La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

El objetivo general de este procedimiento es mapear la interacción entre dos proteínas o dominios de proteínas. En este caso, se estudian los dominios proteicos relacionados con el cáncer y CHFR. El objetivo general de este procedimiento es mapear la interacción entre dos proteínas o dominios de proteínas.

En este caso, se estudian los dominios proteicos relacionados con el cáncer y CHFR. El segundo paso es incubar la matriz de péptidos CHFR con su socio de unión, la proteína quieta. A continuación, la matriz se lava y se incuba con peroxidasa de rábano picante, anticuerpo conjugado.

A continuación, la matriz se somete a la detección de luminiscencia química para detectar la unión. El paso final es analizar los resultados e identificar los sitios de unión entre las proteínas. Este estudio allana el camino para el diseño de inhibidores racionales de la unión a CHFR todavía, cuya interacción incontrolada puede conducir al desarrollo de cáncer.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación de la interacción de proteínas, como cuáles son las regiones específicas que meditan una interacción entre dos proteínas, Divida la secuencia de la proteína objetivo en 10 a 20 péptidos residuales. Que se superponen parcialmente. La cantidad de superposición puede variar, pero en principio, cuanto más larga sea la superposición, mejor.

Al diseñar los péptidos, tenga en cuenta los elementos de la estructura secundaria conocida en la proteína que pueden ser responsables de la interacción. La matriz de péptidos diseñada se puede pedir a través de proveedores comerciales. Para este experimento, los péptidos de los residuos del dominio CHFR 4 24 a 6 62 se unen covalentemente a la matriz a través del extremo C.

Después de recibir la matriz diseñada, prepárela para el experimento bloqueándola primero para evitar el enlace no específico. Hacer una solución de bloqueo de 2,5%peso por volumen. Leche desnatada en polvo en una solución tampón tris que contenga 0,05%Tween 20 o TBST para evitar la unión inespecífica.

Sumerja la matriz en cinco mililitros de solución de bloqueo. Incube la matriz durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados en un agitador. Lave primero la matriz con cinco mililitros de solución de bloqueo durante 30 segundos.

A continuación, lave la matriz dos veces con cinco mililitros de TBST durante cinco minutos en una coctelera a temperatura ambiente. A continuación, incube la matriz lavada con cinco mililitros de solución de proteína marcada con polihistidina que contenga un 2,5% de peso por volumen. Leche desnatada en polvo para evitar uniones inespecíficas.

En este caso, se utiliza una solución de 4,5 micromolares de residuos de proteínas sin gas de 500 a 6 50. A continuación, incubar la matriz en la solución de proteínas durante tres a ocho horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de la incubación en la solución proteica.

Lave la matriz con cinco mililitros de TBST durante 30 segundos en una coctelera a temperatura ambiente, seguido de dos lavados adicionales de cinco minutos. Ahora incube la matriz lavada con cinco mililitros de anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido en un tampón de incubación que contenga los mismos ingredientes a las mismas concentraciones que la solución de bloqueo durante una hora en un agitador a temperatura ambiente, el anticuerpo puede unirse a la proteína objetivo o a la marca, realizar experimentos de control, probar la interacción del anticuerpo con los péptidos en la matriz repitiendo el mismo protocolo en una matriz separada deslizar sin incubar con la proteína antes de leer las matrices. Lávalos como antes con cinco mililitros de TBST.

Lleve a cabo el desarrollo de quimioluminiscencia con un kit de sustrato de Western blot de quimioluminiscencia mejorado. Realice la detección con un analizador de imágenes luminiscentes como una cámara Fuji film LAS 3000. Analice los resultados, asegurándose de que ambos duplicados en la matriz muestren las mismas señales para que los resultados sean confiables.

Si se conoce la estructura de la proteína asociada, busque en la estructura los péptidos de unión y busque los sitios de unión. Tenga en cuenta que los péptidos que están lejos en la secuencia pueden estar juntos en la estructura terciaria y crear un sitio de unión. En nuestro ejemplo, todavía es una proteína centrosomal muy importante que controla la división celular normal y la proliferación celular que todavía interactúa con varias proteínas a través de su región intrínsecamente desordenada.

Utilizando la matriz de péptidos diseñada, se revelaron los sitios aún de unión en el supresor tumoral CHFR. Cada punto negro en la matriz representa el péptido derivado A-C-H-F-R que se une a seguir teniendo en cuenta que cada péptido aparece dos veces ya que existe por duplicado, lo que verifica la fiabilidad de los resultados. El cribado de la matriz de péptidos reveló siete péptidos derivados de CHFR que se unieron a los residuos de la región aún intrínsecamente desordenada del 500 al 60.

Estos resultados nos permitieron mapear el sitio de unión de los alambiques en CHFR. A pesar de la distancia de estos siete péptidos en la secuencia primaria CHFR. Crean un sitio de unión bien definido para la imagen fija en la estructura terciaria CHFR.

Este método es aplicable para caracterizar cada interacción proteína-proteína siguiendo este procedimiento. Se deben utilizar métodos cuantitativos como la fluorescencia y los isótopos o ITC para verificar y cuantificar la introducción de péptidos.