Purificar el Impuro: Secuenciación metagenomes y Metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras

El objetivo general de este procedimiento es recolectar y procesar muestras complejas asociadas al huésped, como el esputo de fibrosis quística, para estudiar las comunidades virales y microbianas utilizando enfoques metagenómicos y metatranscriptómicos. Esto se logra primero haciendo que el sujeto inhale solución salina hipertónica al 7% a través de un nebulizador y luego recolectando muestras de esputo inducido durante un período de tiempo de 30 minutos. A continuación, la muestra se homogeneiza inmediatamente y se distribuye equitativamente en cuatro tubos marcados como metagenoma viral, metagenoma microbiano, metatranscriptoma y esputo extra.

A continuación, se sella el tubo del metatranscriptoma, se coloca horizontalmente y se homogeneiza el esputo a velocidad media durante 10 minutos. Finalmente, las alícuotas individuales se procesan por separado para aislar y purificar las células virales o bacterianas antes del aislamiento de ácidos nucleicos para estudios metagenómicos. En última instancia, los ácidos nucleicos aislados se utilizan para la preparación de bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento para generar bibliotecas de metagenómica y metatranscriptómica.

La principal ventaja de este procedimiento es que proporciona un flujo de trabajo completo para procesar muestras complejas asociadas al huésped para el estudio de comunidades virales y bacterianas a nivel de ADN y ARN. La demostración visual de este procedimiento es fundamental, ya que los pasos de pretratamiento de la muestra son importantes para garantizar el manejo adecuado de la muestra, mientras que los pasos de purificación de células virales y microbianas son difíciles de aprender Debido a la complejidad del procedimiento. Antes de la recolección de la muestra, etiquete cuatro tubos de 15 mililitros por muestra con lo siguiente, el primero con el metagenoma viral, el segundo como metagenoma microbiano número tres con meta transcriptoma y tubo número cuatro como esputo extra. Agregue dos mililitros de perlas de sílice de 0,1 milímetros en el tubo marcado como meta transcriptoma, seguidos de seis mililitros de tampón de lisis de ARN basado en isotiocianato de guina, o tampón de lisis GITC.

Siguiendo el procedimiento de recolección de muestras descrito en el protocolo de texto y utilizando tazas de muestra pre-vadeadas, estime el volumen de la muestra pesando la taza después de la recolección de la muestra y reste el peso de la taza vacía. Para el peso restante, un gramo equivaldrá a un mililitro de muestra. Si el volumen de la muestra es inferior a ocho mililitros, agregue el volumen apropiado de 0,02 micrómetros filtrado un XPBS para elevar el volumen final a ocho mililitros.

A continuación, utilice inmediatamente una jeringa de tres mililitros para homogeneizar la muestra hasta que no queden grumos visibles dentro del esputo, utilizando la misma jeringa, extraiga inmediatamente dos mililitros de esputo e inyéctelo en el tubo de microtranscriptoma que contiene perlas de sílice y tampón de lisis GITC. Cierre la tapa y use una película para sellar la tapa de forma segura Para evitar fugas, use un vórtice, señor para homogeneizar inmediatamente el esputo a velocidad media durante 10 minutos. Usando la misma alícuota de jeringa, dos mililitros de esputo en cada uno de los tubos marcados con el metagenoma de los viras y el metagenoma microbiano, y transfieren el esputo restante de la copa de esputo al tubo etiquetado como esputo adicional.

Almacene todos los tubos a cuatro grados centígrados o en hielo y transpórtelos al laboratorio si es necesario para generar un metagenoma viral. Después de la preparación de tampones y soluciones. Trate previamente las muestras añadiendo 0,02 micrómetros de tampón de magnesio salino filtrado hasta un volumen total de seis mililitros.

Para ayudar en la disolución del moco, agregue seis mililitros de 6.5 milimolares de DTT a cada muestra. Vórtice vigorosamente para mezclar e incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Después de vorexionar vigorosamente, las muestras vuelven a girar a 3056 Gs y 10 grados Celsius durante 15 a 20 minutos.

Recoja cada sobrenadante en un nuevo tubo de 15 mililitros. A continuación, utilice un filtro de 45 micrómetros montado en una jeringa para filtrar los sobrenadantes en nuevos tubos de 15 mililitros. Retire 100 microlitros de muestra en un tubo de microfuga y luego realice un tratamiento con cloroformo.

Extraiga el sobrenadante y realice un tratamiento con DN. Agregue un volumen igual de 4% de formaldehído para fijar la muestra. Para la microscopía de epifluorescencia, consulte el protocolo de texto para obtener un enfoque general de enriquecimiento de partículas virales.

De lo contrario, utilizando soluciones de cloruro de cesio recién preparadas, establezca un gradiente de cloruro de cesio cargando un mililitro de 1,7 gramos por mililitro de solución de cloruro de cesio en cada tubo, seguido de un mililitro de 1,5 gramos por mililitro, un mililitro de un punto 35 gramos por mililitro y, finalmente, un mililitro de 1,2 gramos por mililitro de solución de cloruro de cesio. Finalmente, cargue de seis a ocho mililitros de muestra en tubos de gradiente individuales. Marque las capas individuales para indicar la ubicación de cada fracción.

A continuación, equilibre cada par de dos opuestos con una precisión de un miligramo. Bloquee con cuidado cada tubo en el cubo de centrifugado. Cargue en el rotor y la centrífuga a 82, 844 G y cuatro grados centígrados durante dos horas.

Después de la centrifugación, retire con cuidado los tubos del soporte sin interrumpir los gradientes de densidad con una aguja de calibre 18 conectada a una jeringa de tres mililitros. Asegúrese de que el extremo abierto de la aguja esté hacia arriba. Perfore el tubo justo debajo de la capa de densidad de 1,5 gramos por mililitro y extraiga lentamente aproximadamente 1,5 mililitros de solución en la jeringa.

Retire lentamente la aguja y deje que la fracción restante del tubo gotee en un nuevo tubo de 15 mililitros a través de la punción. Transfiera la solución en la jeringa que contiene el V ps a dos nuevos tubos de micro fuga. Una vez que se hayan preparado los tampones y las soluciones, de acuerdo con el protocolo de texto, agregue cinco volúmenes de punto 22 micrómetros filtrado un XPBS Para diluir cada homogeneizado bajo una cubierta química, agregue etanol beta MAR capta a una concentración final de 2% de volumen a volumen, y agite la mezcla a temperatura ambiente durante dos horas después de la incubación.

Gire la muestra a 3056 GS y 10 grados Celsius durante 15 minutos. Después de desechar el sobrenadante, use 10 mililitros de agua de grado molecular para resuspender el pellet e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de repetir el lavado. Después de un último centrifugado, y una vez que se haya descartado la natina de SUP, use cinco mililitros de un tampón XDNA para resuspender el pellet antes de agregar 15 microlitros de ds.

Uno por mililitro de muestra Incubar a 37 grados centígrados con mezcla repetida durante dos horas. Después de girar las muestras y desechar el snat, use 10 mililitros de tampón SE para resuspender el pellet. A continuación, gire la muestra y repita el lavado.

Utilice dos mililitros de tampón SE para resuspender el pellet y transferir la suspensión a dos tubos de micro fuga. A continuación, haga girar los tubos a 16.000 GS a temperatura ambiente durante 15 minutos. Finalmente, después de eliminar el sobrenadante, use un kit de extracción de ADN genómico siguiendo las instrucciones para bacterias grampositivas.

Para aislar el ADN, se resumen aquí los resultados previos para generar metagenomas virales. Los viromes contienen pocas secuencias derivadas de humanos, con solo una muestra que contiene un 70% de muestras de ADN humano CCF cuatro A se omitió en el paso de ultracentrifugación de gradiente de densidad y, como resultado, contenía más del 97% de secuencias derivadas de humanos. Esta figura muestra una imagen fluorescente de una muestra típica de esputo FQ antes y después de la ultracentrifugación en gradiente de densidad.

Se observaron vlp claros en ausencia de partículas grandes siguiendo la separación del gradiente de densidad que se observa aquí. Se recolectaron siete muestras diarias de esputo de un solo paciente con fibrosis quística que comenzó a tomar antibióticos orales. Después del tercer día de recolección, el rendimiento total de ADN derivado de la lisis hipotónica o HL recolectado de cada muestra osciló entre 210 nanogramos y más de cinco microgramos de las bibliotecas de secuenciación de Illumina generadas para cada muestra.

Todas las bibliotecas, excepto una, produjeron más de 1 millón de secuencias y más del 85% de las secuencias de alta calidad se conservaron tras el preprocesamiento de los datos. Utilizando el software de secuenciación de impresión, la cantidad total de secuencias derivadas de humanos osciló entre el 14% y el 46%Como se muestra aquí, los perfiles microbianos de las submuestras son muy similares a las muestras después de dos tratamientos de lisis hipotónica. Además, la segunda lisis hipotónica aumenta la fracción de secuencias no humanas entre un seis y un 17% dentro de los metagenomas.

No olvide que trabajar con muestras clínicas y patógenos potenciales puede ser extremadamente peligroso. El equipo de protección personal siempre debe usarse en todo momento durante la manipulación de la muestra. Se requieren buenas técnicas de biología molecular y microbiología al realizar este procedimiento para garantizar que no haya contaminación.

Siguiendo este procedimiento, debería ser capaz de realizar estudios metagenómicos virales y microbianos, así como metatranscriptómicos a partir de muestras complejas como el esputo de FQ.