contiene células, asegurando ceLLS se desprenden de la superficie de cultivo de células pipeteando repetidamente la solución enzimática digerir contra la superficie de cultivo de células </li><li> Centrifugar a 700 g durante 5 min. </li><li> Resuspender el sedimento celular en un volumen adecuado de HBSS que contiene 1 mg / ml de inhibidor a base de soja enzima. Pipetear suavemente varias veces con una pipeta de 1 ml para obtener una suspensión de células individuales. </li><li> Añadir medio libre de suero a una concentración aproximada de 1 millón de células / ml. Determinar el número de células y la viabilidad mediante conteo automatizado o manual con exclusión de azul tripán. </li><li> HAECs placa a una densidad de 25.000 células / cm 2 en medio libre de suero, y continúan con los métodos estándar de cultivo. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+SV+%22Stem+Cells+and+Regenerative+Medicine%22">Stem Cells and Regenerative Medicine</a>. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+fluid+and+placental+membranes%3A+unexpected+sources+of+highly+multipotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Reprod.+Med%22%5BJournal%5D)">Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells.</a> Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).</li>
<li>Parolini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+isolation+and+characterization+of+cells+from+human+term+placenta%3A+outcome+of+the+first+international+Workshop+on+Placenta+Derived+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells.</a> Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).</li>
<li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preterm+human+amnion+epithelial+cells+have+limited+reparative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential.</a> Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).</li>
<li>Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+pluripotent+stem+cell+line+derived+from+human+amniotic+membranes+and+initiation+of+germ+layers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro.</a> Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).</li>
<li>Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+amniotic+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of amniotic epithelial stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3(2007).</li>
<li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6(2010).</li>
<li>Ilancheran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+derived+from+human+fetal+membranes+display+multilineage+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential.</a> Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).</li>
<li>Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+amnion+epithelium+into+skin+and+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles.</a> Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).</li>
<li>Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+characteristics+of+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells.</a> Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).</li>
<li>Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+ocular+surface+with+heterologous+limbal+epithelium+and+amniotic+membrane+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model.</a> Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).</li>
<li>Sankar, V., Muthusamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+in+spinal+cord+injury+repair+research%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research.</a> Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).</li>
<li>Yuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+human+amniotic+epithelial+cells+express+connexin+26+and+Na-K-adenosine+triphosphatase+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear.</a> Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+factors+secreted+by+human+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelial+cells+ameliorate+behavioral+dysfunction+and+reduce+infarct+size+in+the+rat+middle+cerebral+artery+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model.</a> Shock. 29 (5), 603-611 (2008).</li>
<li>Venkatachalam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+neurotrophic+factor+secreted+by+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biocell%22%5BJournal%5D)">Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells.</a> Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).</li>
<li>Manuelpillai, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+induces+markers+of+alternative+macrophage+activation+and+reduces+established+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis.</a> PLoS One. 7 (6), e38631(2012).</li>
<li>Wei, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion-isolated+cells+normalize+blood+glucose+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).</li>
<li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+prevent+bleomycin-induced+lung+injury+and+preserve+lung+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function.</a> Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+induced+to+express+functional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> PLoS One. 7 (9), e46533(2012).</li>
<li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+do+not+abrogate+pulmonary+fibrosis+in+mice+with+impaired+macrophage+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).</li>
<li>Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amnion+epithelial+cells+as+a+candidate+therapy+for+acute+and+chronic+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury.</a> Stem cells Int. 2012, 709763(2012).</li>
<li>Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+mediate+lung+repair+by+directly+modulating+macrophage+recruitment+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization.</a> , (2013).</li>
<li>Litvinov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28Ep-CAM%29+modulates+cell-cell+interactions+mediated+by+classic+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).</li>
<li>Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+cell+adhesion+molecule+%28Ep-CAM%29+as+a+morphoregulatory+molecule+is+a+tool+in+surgical+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology.</a> The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).</li>
<li>Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+obtained+from+different+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues.</a> Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).</li>
<li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPark%2C+A+%22Newborn+Stem+Cells%3A+Identity%2C+Function%2C+and+Clinical+Potential%22">Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential</a>. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios parámetros críticos que pueden tener un impacto significativo en el éxito de esta metodología. El almacenamiento de la placenta o el amnios para hasta 3 horas antes del aislamiento de HAECs puede ser deseable para fines logísticos o de programación, sin embargo se recomienda que el tejido se procesa tan pronto como sea posible. Si el tejido se va a almacenar, se recomienda que se realice el almacenamiento después de la disección y el lavado de la membrana amnios. Amnion se puede almacenar en HBSS que contiene...

Las células derivadas de fuentes perinatales, como la placenta, membranas de la placenta, el cordón umbilical y el líquido amniótico han atraído la atención de investigadores y clínicos como una fuente potencial de células para la medicina regenerativa 1,2. La razón de este interés es que todos estos tipos de células poseen un cierto grado de plasticidad y capacidad inmunomoduladora 3, propiedades que son fundamentales para sus aplicaciones terapéuticas potenciales. HAECs son una población heterogénea epitelial que se puede derivar de plazo o pre-término membrana amnios 4, proporcionando una abundante fuente potencial de material celular regenerativa. Las propiedades que hacen que HAECs atractivos como una terapia celular incluyen su multipotencia, baja inmunogenicidad, y las propiedades anti-inflamatorias. HAECs se han encontrado para ser altamente multipotentes tanto in vitro como in vivo, capaces de diferenciarse en linajes mesodérmicos (cardiomyocytes, miocitos, adipocitos, osteocitos), de origen endodérmico (células pancreáticas, células hepáticas, células pulmonares) y linajes ectodérmicas (pelo, piel, células neuronales y astrocitos) 5-10. De modo tranquilizador, a pesar de sus HAECs multipotencialidad no parecen bien forman tumores o promueven el desarrollo de tumores in vivo. Además, HAECs también son inmunes privilegiados, que expresa bajos niveles de antígenos de clase II leucocitarios humanos (HLA) 8. Esta propiedad probablemente subyace en su capacidad para evadir el rechazo inmunológico después del trasplante alogénico y xenogénico, como se demuestra en los estudios que utilizaron monos inmunes competentes, conejos, cobayas, ratas y cerdos 11-13. HAECs mostrar inmunomodulador potentes propiedades inmunosupresoras y por lo tanto ofrecen ventajas prácticas significativas para potenciales aplicaciones clínicas en el tratamiento de la enfermedad autoinmune. HAECs se cree que ejercen funciones inmunomoduladoras tanto en el sistema inmune innata y adaptativa. Ene de los mecanismos sugeridos, es a través de la secreción de factores inmunomoduladores 14. Las aplicaciones actuales de HAECs en modelos de enfermedades de animales pre-clínicos incluyen el tratamiento de apoplejía, esclerosis múltiple, enfermedad hepática, diabetes y enfermedades pulmonares crónicas y agudas. Los investigadores han mostrado interés en utilizar HAECs para tratar posterior al accidente cerebrovascular inflamación cerebral debido a sus propiedades únicas. Hay evidencia de que HAECs puede cruzar la barrera de sangre del cerebro donde pueden injertarse, sobrevivir durante hasta 60 días, de diferenciarse en neuronas, disminuir la inflamación y promover la regeneración del tejido nervioso central dañado sistema en modelos animales de enfermedades neurológicas 15. HAECs ofrecen la posibilidad de dirigir e invertir múltiples vías patológicos que contribuyen al desarrollo y la progresión de la esclerosis múltiple. Por ejemplo, los resultados de estudios en animales pre-clínicos sugieren que HAECs son fuertemente inmunosupresora ypuede potencialmente inducir tolerancia inmune periférica y revertir las respuestas inflamatorias en curso. HAECs también se han demostrado tener la capacidad de diferenciarse en células neuronales in vivo y mejorar la neuroregeneración endógena a través de la secreción de una amplia gama de factores neurotróficos 16. Células epiteliales humanas y amnios roedor ya han demostrado su eficacia terapéutica para el tratamiento de la enfermedad hepática en modelos animales. En un modelo de daño de inducción tetracloruro de carbono de la enfermedad hepática, haec trasplante de plomo para el injerto de HAECs viables en el hígado, acompañada con una reducción de la apoptosis de hepatocitos, y la disminución de la inflamación y la fibrosis hepática 17. HAECs se puede estimular a los factores de páncreas expresadas incluyendo insulina y glucosa transportistas. Varios estudios han investigado el potencial de HAECs para restablecer los niveles de glucosa en sangre en ratones diabéticos 18. En los ratones que recibieronHAECs, tanto a nivel de peso y glucosa en la sangre del cuerpo de los animales disminuyó a niveles normales después de la inyección de las células. Estos estudios presentan un caso fuerte para el uso de HAECs para el tratamiento de la diabetes mellitus. HAECs tienen un papel demostrado en la prevención y reparación de la lesión pulmonar aguda y crónica experimental, tanto en adultos y neonatales 19 modelos. Estos estudios encontraron que HAECs diferencian in vitro en células epiteliales del pulmón funcional que expresan múltiples proteínas pulmonares asociadas, incluyendo la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana (CFTR), el canal iónico que está mutado en pacientes con fibrosis quística 20. Además, cuando HAECs se entregan al adulto lesionado y pulmonar neonatal, que ejercen sus efectos a través de la modulación de reparación de las células inmunitarias del huésped, reduciendo el reclutamiento de leucocitos pulmonar, incluyendo neutrófilos, macrófagos y linfocitos 21-23. Dada su abundancia,historial de seguridad y aplicaciones clínicas probadas para varias enfermedades, los ensayos clínicos utilizando HAECs es inevitable. Con el objetivo de acelerar la traducción de terapias HAEC a de ensayos clínicos, hemos desarrollado métodos para aislar, criopreservar y HAECs cultura de una manera adecuada para los ensayos clínicos, el uso de reactivos a productos libres de animales de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP) directrices . Basamos este protocolo un protocolo previamente publicado que estábamos usando con éxito para aislar HAECs utilizando reactivos de origen animal 6. Hemos modificado el protocolo original para reemplazar productos de origen animal con reactivos de productos libre de animales, y la optimización posterior se realizó para optimizar el rendimiento de células, la viabilidad y pureza. Nuestro objetivo era desarrollar un protocolo que cumplir con las normas reglamentarias para la fabricación de células para los ensayos clínicos en humanos.

<table><tbody><tr><td>Kit de Colección</td> Bandeja <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de pelado</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-361B</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de vendaje Liberty, puntiaguda 13 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17329&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras - Afiladas/Romas Rectas</td><td>Fisher Scientific NC0562592</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de látex estériles&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ropa</td><td></td><td></td><td></td>de protección</tr><tr><td>Ropa de protección (bata)</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Batas de aislamiento</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de látex estériles&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mascarilla de uso general</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7511</td><td></td></tr><tr><td>Bonnets</td><td>Medline</td><td>CRI1001</td><td></td></tr><tr><td>Fundas para zapatos</td><td>U-line</td><td>S-7873W</td><td></td></tr><tr><td>Medios y reactivos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Solución salina equilibrada (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td>sin calcio ni magnesio</td></tr><tr><td>TrypZean (producto animal&ndash; tripsina recombinante libre)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3449</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la tripsina de soja&nbsp; 1g/50mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de azul de tripano</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130 - 091-253</td><td></td></tr><tr><td>PE-isotipo control</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-845</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555597</td><td></td></tr><tr><td>PeCy5-control de isotipo</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>control de isotipo APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>340754</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo VI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>Consumibles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta graduada de 50 ml</td><td>BD/Falcon</td><td>356550</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta graduada de 10 ml</td><td>BD/Falcon</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta graduada de 5 ml</td><td>BD/Falcon</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubos de halcón</td><td>BD/Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de halcón de 15 ml</td><td>BD/Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 15 cm</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filtros</td><td>BD/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filtros</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Puntas de pipeta</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-401</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Puntas de pipeta</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-409</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Jeringa</td><td>BD/Medical</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>Espátula de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-245-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Barco de pesaje de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-102&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Viales criogénicos</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete</td><td></td><td></td><td></td> de riesgo biológico</tr></tbody></table>

el aislamiento, la criopreservación y cultivo de células epiteliales amnion humanos para aplicaciones clínicas

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Las células epiteliales de amnios humanos (hAECs) derivadas de membranas de amnios a término o pretérmino han atraído la atención de investigadores y clínicos como una fuente potencial de células para la medicina regenerativa. La razón de este interés es la evidencia de que estas células tienen una capacidad de diferenciación altamente multipotente, baja inmunogenicidad y funciones antiinflamatorias. Estas propiedades han llevado a los investigadores a investigar el potencial de las hAEC para ser utilizadas para tratar una variedad de enfermedades y trastornos en estudios preclínicos con animales con mucho éxito.
hAEC han encontrado una amplia aplicación para el tratamiento de una serie de enfermedades y trastornos. Las posibles aplicaciones clínicas de los hAEC incluyen el tratamiento del accidente cerebrovascular, la esclerosis múltiple, la enfermedad hepática, la diabetes y las enfermedades pulmonares crónicas y agudas. Pasar de los estudios preclínicos en animales a los ensayos clínicos requiere un mayor nivel de control de calidad y seguridad para los productos de terapia celular. Por consideraciones de seguridad y control de calidad, es preferible que los protocolos de aislamiento celular utilicen reactivos libres de productos animales. 
Hemos desarrollado protocolos para permitir a los investigadores aislar, criopreservar y cultivar hAECs utilizando reactivos libres de productos animales. La ventaja de este método es que estas células pueden aislarse, caracterizarse, criopreservarse y cultivarse sin el riesgo de entregar patógenos animales potencialmente dañinos a los humanos, al tiempo que se mantienen los rendimientos celulares, la viabilidad y el potencial de crecimiento adecuados. Para los investigadores que pasan de los estudios preclínicos en animales a los ensayos clínicos, estas metodologías acelerarán en gran medida la aprobación regulatoria, disminuirán los riesgos y mejorarán la calidad de su población de células terapéuticas.

Cuando este procedimiento se sigue correctamente, se debe esperar un rendimiento promedio de 120 millones de HAECs, con un rango típico de 80 hasta 160 millones de células. A partir de estos rendimientos, una viabilidad media de 83 ± 4% se puede esperar. El aumento de rendimiento medio y la viabilidad ligeramente inferior en el método clínico puede ser debido a la mayor actividad de la tripsina que el producto derivado de un animal, y quizás también debido a la falta de proteínas séricas. HAECs aisladas tienen un perfil...

Describimos un protocolo para aislar y cultivar células epiteliales de amnios humano (hAECs) utilizando reactivos libres de productos animales de acuerdo con las directrices actuales de buenas prácticas de fabricación (cGMP).

El aislamiento, la criopreservación y cultivo de células epiteliales Amnion Humanos para Aplicaciones clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar la población de células epiteliales de una membrana de amnios humano. Esto se logra primero quitando la membrana amnios de la membrana corion y la placenta en el segundo paso. La membrana del amnios se lava de todos los rastros de sangre y luego se digiere con una solución de enzima de tripsina libre de productos animales.En el paso final, la suspensión de tejido se filtra para recoger las células epiteliales aisladas. En última instancia, la pureza de la población de células epiteliales del amnios se puede evaluar mediante un análisis de citometría de flujo. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que no requiere la exposición de las células a productos de origen animal, lo que significa que estas células son útiles para los ensayos clínicos.Para aislar las células epiteliales del amnios, comience colocando la placenta sobre una superficie estéril dentro de un gabinete de seguridad biológica de clase dos. Luego, use HBSS estéril para lavar la mayor cantidad de sangre posible de la superficie de la placenta. A continuación, sitúe la placenta de modo que el cordón umbilical y las membranas placentarias queden hacia arriba y retire manualmente la membrana amnial de la membrana corional de la placenta trabajando alrededor del borde de la membrana hacia el cordón umbilical.Tenga cuidado de quitar cualquier pedazo de membrana de corión contaminante del amnios, y luego use tijeras estériles para cortar la membrana del amnios aproximadamente a dos centímetros de la base del cordón umbilical y coloque la membrana en un recipiente de 500 mililitros que contenga 250 mililitros de HBSS, selle el recipiente y agítelo bien para lavar el pañuelo, y luego use pinzas estériles para transferir la membrana a una placa de Petri de 15 centímetros. Ahora, corte la membrana en pedazos verticales de cinco centímetros de largo y lave los pedazos de tres a cinco veces más, como se acaba de demostrar, hasta que la membrana se vuelva translúcida sin sangre contaminante. Cuando se haya extraído toda la sangre, transfiera los trozos de tejido a 50 mililitros de solución de digestión enzimática, tomando para minimizar el arrastre de cualquier HBSS e incube el tejido amnios en una habitación cálida a 37 grados centígrados con una agitación suave para eliminar cualquier sangre restante después de 15 minutos, arrastre cada pieza a lo largo del borde interior del recipiente para drenar la solución de digestión vieja y agregue las piezas a 100 mililitros de solución enzimática fresca para digerir.Después de una hora de digestión en las mismas condiciones, transfiera las membranas a un nuevo recipiente de solución de Enzymatic Digest. Teniendo cuidado de drenar los tejidos como se acaba de demostrar y agitar suavemente las membranas durante los últimos 60 minutos después de la segunda digestión. Cuele la suspensión celular a través de un filtro de 70 micrómetros y luego centrifugue la suspensión celular durante 10 minutos A 1000 Gs y temperatura ambiente, vuelva a suspender suavemente el pellet en cuatro mililitros de inhibidor enzimático a base de soja para crear una suspensión de una sola célula, y luego agregue HBSS a las celdas hasta un volumen final de 10 a 20 mililitros.Determinar el número de células viables por exclusión de azul de triam, y luego criopreservar las células epiteliales de amnios aisladas. Primero, dóblalos durante cinco minutos a 700 quesos y temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender el pellet a una vez 10 de las seis a una veces 10 de la séptima célula por mililitro en un medio de criopreservación libre de productos animales y pipetee un volumen adecuado de células en viales de criopreservación con anillos.Finalmente, coloque los viales en un aparato de congelación de velocidad controlada donde el enfriamiento se produzca a aproximadamente un grado Celsius por minuto hasta que se alcancen menos 80 grados Celsius, y luego transfiera los viales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Muchos medios libres de productos animales funcionan adecuadamente. Sin embargo, la concentración óptima de DMSO es de aproximadamente cinco a 10%Por lo general, la viabilidad esperada después de la descongelación es de cinco a 10% menos que la viabilidad previa a la criopreservación y puede ser significativamente mayor para el usuario inexperto.El cultivo celular se puede realizar con células epiteliales de amnios humanos para permitir la caracterización o diferenciación de las células para su posterior análisis, ya que mantienen su fenotipo epitelial en medios de cultivo libres de suero. Además de poseer propiedades inmunorreguladoras y antiinflamatorias, se ha demostrado que las células epiteliales de amnios humano son altamente multipotentes, in vitro e in vivo, diferenciándose en linajes celulares representativos de las tres capas germinales primarias después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores realizaran ensayos clínicos para afecciones como la enfermedad pulmonar y la enfermedad de injerto contra huésped.

isolation-cryopreservation-culture-human-amnion-epithelial-cells-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Desde James Thomson et al desarrollaron una técnica en 1998 para aislar y hacer crecer hES en cultivo, las células de congelación para su uso posterior y el deshielo y la ampliación de las células de un stock congelado se han convertido en importantes procedimientos realizados en el cultivo de rutina hES celular. Dado que las células hES son muy sensibles a las tensiones de la congelación y descongelación, debe tomar especial cuidado. Aquí se demuestra la técnica adecuada para descongelar...

Congelación y descongelación células estaminales embrionarias humanas

Este protocolo describe la reprogramación de primaria amniótico líquido y membrana de las células madre mesenquimales en células pluripotentes inducidas mediante un enfoque episomal no integrar en condiciones totalmente químicamente definidas. Se detallan los procedimientos de extracción, cultivo, reprogramación y caracterización de las células pluripotentes inducidas resultante por métodos rigurosos.

Reprogramación de primario líquido amniótico y las células de la membrana a pluripotencia en condiciones libres de Xeno

Este estudio presenta un procedimiento optimizado y validado para el aislamiento y cultivo de células stromal endometriales humanas para llevar a cabo análisis de decidualization en vitro . Además, este estudio proporciona un método detallado para eficiente precipitación un gen específico usando siRNA en células stromal endometriales humanas.

Aislamiento de células Stromal Endometrial humanas In Vitro Decidualization

Este protocolo describe el aislamiento de células epiteliales de diferentes regiones anatómicas de la membrana amniótica humana para determinar su heterogeneidad y propiedades funcionales para su posible aplicación en modelos clínicos y fisiopatológicos.

Cultivo In Vitro de Células Epiteliales de Diferentes Regiones Anatómicas de la Membrana Amniótica Humana

Aquí, describimos un método para calentar blastocistos humanos vitrificados, cultivarlos a través del período de implantación in vitro, digerirlos en células individuales y recoger las células trofoblastas tempranas para su posterior investigación.

Colección de células únicas de células trofoblastas en embriones humanos en fase de implantación

El presente estudio reporta un protocolo para el tamizaje cromosómico de embriones humanos que utiliza medio de cultivo gastado, lo que evita la biopsia embrionaria y permite la identificación de ploidía cromosómica mediante NGS. El presente artículo presenta el procedimiento detallado, que incluye la preparación del medio de cultivo, la amplificación del genoma completo (WGA), la preparación de la biblioteca de secuenciación de nueva generación (NGS) y el análisis de datos.

Cribado cromosómico de embriones humanos preimplantacionales mediante el uso de medios de cultivo gastados: recogida de muestras y análisis de ploidía cromosómica

Aquí describimos el aislamiento, la amplificación y la diferenciación de las células epiteliales nasales humanas primarias (HNE) en la interfaz aire-líquido y un protocolo de biobanco que permite congelar con éxito y luego descongelar la HNE amplificada. El protocolo analiza las propiedades electrofisiológicas de las células HNE diferenciadas y la corrección de la secreción de cloruro relacionada con CFTR en diferentes tratamientos moduladores.

Células epiteliales nasales humanas primarias: biobancos en el contexto de la medicina de precisión

Este estudio proporciona un protocolo detallado para la criopreservación eficiente de células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de células madre humanas.

Criopreservación de células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de células madre embrionarias humanas en la etapa óptima

El presente estudio informa de un protocolo más fácil, económico y que ahorra tiempo para aislar y cultivar de manera eficiente células epiteliales mamarias humanas primarias (HMEC) a partir de pequeñas cantidades de tejido mamario. Este protocolo es adecuado para producir rápidamente HMEC primarios tanto para aplicaciones de laboratorio como clínicas.

Aislamiento y cultivo de células epiteliales mamarias humanas primarias

Este protocolo describe un nuevo modelo de cultivo tridimensional (3-D) que utiliza un hidrogel de hialuronano unido a tiramina para encapsular y cultivar folículos preantrales del ovario de ratón. También detallamos dos enfoques para la criopreservación de folículos ováricos por vitrificación.

Aplicación de un nuevo hidrogel de hialuronano para el cultivo tridimensional de folículos y metodología para la criopreservación de folículos ováricos de ratón

Aprende a aislar células epiteliales de amnios humanos sin productos animales siguiendo normas cGMP. Este método permite obtener células puras mediante digestión enzimática y filtración, ideales para aplicaciones clínicas y ensayos terapéuticos.

El aislamiento, la criopreservación y cultivo de células epiteliales Amnion Humanos para Aplicaciones clínicas

Explorar más videos