Name: Purificar el Impuro: Secuenciación metagenomes y Metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Aprenda a procesar muestras de esputo de fibrosis quística para estudiar comunidades virales y microbianas mediante secuenciación metagenómica y metatranscriptómica. Este protocolo optimiza el aislamiento de ácidos nucleicos para análisis genómicos.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud (1 R01 GM095384-01) otorgado a Bosque Rohwer. Agradecemos Epicentro, una compañía de Illumina para proporcionar un acceso temprano a kits Ribo-Zero Epidemiología. Damos las gracias a Marcos Hatay para el diseño y producción de el soporte del tubo de ultracentrifugación. Damos las gracias a Andreas Haas y Benjamin Knowles para lecturas críticas y discusiones del manuscrito, y Lauren Paul para ayudar al proceso de filmación.

Los autores no tienen nada que revelar.

La metagenómica viral Las partículas virales se concentraron usando polietilenglicol (PEG) precipitación o pequeños concentradores de volumen. En algunos casos, puede no ser necesario concentración, pero antes de la filtración o centrifugación a baja velocidad pasos se utilizan para eliminar las células eucariotas y microbianos. Lisados ​​virales se enriquecerán aún más y se purificaron usando la densidad de ultracentrifugación en gradiente de 9,41 o filtros de pequeño tamaño (por ejemplo, 0,45 m) para eliminar las células microbianas eucariotas y grandes 25. Ultracentrifugación en gradiente de densidad se lleva a cabo típicamente con soluciones densas pero inertes, tales como sacarosa o cloruro de cesio para aislar y concentrar partículas virales 41. La separación física se basa en el tamaño y la densidad de flotación de las partículas virales. Por lo tanto, la elección apropiada del tamaño de poro del filtro y la preparación rigurosa de los gradientes son esenciales para aislar a las comunidades específicas virales, como el éxito de la recuperación física deVLP determina la comunidad aislado 41 (es decir, partículas virales que no pasan a través del filtro o caen dentro de la densidad de la extracción no serán detectados en el metagenoma). Después del aislamiento viral y la concentración, puede haber contaminación de material genómico no viral presente en la muestra tanto en la forma de ácidos nucleicos libres y microbiana y las células eucariotas. Por lo tanto, es crítico para verificar la pureza de las partículas virales en muestras (Figuras 1A y 1B). Un tratamiento de cloroformo se utiliza comúnmente para lisar las células restantes, seguido por tratamiento con nucleasa para degradar ácidos nucleicos libres antes de la extracción de ácido nucleico. Una advertencia al flujo de trabajo presentado fue el uso de la separación en gradiente de densidad para aislar partículas virales ya que puede excluir partículas virales con envuelta que pueden ser demasiado boyante para entrar en el gradiente de CsCl. Una alternativa &quot;-catch-all&quot; método es omitir la SEPAR gradiente de densidadación y aislar el ADN de la comunidad a partir de los 0,45 m - filtrados tratados con cloroformo y DNasa I. Este método también es adecuado para dar cabida a pequeños volúmenes de muestra, como los de hisopos o plasma sanguíneo. Sin embargo, esto puede resultar en la contaminación bacteriana cloroformo-resistente y una mayor cantidad de ADN extracelular DNasa I-resistente. Protocolos de secuenciación actuales requieren de 1 ng a 1 mg de ácidos nucleicos para la preparación de la biblioteca de secuenciación de ADN mediante el cual los rendimientos más altos proporcionan una mayor variedad de opciones de secuenciación. La concentración de ADN de viromes generados a menudo va desde debajo del límite de detección a más de 200 ng / l. La cantidad de ácidos nucleicos virales recuperadas puede ser insuficiente para la preparación de biblioteca de secuenciación directa. En tales casos, la amplificación de ácido nucleico es esencial. Linker amplificación escopeta bibliotecas (LASLs) 2,42,43 y amplificación del genoma basado en múltiples desplazamientos de amplificación (MDA) son los doslos métodos más comúnmente utilizados para generar suficiente ADN para la secuenciación. MDA métodos tales como los basados ​​en ADN polimerasa Phi29 se sabe que sufren de sesgos de amplificación, y pueden amplificar preferentemente ssDNA y DNA circular, lo que resulta en taxonómica no cuantitativo y caracterización funcional 44,45. Una versión optimizada del enfoque LASLs se ha demostrado que sólo introducir sesgos mínimos, promueve una mayor sensibilidad (para pequeñas cantidades de material de partida), y se adapta fácilmente para diferentes plataformas de secuenciación 43. Sin embargo, el enfoque tiene muchos pasos, requiere un equipo especializado para minimizar la pérdida de ADN, y se limita a plantillas de ADN de doble cadena. En nuestro laboratorio, este enfoque se ha adaptado con éxito para amplificar cantidad detectable e indetectable de ADN extraído de lavage- broncoalveolar, VLP derivadas de agua coral- y marinos (no publicados y Hurwitz et al. 46). El desarrollo de las tuberías de análisis de datos tiene classically sido uno de los aspectos más desafiantes de análisis de metagenómica viral debido a la naturaleza muy diversa y en gran parte desconocida de las comunidades virales. Si bien se estima que hay 10 8 genotipos virales en la biosfera, bases de datos actualizadas virales actuales contener ~ 4.000 genomas virales, que es aproximadamente 1 / número 100.000 de esta diversidad viral totales aproximados. Por lo tanto, búsquedas basadas en similitud (tales como BLAST 47) para la asignación taxonómica y funcional en metagenomes virales poseen desafíos inherentes. Muchas secuencias de dejar de tener importantes similitudes con genomas en la base de datos y, por tanto, se clasifican como desconocido. A pesar de que las búsquedas basadas en homología son las aplicaciones más importantes para la asignación de la taxonomía y la función de secuencia de datos, enfoques alternativos basados ​​en el análisis de bases de datos independientes se han desarrollado 48- 50. Fancello et al. 51 proporcionan una revisión completa de herramientas computacionales y algoritmos utilizados en Viral metagenómica. Microbiana metagenómica Típicamente, la cantidad total de ADN extraído de las comunidades hipotónicas lisis tratados microbianos (ADN-HL) van de 20 ng a 5 mg. El rendimiento depende en gran medida del estado de salud del paciente y la cantidad de muestra de esputo recogidos, que explica las variaciones observadas en el rendimiento total de HL-ADN extraído en este estudio (Tabla 2). Los pasos críticos para generar datos de la secuencia de buena calidad dependen de la calidad de las bibliotecas de secuenciación generados. La Figura 2 muestra un intervalo de tamaño típico para las bibliotecas de secuenciación generados a partir de ADN microbiano derivado de esputo CF utilizando un procedimiento de fragmentación de ADN basado en enzimática. El tamaño óptimo de la biblioteca depende de la elección de la plataforma de secuenciación y la aplicación, y por lo tanto, el procedimiento de fragmentación puede ser optimizado, si es necesario, a través de enfoques alternativos, tales como sonicación y la nebulización. Además delos resultados representativos presentados, el éxito del método presentado en el esputo CF recogida en múltiples pacientes a través de múltiples puntos de tiempo también se ilustra en Lim et al. (2012) 9 y Lim et al. (2014) 10. Estudios previos 9,10 sugieren que cada paciente alberga un conjunto único de la comunidad microbiana que cambia con el tiempo, lo cual refleja la persistencia de los principales actores de la comunidad, mientras que las fluctuaciones son probablemente debido a perturbaciones tales como los tratamientos con antibióticos. Ya sea que estas fluctuaciones se producen a diario, incluso sin perturbaciones externas o por procedimiento de muestreo y procesamiento de la muestra, se encuentra todavía en cuestión. Basado en el metagenomic-DNA HL y análisis amplicón 16S rDNA, la toma de muestras longitudinal 7-días muestra que la fluctuación diaria de perfiles microbianos sin perturbación antibiótico (Día 1, 2, y 3) fue mínima (Figuras 3A y 3B). Tras la introla producción de antibióticos orales inmediatamente después de la toma de muestras Día 3, los cambios en el perfil de la comunidad se hicieron evidentes en el Día 4. Mientras que el antibiótico ciprofloxacino se dirige a un amplio espectro de patógenos bacterianos conocidos tales como P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus y la neumonía, el tratamiento aumentó la abundancia relativa de P. aeruginosa, mientras que la disminución de la Streptococcus spp. y P. melaninogenica. Para el día 6, la comunidad se recuperó lentamente a la estructura inicial de la comunidad de partida. Los resultados sugieren que las fluctuaciones de los perfiles microbianos dentro de un solo paciente es más probable debido a las perturbaciones de la comunidad en las vías respiratorias. Dada la coherencia entre los perfiles microbianos de las bibliotecas y metagenomes 16S ADNr de ADN derivado de HL, descartamos los sesgos procedentes de los cebadores de 16S rRNA utilizadas en este estudio. Una posible explicación para las diferencias observadas a través de 16S rDNA taxonómicoAL perfiles generados a partir de ADN total y el ADN derivado de HL (Figura 3B) puede ser la presencia de altas cantidades de Pseudomonas spp. ADN extracelular después del tratamiento antibiótico. Esto es apoyado por los hallazgos de que estas diferencias fueron más evidentes en el día 7, tres días después del tratamiento de antibióticos, que se enfoca en Pseudomonas spp. además de otros. El ciprofloxacino se utiliza comúnmente como el tratamiento de primera línea en pacientes con FQ y P. crónica infección aeruginosa aunque su espectro de actividad incluye la mayoría de los patógenos CF-asociado. La hipótesis de que el tratamiento antibiótico erradica comunidades susceptibles incluyendo Streptococcus spp. y por lo tanto la creación de un nicho de llenado por resistentes P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa puede ganar resistencia a través del aumento de sus comunidades de biopelícula y el ADN extracelular se ha demostrado para ser el principal soporte estructural de su arquitectura biofilm 52. A pesar de que tque la estructura comunitaria se recuperó, el ADN extracelular puede haber permanecido en el esputo CF. Por lo tanto, estos datos sugieren que la lisis hipotónica y los pasos de lavado que se presentan en este flujo de trabajo potencialmente beneficiarse en no sólo la eliminación de la ADN humano derivado, pero el ADN extracelular derivado también microbiana-que pueden falsear los perfiles microbianos reales. Metatranscriptomics Una alta calidad metatranscriptome debe contener relativamente pocas secuencias de ARN ribosomal (rRNA) y representan un muestreo imparcial de las transcripciones de la comunidad (ARNm). Debido a la corta vida media y la cantidad limitada de mRNA, es crítico que el protocolo, tal como se presenta aquí, minimiza la manipulación de la muestra para maximizar el número de transcripciones recuperados. En los últimos años, varios enfoques para el agotamiento de rRNA se han desarrollado y adaptado en kits disponibles comercialmente. Estos incluyen Microb Enrich, Ribo-Zero, y muestra específica h sustractivoybridizations 53 que se basan en la hibridación de oligonucleótidos, y el ARNm-ONLY kit que se basa en ARN centrarse en la actividad enzimática que contiene una exonucleasa &#39;monofosfato 5. Además, varios enfoques para enriquecimientos de ARNm tales como el Kit II-bacterias MessageAmp que preferentemente polyadenylates y amplifica ARN lineal están también disponibles. Algunos de estos métodos (por ejemplo, ARNm-ONLY, Microb E xpress y la MessageAmp) se utilizan simultáneamente para una eficiencia óptima. Sin embargo, la eficacia de todos estos enfoques es limitado, especialmente cuando se trabaja con rRNA parcialmente degradada, como a menudo observado en el ARN total extraído de muestras de CF. La amplificación del ARN dependiente de poliadenilación no se puede utilizar para generar metatranscriptomes que consisten tanto en ARNm eucariota y procariota. Además, el poli (A) de cola añaden a las secuencias pueden reduce la cantidad de datos de secuencias útiles. Las regiones con tramos de homopolímero tenderán a tener puntuaciones más bajas de calidad, causing un importante número de lecturas que ser filtrados por secuenciación y software de post-secuenciación, y la duración media de lectura útil tras el recorte de colas de poli (A) se reducirán significativamente 54. Tratar con las comunidades microbianas CF complejas y ARN parcialmente degradado (Figuras 4A y 4C), nuestro estudio anterior mostró que el método de hibridación de captura por el kit de oro Ribo-Zero fue más eficaz en la eliminación de ambos rRNA humana y microbiana en comparación con los tratamientos combinan utilizando otros kits 9 (Tabla 3). Los datos resultantes permite el análisis simultáneo de ambos huésped humano y transcripciones microbianas. Dependiendo del rendimiento y calidad de RNA, así como la elección final de la plataforma de secuenciación, muchos de estos procesos, incluyendo la etapa de síntesis de ADNc, pueden simplificarse con la generación de bibliotecas de secuenciación. Por ejemplo, el ARN tratado Ribo-Zero puede ser utilizado para hacer libra secuenciación metatranscriptomeRies usando el kit de ScriptSeq RNA-Seq Biblioteca Preparación. Análisis de metagenómica de comunidades asociadas a animales proporciona una representación completa de la entidad funcional global que incluye la acogida y sus comunidades asociadas. El flujo de trabajo que aquí se presenta es adaptable a una variedad de muestras asociadas con animales complejos, especialmente aquellos que contienen moco espeso, altas cantidades de restos de células, el ADN extracelular, proteínas y complejos de glicoproteína, así como células huésped, además de la microbiana y viral deseado partículas. A pesar de que las partículas virales y microbianas se pueden perder en cada paso, las partículas de aislamiento y purificación son esenciales para minimizar la cantidad de ADN del huésped. Si bien los datos metagenómica ofrece potenciales metabólicas de las comunidades examinados, metatranscriptomics complementar este revelando la expresión diferencial de funciones codificadas 9. Una evaluación integral de los datos de genómica y transcripciones ha producido nuevas insERECHOS a la dinámica de las interacciones de la comunidad y facilita el desarrollo de la mejora de las terapias 9,10,55.

<html> Comunidades virales y microbianos asociados con el cuerpo humano se han investigado ampliamente en la última década a través de la aplicación de tecnologías de secuenciación de 1,2. Los resultados han llevado al reconocimiento de los microbios importancia en la salud humana y la enfermedad. La principal iniciativa provino del proyecto humano microbioma que describe las bacterias (y algunas arqueas) que reside en la piel humana, y dentro de las cavidades orales, vías respiratorias, tracto urogenital y el tracto gastrointestinal 3. Otros estudios microbioma de las vías respiratorias sanas humanos a través de lavado broncoalveolar (BAL) 4,5 y frotis nasofaríngeos 4 han demostrado que el pulmón puede servir como un dispositivo de muestreo ambiental, resulta en la colonización microbiana transitoria en las vías respiratorias. Sin embargo, el impacto de la colonización microbiana en las superficies de las vías respiratorias con discapacidad puede conducir a infecciones pulmonares graves y crónicas, como las que se observan en la fibrosis quística (FQ) de los pacientes. t &quot;&gt; CF es una enfermedad genética mortal causada por la mutación en la fibrosis quística transmembrana regulador (CFTR) gen 6. Estas mutaciones dan lugar a proteínas CFTR defectuosos que a su vez afectan al transporte transepitelial de iones a través de la superficie apical del epitelio. La enfermedad afecta múltiples sistemas de órganos, pero la mayoría de la mortalidad y la morbilidad es atribuible a la enfermedad pulmonar de la FQ 7. El CF pulmón proporciona un ecosistema único para la colonización microbiana. El defecto en el transporte de iones hace que el moco se acumula en las vías respiratorias CF, creando microambientes que constan de aeróbica , microaerófilas, y los compartimentos anaeróbicos anclado por una superficie mucosa rica en nutrientes estática. Este entorno facilita la colonización y proliferación de microbios, incluyendo virales, bacterias y hongos. agudas y las infecciones microbianas pulmonares crónicas conducen a respuestas inmunes constantes pero ineficaz, dando como resultado amplia remodelación de las vías respiratorias, pérdida de la capacidad pulmonar, y en última instancia pulmofracaso nario. Las comunidades bacterianas asociadas con el pulmón con FQ han sido bien descritos usando ambos enfoques cultura-dependientes e independientes del cultivo, que incluyen el uso de 16S ARN ribosomal (ARNr) de secuenciación de genes 8 y metagenómica escopeta 9,10. El enfoque basado en el rRNA 16S es capaz de caracterizar una amplia gama de especies microbianas y capturar grandes cambios en la diversidad de la comunidad. Sin embargo, está limitado en su resolución en la definición de las comunidades (resumidos en Claesson et al. 2010 11) y las predicciones de los potenciales metabólicos se limitan a aquellas funciones generales conocidos para la taxones identificados. Por lo tanto, los métodos de secuenciación del gen 16S rRNA son insuficientes para la taxonómica y funcional precisión analítica necesaria de las diversas comunidades microbianas presentes en los pulmones con FQ. El enfoque descrito aquí metagenomic complementa el enfoque basado en el rRNA 16S, supera sus limitaciones, y permite una manera relativamente eficazpara analizar tanto la taxonomía comunidad microbiana y contenidos genéticos en los pulmones con FQ. ADN microbiano aislado de muestras asociadas con animales a menudo contiene una gran cantidad de ADN del huésped. Muestras de esputo o tejido pulmonar CF generalmente contienen una gran cantidad de ADN humano liberado por los neutrófilos en la respuesta inmune, a menudo mayor que 99% del ADN total de 12 - 14. Aunque algunas células humanas intactas pueden estar presentes, la mayoría de este ADN es libre en solución o adsorbido a la superficie de los microbios. Además, la presencia de tapones de moco excepcionalmente viscosos, restos celulares y otros contaminantes desconocidos complicar aún más el aislamiento de las células microbianas. Varios métodos se ensayaron para determinar ozono estas muestras de ADN humano, incluyendo gradientes de Percoll a humano separado a partir de células microbianas 15, el tratamiento con DNasa I, monoazida de bromuro de etidio para degradar selectivamente el ADN humano 16, y el kit de MolYsis, todos con éxito limitado.<html> Hasta la fecha, el procedimiento de purificación de ADN microbiano más eficaz para esputo CF ha sido una modificación del procedimiento descrito por Breitenstein et al. (1995) 17. Este enfoque, en este documento conocido como método de lisis hipotónica (HL), utiliza una combinación de β-mercaptoetanol para reducir los enlaces disulfuro de mucina, lisis hipotónica de las células eucariotas, y tratamiento con DNasa I de ADN soluble 9. A pesar de la falta de alternativas al método HL planteó algunas preocupaciones debido a (i) los posibles sesgos resultantes de la lisis no deseado de los microbios y (ii) si las fluctuaciones observadas en la composición de la comunidad 9,10 son un artefacto de variaciones asociadas con el procesamiento de la muestra. Además de la generación de metagenomes de escopeta, que abordar estas cuestiones mediante la comparación de los perfiles de genes 16S rRNA del ADN total y el ADN microbiano extraído de la HL método utilizando el mismo conjunto de muestras de esputo recogidas de un solo paciente a través de siete días consecutivos. ent &quot;&gt; En comparación con las comunidades microbianas, la caracterización de las comunidades virales asociados con los animales es limitada 18,19 Las comunidades virales en las vías respiratorias CF sólo se han caracterizado mínimamente 20 -.. 22 El primer estudio metagenomic caracterizar el ADN de las comunidades virales en CF vías respiratorias mostraron que la mayoría de los virus asociados con los pulmones con FQ son fagos 20. El potencial metabólico del fago en CF y CF individuos no fue significativamente diferente. Específicamente, las comunidades de fagos en individuos CF llevan genes reflectante de adaptaciones huésped bacterianas a la fisiología de las vías respiratorias CF, y la virulencia. 20 estudios de metagenómica posteriores bacterianas de los virus en el tejido pulmonar de la FQ demostraron heterogeneidad espacial distinta de las comunidades virales entre las regiones anatómicas 22. Además, el tejido pulmonar de la FQ albergaba la diversidad viral más bajo observado hasta la fecha en cualquier ecosistema 22. La mayoría de los virus identificados eran fagoscon el potencial de infectar a los patógenos de FQ. Sin embargo, también se detectaron virus eucariotas tales como herpesvirus, adenovirus, y virus del papiloma humano (VPH). En un caso, cuando se observaron quistes en el tejido pulmonar durante la disección, se recuperó más de 99% de un genoma de virus del papiloma humano, a pesar de que el paciente nunca fue diagnosticado con un papiloma o carcinoma pulmonar. Esto indica que la diversidad viral presente no sólo refleja la gravedad del daño tisular, pero también puede exponer y explicar una enfermedad subyacente no caracterizado. Los protocolos descritos aquí proporcionan una manera simple, pero potente para aislar partículas virales (VLP) a partir de muestras que consisten en grandes cantidades de moco espeso, el huésped y células microbianas, ADN libre, así como los restos celulares. Como complemento de la metagenómica, metatranscriptomics se utiliza para controlar la dinámica en la expresión génica a través de la comunidad microbiana y el anfitrión 9,23. En este caso, tanto microbiana y host mRNA necesita ser seleccionado preferentemente. Desde mRNAs bacterianas no se polyadenylated, un método desplegable mRNA a base de oligo-dT no puede ser explotada. La amplificación del ARN dependiente de poliadenilación no se puede utilizar en muestras de acogida asociada si se conocen las muestras para contener grandes cantidades de ARNm eucariota. Muchas muestras asociadas a animales, incluyendo el esputo CF, contienen una alta densidad de células, además de altas cantidades de desechos celulares y nucleasas que incluyen RNasas. Por lo tanto, otro reto es evitar una degradación del ARN durante metatranscriptome procesamiento. En la mayoría de los casos, el ARN total extraído de esputo de FQ es parcialmente degradada, lo que limita las aplicaciones posteriores y utilidad de los ARN derivado. En los últimos años, varios enfoques para el agotamiento de rRNA se han desarrollado y adaptado en kits disponibles comercialmente. La eficacia de estos enfoques se limita, sin embargo, especialmente cuando se trabaja con parcialmente degradado rRNA 9,24. Los métodos empleados aquí permitened para la recuperación de ARN total parcialmente degradado apropiado para la eliminación total de rRNA aguas abajo eficiente. La comparación directa de la eficiencia en la eliminación de rRNA partir de ARN total parcialmente degradado comparar dos kits diferentes fue ilustrado por Lim et al. (2012) 9. En general, el objetivo de este manuscrito es proporcionar un conjunto completo de protocolos (Figura 1) para generar metagenomes escopeta virales y microbianas, y un metatranscriptome, a partir de una sola muestra asociada al animal, utilizando muestras de esputo inducido como un ejemplo. Molecular flujo de trabajo de laboratorio debe incluir áreas de pre y post-amplificación separadas para minimizar la contaminación cruzada. Los métodos son fácilmente adaptables a otros tipos de muestras tales como el tejido 22, nasofaríngeo y orofaríngeas 25, lavado broncoalveolar (BAL) y coral (datos no publicados). Cada muestra debe procesarse inmediatamente después de la recolección, especialmente cuando la metagenómica microbianos y se reunióse desean estudios atranscriptomics. Si se congelaron las muestras, limita el aislamiento de células microbianas intactas para metagenomes microbianas como la congelación potencialmente alterar la integridad celular. Sin embargo, la congelación no excluye metatranscriptomics y aislamiento viral, pero la calidad del ARN y la cantidad de partículas virales recuperados pueden verse afectados por el proceso de congelación y descongelación. Es importante señalar que el esputo inducido ha servido como la fuente primaria de muestras en muchos estudios asociados con los pacientes adultos con FQ y otras enfermedades pulmonares crónicas como 26,27 BAL puede ser demasiado invasiva. En nuestros estudios, las muestras de esputo fueron recogidos con un método de muestreo cuidadoso y consistente, es decir, tras el enjuague bucal y el enjuague de la cavidad bucal usando solución salina estéril para mantener los microbios orales contaminación dentro de las muestras de esputo a un mínimo.

<table><tbody><tr><td>Tampón de lisis de ARN a base de isotiocianato de guanidina</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>TRIzol LS Se utilizó el reactivo en este estudio</td></tr><tr><td>Perlas de sílice; 0,1 a 0,15 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td><td>En este estudio se utilizaron perlas de silicato de circonio</td></tr><tr><td>Ditiotritol, grado molecular (polvo seco)</td><td>Promega</td><td>V3155</td><td>Se puede comprar a cualquier otra empresa</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa estéril; 0,45 y micro; m tamaño de poro membrana hidrofílica de PVDF</td><td>Millipore SLHV033RS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>enzima DNasa I&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa estéril; 0.02 &micro; m tamaño de poro</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>Diámetro: 25 mm</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga ultratransparentes</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 & frac12; pulg. (14 x 90 mm), apto para SW41 Ti Rotor y VLP ultracentrifugación en gradiente de densidad</td></tr><tr><td>SW41 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 rotor de ángulo fijo</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 ADN polimerasa</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&micro; l</td></tr><tr><td>Phi29 Random Hexamer</td><td>Thermo Scientific</td><td>S0181</td><td>Comprado anteriormente a Fidelity Systems Filtro de</td></tr><tr><td>matriz de alúmina con anillo de soporte anular de polipropileno; 0.02 y micro; m tamaño de poro</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-34</td><td>En este estudio se utilizaron membranas de filtro Whatman Anodisc; diámetro 25 mm</td></tr><tr><td>SYBR Tinción de gel de ácido nucleico de oro</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I&nbsp libre de ARNasa;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>Se puede comprar en cualquier otra empresa</td></tr><tr><td>Glucógeno, grado de ARN</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>Se puede comprar en cualquier otra empresa</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de alta velocidad Oak Ridge</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>Para el procedimiento de extracción de ADN de gran volumen, adecuado para el rotor de ángulo fijo SS-34 Kit de</td></tr><tr><td>eliminación total de ARNr</td><td>Epicentre</td><td>MRZE724</td><td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiología) se puede utilizar para acoplar la eliminación de ARNr con la preparación de la biblioteca de secuenciación</td></tr><tr><td>Cloruro de cesio&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de hexadecitrimetil-amonio (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

purificar el impuro: secuenciación metagenomes y metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

La accesibilidad de secuenciación de alto rendimiento ha revolucionado muchos campos de la biología. A fin de comprender mejor a las comunidades microbianas y virales de acogida asociada, se desarrolló un flujo de trabajo integral para la extracción de ADN y ARN. El flujo de trabajo genera simultáneamente metagenomes virales y microbianos, así como metatranscriptomes, desde una sola muestra para la secuenciación de próxima generación. El acoplamiento de estos enfoques ofrece una visión general de las características tanto taxonómicas y las funciones de la comunidad codificado. Los métodos presentados utilizan fibrosis quística (CF) de esputo, un tipo de muestra problemático, porque es excepcionalmente viscosa y contiene alta cantidad de mucinas, el ADN de neutrófilos libre, y otros contaminantes desconocidos. Los protocolos descritos aquí se dirigen a estos problemas y con éxito recuperar ADN viral y microbiano con la contaminación de ADN humana mínima. Para complementar los estudios de metagenómica, un protocolo metatranscriptomics se optimizó para recuperar tanto microbianay ARNm host que contiene relativamente pocas secuencias de ARN ribosomal (ARNr). Una visión general de las características de los datos se presenta a servir de referencia para evaluar el éxito de los métodos. Adicional muestras de esputo CF también se recogieron a (i) evaluar la consistencia de los perfiles microbioma en siete días consecutivos dentro de un mismo paciente, y (ii) comparar la coherencia del enfoque metagenómica a una basada en la secuencia del gen 16S ARN ribosomal. Los resultados mostraron que la fluctuación diaria de perfiles microbianos sin perturbación antibiótico fue mínima y los perfiles de taxonomía de las bacterias asociadas-CF comunes eran muy similares entre las bibliotecas de 16S rDNA y metagenomes generados a partir del ADN -derivado lisis hipotónica (HL). Sin embargo, las diferencias entre los perfiles taxonómicos 16S rDNA generan a partir de ADN total y el ADN derivado de HL sugieren que la lisis hipotónica y los pasos de lavado se benefician en no sólo la eliminación de la ADN humano derivado, sino también extracellul derivados de microbiosADN ar que pueden falsear los perfiles microbianos reales.

Uso de la vía aérea fibrosis quística como un ejemplo, el manuscrito presenta un flujo de trabajo integral que comprende una combinación de enfoques de metagenómica y metatranscriptomic para caracterizar el microbiana y comunidades virales en muestras asociadas con animales.

Purificar el Impuro: Secuenciación metagenomes y Metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

El objetivo general de este procedimiento es recolectar y procesar muestras complejas asociadas al huésped, como el esputo de fibrosis quística, para estudiar las comunidades virales y microbianas utilizando enfoques metagenómicos y metatranscriptómicos. Esto se logra primero haciendo que el sujeto inhale solución salina hipertónica al 7% a través de un nebulizador y luego recolectando muestras de esputo inducido durante un período de tiempo de 30 minutos. A continuación, la muestra se homogeneiza inmediatamente y se distribuye equitativamente en cuatro tubos marcados como metagenoma viral, metagenoma microbiano, metatranscriptoma y esputo extra.A continuación, se sella el tubo del metatranscriptoma, se coloca horizontalmente y se homogeneiza el esputo a velocidad media durante 10 minutos. Finalmente, las alícuotas individuales se procesan por separado para aislar y purificar las células virales o bacterianas antes del aislamiento de ácidos nucleicos para estudios metagenómicos. En última instancia, los ácidos nucleicos aislados se utilizan para la preparación de bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento para generar bibliotecas de metagenómica y metatranscriptómica.La principal ventaja de este procedimiento es que proporciona un flujo de trabajo completo para procesar muestras complejas asociadas al huésped para el estudio de comunidades virales y bacterianas a nivel de ADN y ARN. La demostración visual de este procedimiento es fundamental, ya que los pasos de pretratamiento de la muestra son importantes para garantizar el manejo adecuado de la muestra, mientras que los pasos de purificación de células virales y microbianas son difíciles de aprender Debido a la complejidad del procedimiento. Antes de la recolección de la muestra, etiquete cuatro tubos de 15 mililitros por muestra con lo siguiente, el primero con el metagenoma viral, el segundo como metagenoma microbiano número tres con meta transcriptoma y tubo número cuatro como esputo extra. Agregue dos mililitros de perlas de sílice de 0,1 milímetros en el tubo marcado como meta transcriptoma, seguidos de seis mililitros de tampón de lisis de ARN basado en isotiocianato de guina, o tampón de lisis GITC.Siguiendo el procedimiento de recolección de muestras descrito en el protocolo de texto y utilizando tazas de muestra pre-vadeadas, estime el volumen de la muestra pesando la taza después de la recolección de la muestra y reste el peso de la taza vacía. Para el peso restante, un gramo equivaldrá a un mililitro de muestra. Si el volumen de la muestra es inferior a ocho mililitros, agregue el volumen apropiado de 0,02 micrómetros filtrado un XPBS para elevar el volumen final a ocho mililitros.A continuación, utilice inmediatamente una jeringa de tres mililitros para homogeneizar la muestra hasta que no queden grumos visibles dentro del esputo, utilizando la misma jeringa, extraiga inmediatamente dos mililitros de esputo e inyéctelo en el tubo de microtranscriptoma que contiene perlas de sílice y tampón de lisis GITC. Cierre la tapa y use una película para sellar la tapa de forma segura Para evitar fugas, use un vórtice, señor para homogeneizar inmediatamente el esputo a velocidad media durante 10 minutos. Usando la misma alícuota de jeringa, dos mililitros de esputo en cada uno de los tubos marcados con el metagenoma de los viras y el metagenoma microbiano, y transfieren el esputo restante de la copa de esputo al tubo etiquetado como esputo adicional.Almacene todos los tubos a cuatro grados centígrados o en hielo y transpórtelos al laboratorio si es necesario para generar un metagenoma viral. Después de la preparación de tampones y soluciones. Trate previamente las muestras añadiendo 0,02 micrómetros de tampón de magnesio salino filtrado hasta un volumen total de seis mililitros.Para ayudar en la disolución del moco, agregue seis mililitros de 6.5 milimolares de DTT a cada muestra. Vórtice vigorosamente para mezclar e incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Después de vorexionar vigorosamente, las muestras vuelven a girar a 3056 Gs y 10 grados Celsius durante 15 a 20 minutos.Recoja cada sobrenadante en un nuevo tubo de 15 mililitros. A continuación, utilice un filtro de 45 micrómetros montado en una jeringa para filtrar los sobrenadantes en nuevos tubos de 15 mililitros. Retire 100 microlitros de muestra en un tubo de microfuga y luego realice un tratamiento con cloroformo.Extraiga el sobrenadante y realice un tratamiento con DN. Agregue un volumen igual de 4% de formaldehído para fijar la muestra. Para la microscopía de epifluorescencia, consulte el protocolo de texto para obtener un enfoque general de enriquecimiento de partículas virales.De lo contrario, utilizando soluciones de cloruro de cesio recién preparadas, establezca un gradiente de cloruro de cesio cargando un mililitro de 1,7 gramos por mililitro de solución de cloruro de cesio en cada tubo, seguido de un mililitro de 1,5 gramos por mililitro, un mililitro de un punto 35 gramos por mililitro y, finalmente, un mililitro de 1,2 gramos por mililitro de solución de cloruro de cesio. Finalmente, cargue de seis a ocho mililitros de muestra en tubos de gradiente individuales. Marque las capas individuales para indicar la ubicación de cada fracción.A continuación, equilibre cada par de dos opuestos con una precisión de un miligramo. Bloquee con cuidado cada tubo en el cubo de centrifugado. Cargue en el rotor y la centrífuga a 82, 844 G y cuatro grados centígrados durante dos horas.Después de la centrifugación, retire con cuidado los tubos del soporte sin interrumpir los gradientes de densidad con una aguja de calibre 18 conectada a una jeringa de tres mililitros. Asegúrese de que el extremo abierto de la aguja esté hacia arriba. Perfore el tubo justo debajo de la capa de densidad de 1,5 gramos por mililitro y extraiga lentamente aproximadamente 1,5 mililitros de solución en la jeringa.Retire lentamente la aguja y deje que la fracción restante del tubo gotee en un nuevo tubo de 15 mililitros a través de la punción. Transfiera la solución en la jeringa que contiene el V ps a dos nuevos tubos de micro fuga. Una vez que se hayan preparado los tampones y las soluciones, de acuerdo con el protocolo de texto, agregue cinco volúmenes de punto 22 micrómetros filtrado un XPBS Para diluir cada homogeneizado bajo una cubierta química, agregue etanol beta MAR capta a una concentración final de 2% de volumen a volumen, y agite la mezcla a temperatura ambiente durante dos horas después de la incubación.Gire la muestra a 3056 GS y 10 grados Celsius durante 15 minutos. Después de desechar el sobrenadante, use 10 mililitros de agua de grado molecular para resuspender el pellet e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de repetir el lavado. Después de un último centrifugado, y una vez que se haya descartado la natina de SUP, use cinco mililitros de un tampón XDNA para resuspender el pellet antes de agregar 15 microlitros de ds.Uno por mililitro de muestra Incubar a 37 grados centígrados con mezcla repetida durante dos horas. Después de girar las muestras y desechar el snat, use 10 mililitros de tampón SE para resuspender el pellet. A continuación, gire la muestra y repita el lavado.Utilice dos mililitros de tampón SE para resuspender el pellet y transferir la suspensión a dos tubos de micro fuga. A continuación, haga girar los tubos a 16.000 GS a temperatura ambiente durante 15 minutos. Finalmente, después de eliminar el sobrenadante, use un kit de extracción de ADN genómico siguiendo las instrucciones para bacterias grampositivas.Para aislar el ADN, se resumen aquí los resultados previos para generar metagenomas virales. Los viromes contienen pocas secuencias derivadas de humanos, con solo una muestra que contiene un 70% de muestras de ADN humano CCF cuatro A se omitió en el paso de ultracentrifugación de gradiente de densidad y, como resultado, contenía más del 97% de secuencias derivadas de humanos. Esta figura muestra una imagen fluorescente de una muestra típica de esputo FQ antes y después de la ultracentrifugación en gradiente de densidad.Se observaron vlp claros en ausencia de partículas grandes siguiendo la separación del gradiente de densidad que se observa aquí. Se recolectaron siete muestras diarias de esputo de un solo paciente con fibrosis quística que comenzó a tomar antibióticos orales. Después del tercer día de recolección, el rendimiento total de ADN derivado de la lisis hipotónica o HL recolectado de cada muestra osciló entre 210 nanogramos y más de cinco microgramos de las bibliotecas de secuenciación de Illumina generadas para cada muestra.Todas las bibliotecas, excepto una, produjeron más de 1 millón de secuencias y más del 85% de las secuencias de alta calidad se conservaron tras el preprocesamiento de los datos. Utilizando el software de secuenciación de impresión, la cantidad total de secuencias derivadas de humanos osciló entre el 14% y el 46%Como se muestra aquí, los perfiles microbianos de las submuestras son muy similares a las muestras después de dos tratamientos de lisis hipotónica. Además, la segunda lisis hipotónica aumenta la fracción de secuencias no humanas entre un seis y un 17% dentro de los metagenomas.No olvide que trabajar con muestras clínicas y patógenos potenciales puede ser extremadamente peligroso. El equipo de protección personal siempre debe usarse en todo momento durante la manipulación de la muestra. Se requieren buenas técnicas de biología molecular y microbiología al realizar este procedimiento para garantizar que no haya contaminación.Siguiendo este procedimiento, debería ser capaz de realizar estudios metagenómicos virales y microbianos, así como metatranscriptómicos a partir de muestras complejas como el esputo de FQ.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

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