Name: Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para En Vivo Imagen Óptico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprende a preparar liposomas activables con fluoróforos encapsulados en infrarrojo cercano para imagen óptica in vivo de procesos inflamatorios con alta sensibilidad.

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Esta labor fue apoyada por las subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 y RU-1652 / 1-1. Agradecemos Doreen mayo de asistencia técnica excelente y la compañía Dyomics GmbH, Jena por su amable apoyo.

NOTA: Todos los procedimientos son aprobados por el comité regional de los animales y de acuerdo con las directrices internacionales sobre el uso ético de los animales. 1. Preparación de los materiales e instrumentos <ol><li> Preparación de la dispersión de vesículas formada espontáneamente (SFV) <ol><li> Disolver y preparar soluciones madre de las siguientes fosfolípidos: 214 mg / ml de fosfatidilcolina de huevo (EPC), 134 mg / ml de colesterol, 122 mg / ml de 1,2-distearoyl- sn -glicero-3-phosphoethanolamine- N - [metoxi (polietileno glicol) -2000] (sal de amonio) (mPEG 2000 DSPE) y 2 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 il) (sal de amonio) (NBD-DOPE) en cloroformo y guardar en frascos de vidrio. </li><li> Proporcionar aproximadamente 3 ml de cloroformo en un matraz de fondo redondo y transferir el volumen apropiado de solución madre de fosfolípidos en el matraz de fondo redondo para preparar liposomas compuestos de EPC: Chol: mPEG 2000 DSPE en una relación molar de 6,5: 3: 0,5. Para el marcaje doble fluorescencia de los liposomas añadir 0,3% en moles NBD-DOPE a la solución de los lípidos. </li><li> Evaporar el cloroformo de la solución de fosfolípido orgánico bajo presión reducida (300 mbar) a 55 ° C usando un evaporador rotatorio. </li><li> Después se forma una película homogénea de fosfolípidos, reducir la presión a 10 mbar durante 1-2 horas para eliminar el depósito de cloroformo residual. </li><li> Mientras que el cloroformo se evapora, se disuelve DY-676-COOH (6,181 M) en 10 mM de tampón Tris pH 7,4 y llenar un recipiente Dewar con nitrógeno líquido. Encienda un baño de ultrasonidos y se fijará en 50 ° C. </li><li> Transferir un volumen apropiado (0,5-1 ml) de solución al matraz de fondo redondo para hidratar la película de fosfolípidos seco y agitar vigorosamente hasta que una vesícula formada espontáneamente (SFV) formas de dispersión DY-676-COOH (6,181 M). Asegúrese de que todos los fosfolípidos se dispersan para evitar la pérdida de lípidos. </li><li> Cuidadosamente transfer el matraz de fondo redondo que contiene la dispersión SFV en nitrógeno líquido y congelar la dispersión durante 3-5 min. Colocar el matraz de fondo redondo en un baño de ultrasonidos a 50 ° C para descongelar la dispersión luego agite la dispersión vigorosamente durante 1-2 minutos. Repita este procedimiento seis veces, haciendo un total de siete ciclos de congelación y descongelación. </li></ol></li><li> Extrusión de SFV para formar vesículas de liposomas homogéneos <ol><li> Transferir la dispersión de SFV en un 1 ml jeringa (jeringa a) y extruir la dispersión a través de una membrana de policarbonato de 100 nm utilizando un extrusor de LiposoFast básica en la jeringa-b. </li><li> Extruir la dispersión de la jeringa-b, de nuevo en una jeringa, y luego repetir el ciclo de diez veces. Debido a la extrusión, la solución en los cambios de jeringa de un aspecto turbio a una dispersión clara con el tiempo. Después de diez ciclos (veinte pasos de extrusión individuales) retire la jeringa-b del dispositivo y extruir la dispersión por última vez desde una jeringa directamente en una estéril1,5 ml tubo de reacción. </li></ol></li><li> Purificación de encapsulado liposomal DY-676-COOH de colorante libre <ol><li> Preparar una columna de cromatografía de gel utilizando cuentas G25 empapados en 10 mM Tris pH 7,4 (columna de longitud 28 cm, diámetro 0,8 cm). </li><li> Transferir 0,5 ml de dispersión vesicular extruido sobre la cama de gel y dejar que el drenaje de la muestra en la matriz de gel. </li><li> La elución de los liposomas con 10 mM tampón Tris pH 7,4 (Figura 1A) y se lava la columna hasta los drenajes colorante libre completamente fuera de la columna. Si es necesario, recoger y reciclar el tinte libre por la desalación y la deshidratación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Concentrar los liposomas eluidas por ultracentrifugación (200.000 xg, 2 horas a 8 ° C) a continuación, dispersarlos en el volumen adecuado de pH estéril 10 mM de tampón Tris, 7,4. </li></ol></li><li> La cuantificación de la concentración de encapsulado DY-676-COOH <ol><li> Preparar una curva de calibración mediante la disolución de DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) en 10 mM de tampón Tris, pH 7,4 que contiene 0,1% de Triton X100. </li><li> Disolver 2 l (100 nmol final de lípidos de un / L de stock 50 mmol) de los liposomas durante 5 min a temperatura ambiente en 100 l de tampón Tris que contiene 1% de Triton X100 para destruir las vesículas y suelte el colorante encapsulado. Luego diluir las muestras con 10 mM de tampón Tris, pH 7,4 a una concentración final de Triton-X100 de 0,1% (v / v) hacer un volumen total de 1 ml. Preparar todas las muestras por duplicado. </li><li> Medir la absorción y emisión de todas las muestras (gratis DY-676-COOH y Triton-X100 tratada liposomas) a una excitación λ = 645 nm y una emisión λ = 700 nm. Establecer y utilizar una curva de calibración del tinte libre de determinar la concentración de colorante encapsulado. </li></ol></li><li> Caracterización de liposomas <ol><li> Determinar el tamaño y el potencial zeta de los liposomas mediante dispersión de luz dinámica. Diluir las muestras de liposomas con filtro esterilizado (0,2 micras) tampón 10 mM Tris pH 7,4 a aconcentración de 100-300 micras (lípidos). Transferir las muestras diluidas en una cubeta desechable de bajo volumen y medir la muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Caracterizar los liposomas por microscopía electrónica para sustanciar el tamaño, la integridad y la homogeneidad de las vesículas liposomales de acuerdo con protocolos estándar. </li></ol></li></ol> 2. Validación de fluorescencia de enfriamiento rápido y activación de los liposomas preparados <ol><li> Análisis físico-químico de extinción de la fluorescencia y la activación <ol><li> Prepare dos tubos de 1,5 ml para el Lip-Q y 2 tubos para la libre DY-676-COOH. Transferencia de 100 nmol de lípidos totales (2,38 l de una solución / L Lip-Q Stock 42 mmol, que contienen 138 mg / ml del encapsulado DY-676-COOH) en los tubos correspondientes. Traslado gratuito DY-676-COOH equivalente al contenido de colorante de Lip-Q (0,38 g que se traduce, por ejemplo, de 138 g / l 1,000 x 2,38 l Lip-Q se utiliza). Incubar una bañerae de cada sonda a 4 ° C y congelar el segundo tubo a -80 ° C durante la noche (16 hr). </li><li> Calentar un bloque de calentamiento a 30 ° C. Llenar una caja de enfriamiento con hielo triturado y equilibrar una alícuota de tampón Tris 10 mM pH 7,4 a temperatura ambiente. </li><li> Retire las sondas de 4 ° C y se equilibren a temperatura ambiente (envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la luz) y rápidamente descongelar sondas de -80 ° C a 30 ° C durante 5 min. Enfríe las sondas descongelados en hielo durante 1 minuto antes de transferirlos a la temperatura ambiente (también envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la luz). </li><li> Añadir 10 mM de tampón Tris (pH 7,4) a cada una de las sondas a 100 l de volumen final y equilibrar todas las sondas a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Pipetear 80 l de cada sonda en una cubeta de vidrio de bajo volumen y medir la absorción de cada sonda 400 a 900 nm en un espectrómetro. Devuelva la sonda a sus correspondientes tubos. </li><li> Transferir 80 l de cada sonda en una cubeta de vidrio adecuadoy medir la emisión de fluorescencia en un espectrofluorómetro por emocionantes las sondas a 674 nm y midiendo la fluorescencia de 694 a 800 nm. </li></ol></li><li> La captación celular y la activación de fluorescencia <ol><li> Obtener y la cultura las siguientes líneas de células en su medio de cultivo correspondiente de acuerdo con condiciones estándar (37 ° C, 5% de CO 2 y el 95% atmósfera húmeda). Aquí, utilice el J774A.1 murino línea celular de macrófagos (modificado de Dulbecco medio de Eagle suplementado con 10% (v / v) de suero de ternera fetal), la línea celular de glioblastoma humano, U-118 mg (MEM que contiene vitaminas esenciales y 10% (v / v) de suero de ternera fetal) y la línea celular de fibrosarcoma humano, HT-1080 (RPMI con 5% de FCS). </li><li> Escudo de 8 pocillos cámara de diapositivas con poli-L-lisina (añada 100 l 0,001% de poli-L-lisina a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 10 minutos. Aspirar solución y deje que los portaobjetos de cámara se sequen durante al menos 4 hr a RT sobre un banco de trabajo estéril. Enjuague los portaobjetos de cámara 3veces con solución salina tamponada con 200 l de Hank luego sellar con parafina y papel de aluminio y se almacena a 4 ° C hasta que sea necesario. </li><li> Mientras que los portaobjetos de cámara están secando, filtro-esterilizar los liposomas y solución de colorante y se almacena a 4 ° C hasta que sea necesario. </li><li> Para el análisis de la absorción de la sonda con todo el cuerpo vivo sistema de imágenes de fluorescencia en NIR, preparar 5 matraces de cultivo pequeños para cada una de las 3 líneas celulares de ensayo (15 frascos en total). Seed 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg y células HT-1080 por matraz de cultivo con 5 ml de medio de cultivo respectivo (en quintuplica) y crecen durante 16-24 h. Paralelo a los frascos de cultivo, sembrar 30.000 células de cada línea celular (J774A.1 y HT-1080) o 20.000 células (T-118 mg) a 2 pocillos de la diapositiva cámara respectivamente y crecer en un medio de cultivo de 500 l de 16 a 24 h . </li><li> Al día siguiente, añadir 100 nmol (importe final de lípidos) de Lip-Q para 2 frascos por línea celular y a un pocillo de cada línea celular en la diapositiva cámara.Inmediatamente transferir matraz de 1 por cada línea celular a 4 ° C y el segundo matraz de nuevo a la incubadora. NOTA: El volumen de las sondas añadió a los matraces y los portaobjetos de cámara son los mismos, haciendo que la concentración en la cámara de diapositivas 10 veces mayor (5 ml es 500 l de medio de cultivo). Esto es necesario porque la detección microscópica es menos sensible que el sistema de imágenes de fluorescencia NIR donde se crean imágenes de sedimentos celulares de los matraces. </li><li> Añadir la libre DY-676-COOH en una concentración equivalente al contenido de colorante de Lip-Q a las células en 2 matraces por línea celular y a un pocillo de cada línea celular en el portaobjetos de cámara, a continuación, transferir inmediatamente matraz de 1 por línea celular a 4 ° C (agotamiento de la energía) y el otro matraz junto con la corredera cámara posterior a la incubadora. Incubar todas las células durante 24 horas a las condiciones correspondientes. Las células en el matraz sin sonda servir como control sin tratar. </li></ol></li><li> NIRF imágenes y análisis semi-cuantitativo <ol><li> Después de 24 horas de duración de la incubación, recoger las células en frascos lavando las células 2 veces con solución salina tamponada Hanks (HBSS) luego raspar las células en 500 l HBSS y precipitado mediante centrifugación (5 min a 200 x g) en 500 tubos mL. </li><li> Colocar los tubos con los gránulos de las células (y HBSS) en una cámara NIRF y de imágenes utilizando filtros de excitación (615-665 nm) y emisión (corte de&gt; 700 nm). </li><li> Deducir la autofluorescencia y evaluar la intensidad de la diana frente autofluorescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto dará a los niveles semi-cuantitativos de la intensidad de fluorescencia como media de la señal (recuentos de escalado / seg), que representa los niveles de recuento después de la escala de tiempo de exposición, ganancia de la cámara, binning y la profundidad de bits, de modo que las mediciones son comparables entre sí. </li></ol></li><li> Análisis microscópico confocal <ol><li> Después de 24 horas de incubación, recoger las células en la cámara de diapositivas mediante lavado 2 veces con 500 l HBSS. </li><li> Fijar la ceLLS con 200 l de HBSS que contiene 3,7% (v / v) de formaldehído durante 30 min a TA. </li><li> Mientras que la fijación está pasando, diluir la mancha de ADN, Hoechst-33258 1:50 con solución de montaje. </li><li> Después de la fijación, se lavan las células 2 veces con HBSS luego se separan las cámaras de los portaobjetos de vidrio. Añadir solución de montaje 50 l que contiene el ADN de mancha en cada lugar correspondiente a los pocillos de los portaobjetos de cámara. Cubra las células con cubreobjetos de vidrio, sellar los bordes con esmalte de uñas transparente y durante 10 minutos de secado al aire a temperatura ambiente (oscuro). </li><li> Células de imagen en un microscopio de fluorescencia adecuado o un microscopio confocal. Utilice los siguientes parámetros de excitación y emisión para la visualización de los componentes correspondientes: núcleos (Hoechst-33258: excitación 405 nm, emisión 420-480 nm). NBD-DOPE (liposomal de lípido: excitación 488 nm, emisión 530 nm). DY-676-COOH (NIR tinte fluorescente: excitación 633-645 nm, emisión 650-700 nm). NOTA: Asegúrese de que el microscopio de fluorescencia unvailable está equipado con filtros adecuados que permiten la excitación y emisión de longitudes de onda superiores a 630 nm. </li></ol></li></ol> 3. liposomas basados ​​en fluorescencia in vivo Imaging de Inflamación <ol><li> Preparación de los animales y materiales <ol><li> Casa 8-12 semanas de edad, los ratones NMRI macho que pesaban aproximadamente 36 g en condiciones estándar con comida y agua ad libitum. </li><li> Siete días antes del inicio de los experimentos, dar a todos los ratones una dieta baja feofórbido a fin de reducir la autofluorescencia del tejido. </li><li> Veinticuatro horas antes del comienzo de cada experimento, los ratones afeitarse en el área deseada (por ejemplo, zona de la espalda todo si se desea obtención de imágenes de edema pata trasera). </li><li> Pesar los animales y calcular la cantidad de sonda para ser inyectada por ratón (Lip-Q y Lip-dQ a 10 mol (concentración de lípidos) por kg de peso y libre DY-676-COOH (equivalente a teñir contenido de Lip-Q utiliza) . </li><li> Imagen de los animalesun cuerpo entero NIR de fluorescencia de imágenes con los mismos ajustes utilizados para los sedimentos celulares. Esta medida ofrece la autofluorescencia de los animales. </li><li> Disolver 10 mg zymosan A en 1 ml de solución salina isotónica y almacenar durante la noche a 4 ° C. </li></ol></li><li> La inducción de la inflamación y la formación de imágenes in vivo NIRF <ol><li> Preparar 3 jeringas por ratón que contienen las siguientes soluciones. Llene una jeringa con 50 l zymosan Una solución (10 mg / ml) y la segunda jeringa con 50 l de solución salina isotónica. Llene la tercera jeringa con las sondas, por el que Lip-Lip-Q y dQ (10 mmol / kg de peso (lípido)) están designados para animales de prueba y gratis DY-676-COOH (concentración que en Lip-Q) para los animales de control. Asegúrese de que las sondas se diluyeron con HBSS estéril a 150 l de volumen final. </li><li> Aplicar crema para los ojos en los ojos de los animales para evitar la sequedad y anestesiar a los animales con un 2% de isoflurano hasta que están profundamente dormidos y no reaccionan cuando se toca en las patas (esto toma alrededor de 2 minutos). </li><li> Coloque el ratón sobre una estera caliente (todavía bajo anestesia) e inyectar el zymosan-A por vía subcutánea solución en la pata trasera derecha y la solución salina en la pata trasera izquierda. Inyectar inmediatamente la sonda intravenosa y la imagen del animal a partir de entonces a continuación, un tiempo récord de inyección / medición (como t = 0 h). Guarde las imágenes resultantes como cubos de imagen y repita los pasos anteriores para el resto de los animales y de las respectivas sondas. </li><li> Imagen de los animales cada 2 h después de la inyección de 10 horas ya las 24 horas después de la inyección, asegurándose de que la etapa de la cámara de medición está caliente (por ejemplo, mediante la colocación de una alfombra cálida debajo), con el fin de evitar la hipotermia. Después de cada medición, colocar los animales en una jaula con comida y agua ad libitum y colocar la jaula en una cámara de animales templado. La eutanasia a los animales por primera anestesiante con isoflurano al 2% hasta los animales ya no reaccionan al tacto, a continuación, la eutanasia con dióxido de carbono durante 5-10 minutos, lo que haceasegurarse de que los animales dejan de respirar por completo y el rigor mortis se produce. </li><li> Diseccionar los ratones de acuerdo con protocolos estándar, que pueden ser evaluados en línea (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) y la imagen de los órganos. </li><li> Evaluar los resultados de medición de acuerdo con las instrucciones del fabricante por primera deducción de la fluorescencia general de los animales (desmezcla), entonces las regiones asignación de interés para la autofluorescencia (de izquierda pata trasera con solución salina) y el objetivo de fluorescencia del área inflamada (pata trasera derecha con zymosan-A). </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desde liposomas también pueden servir como sistemas de liberación para los tintes fluorescentes, que permiten imágenes de las enfermedades diana. La encapsulación de altas concentraciones de colorantes fluorescentes tales como el colorante NIRF, DY676-COOH se utiliza aquí, conduce a un alto nivel de extinción de fluorescencia del colorante atrapado. Extinción de fluorescencia, un fenómeno visto con muchos fluoróforos en alta concentración puede ser explotado en varias aplicaciones de imagen en vivo, donde se ex...

Los liposomas se han investigado intensamente y servir como uno de los sistemas de administración de fármacos biomédicos más biocompatibles para aplicaciones clínicas 1,2. Ellos se componen principalmente de fosfolípidos y colesterol, ambos de los cuales son compuestos biocompatibles que imitan partes de las membranas celulares naturales. Considerando que las sustancias hidrófilas pueden ser atrapados en el interior acuoso, agentes lipófilos pueden incorporarse dentro de la bicapa fosfolipídica liposomal 3. La encapsulación de sustancias dentro del interior acuoso de los liposomas otorga protección contra la degradación in vivo y también evita que el sistema anfitrión de los efectos tóxicos de los fármacos citotóxicos utilizados para la terapia de enfermedades, por ejemplo agentes quimioterapéuticos destinados a destruir las células tumorales. La modificación de la superficie liposomal con polímeros como el polietilenglicol (PEGilación) se extiende aún más el tiempo de circulación de la sangre liposomal in vivo debido a la estabilización estérica 4. Moreover, los liposomas pueden secuestrar altas concentraciones de varias sustancias como proteínas 5,6, sustancias hidrófilas 7,8 y enzimas 9. Por lo tanto, sirven como herramientas terapéuticas y de diagnóstico clínico como fiables que merecen su aprobación para la entrega de fármacos citotóxicos tales como doxorrubicina para la terapia del cáncer 4. Debido a su flexibilidad, los liposomas también se pueden cargar con fluorocromos para fines de diagnóstico y quirúrgicos guiados por imagen. Imágenes de fluorescencia proporciona una solución rentable y no invasiva herramienta de diagnóstico in vivo que, sin embargo, exige algunos requisitos básicos en. Se pudo demostrar que fluorocromos que se adaptan mejor para formación de imágenes in vivo tienen una absorción característica y máximos de emisión en el rango donde dispersión de la luz y la dispersión, así como la autofluorescencia de tejidos de origen del agua y de la hemoglobina es baja. Por lo tanto, dichas sondas tienen sus máximos de abs / em entre 650 y 900 nm 10.<html> Además de esto, la estabilidad de los fluorocromos tanto in vitro como in vivo es crítica, como la opsonización y eliminación rápida pueden limitar en gran medida su aplicación para las imágenes in vivo 11. Otros efectos como la mala estabilidad y baja sensibilidad o efectos citotóxicos en órganos diana como se ha visto con el verde de indocianina (ICG) 12-16, son no deseados y deben tenerse en cuenta al diseñar sondas para imágenes in vivo. Estas observaciones han conducido al desarrollo activo de varios fluorocromos NIR preclínicos, nanopartículas, así como nuevas técnicas para la formación de imágenes in vivo de procesos inflamatorios, cáncer y para la cirugía guiada por imagen 17-20. A pesar de la estabilidad de la mayoría (fluorescencia del infrarrojo cercano) NIRF preclínica colorantes in vitro, su rápida perfusión y el aclaramiento a través del hígado y el riñón impiden su uso en la formación de imágenes ópticas in vivo de enfermedades y procesos inflamatorios. ntent &quot;&gt; Por lo tanto, presenta un protocolo para la encapsulación de fluorocromos como el bien caracterizado en el infrarrojo cercano tinte fluorescente DY-676-COOH, conocido por su tendencia a la auto-interferencia a concentraciones relativamente altas 21 en liposomas. En altas concentraciones H- la formación de dímero y / o pi-interacciones de apilamiento entre las moléculas fluoróforo situadas dentro de resultado de cada uno radio de Förster en Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre las moléculas de fluorocromo. A baja concentración el espacio entre las moléculas de fluoróforo se incrementa, impidiendo de este modo la interacción pi-apilado y -H formación de dímero y resultando en una alta emisión de fluorescencia. El interruptor entre alta y baja concentración y la extinción de la fluorescencia que acompaña y la activación es una estrategia prometedora que puede ser explotado para la formación de imágenes ópticas 22. A este respecto, la encapsulación de altas concentraciones del colorante NIRF DY-676-COOH en el interior acuoso de los liposomas es más favorable para formación de imágenes in vivo que el colorante libre. El desafío del método radica en primer lugar en la encapsulación correcta y en segundo lugar, en la validación de los beneficios resultantes de la encapsulación de altas concentraciones de colorante. La comparación de las propiedades de formación de imágenes de liposomas se inactivó con la del colorante libre y también con una formulación no liposómica se inactivó con bajas concentraciones del colorante es indispensable. Mostramos por un protocolo de hidratación de película y extrusión simple, pero muy eficaz combinado con congelación y descongelación ciclos alternos que la encapsulación de las concentraciones de extinción de DY-676-COOH en liposomas es factible. Otros métodos utilizados para preparar liposomas, tales como el método de evaporación de fase inversa 23, así como el método de inyección de etanol 24 permiten preparación de liposomas con altas eficiencias de encapsulación para muchas sustancias hidrófilas. Sin embargo, la naturaleza de la sustancia a encapsular puede influir en la eficiencia de encapsulación. En efecto,el protocolo de hidratación de película y extrusión que aquí se presenta reveló la más alta eficiencia de encapsulación de DY-676-COOH. Para ilustrar los beneficios de la encapsulación liposomal de DY-676-COOH, un modelo de edema inducido por zymosan, que permite el estudio de los procesos inflamatorios dentro de unas pocas horas, fue utilizado. Aquí, se demuestra que los liposomas con altas concentraciones del encapsulado DY-676-COOH son más adecuados para todo el cuerpo en imágenes ópticas vivo de los procesos inflamatorios que el colorante libre o la formulación liposomal no se inactivó con bajas concentraciones de colorante. Así, el protocolo subyacente proporciona un método sencillo y rápido para producir liposomas fluorescentes Templado y la validación de su potencial de activación y de formación de imágenes tanto in vitro como in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiales y equipos para la preparación de liposomas</huevo fuerte</td></tr><tr><td>>fosfatidilcolina</td><td>Avanti Lípidos Polares 840051P</td><td></td><td>Disolver en cloroformo y almacenar en viales de vidrio (214 mg/ml)</td></tr><tr><td>colesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>Disolver en cloroformo y almacenar en viales de vidrio (134 mg/ml)</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880120P</td><td>Disolver en cloroformo y almacenar en viales de vidrio (122 mg/ml)</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-il) (sal de amonio)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810145P</td><td>Disolver en cloroformo y almacenar en viales de vidrio (2 mg/ml)</td></tr><tr><td>Sartorius MC1 (d = 0,01 mg)</td><td>Sartorius AG</td><td>Research RC 210 P</td><td>utilizado para pesar los fosfolípidos</td></tr><tr><td>Rotavapor</td><td>B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>R-114</td><td>utilizado para la hidratación de la película de fosfolípidos</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>R-481</td><td>utilizado para la hidratación de la película de fosfolípidos</td></tr><tr><td>Vacuum Controller</td><td>B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>B-720</td><td>utilizado para la hidratación de la película de fosfolípidos</td></tr><tr><td>Vacobox</td><td>B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>B-177</td><td>utilizado para la hidratación de la película de fosfolípidos</td></tr><tr><td>Enfriador de circulación</td><td>LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG</td><td>WKL 230</td><td>utilizado para la hidratación de la película de fosfolípidos</td></tr><tr><td>DY-676-COOH</td><td>Dyomics GmbH</td><td>676-00</td><td>Disolver en 10 mM Tris y almacenar existencias a -20°C; C</td></tr><tr><td>Tris-(hidroximetil)-aminometano</td><td>Applichem</td><td>A1086</td><td>tampón 10 mM, pH 7,4</td></tr><tr><td>triclormetano</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>Y015.2</td><td>utilizado para la preparación de liposomas</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Merck Eurolab GmbH</td><td>USR 170 H</td><td>utilizado para la preparación de liposomas</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-0256</td><td>utilizado para la preparación de liposomas</td></tr><tr><td>Sephadex G25 medio&nbsp;</td><td>GE Healthcare Europe GmbH</td><td>17-0033-01</td><td>utilizado para la purificación de liposomas</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Ferak Berlin GmbH</td><td>505002</td><td>utiliza para la destrucción de liposomas&nbsp; para la cuantificación de colorantes</td></tr><tr><td>LiposoFast-Basic</td><td>Avestin Inc.</td><td></td><td>utilizado para la extrusión de liposomas Membrana filtrante de</td></tr><tr><td>policarbonato, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)</td><td>VWR</td><td></td><td>utilizado para la extrusión de liposomas a través de LiposoFast-Basic</td></tr><tr><td>Fluostar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>utilizado para la cuantificación de colorantes</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td></td><td>utilizado para la determinación del tamaño de los liposomas y el zetapotencial</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga&nbsp;</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>XL 80</td><td>utilizado para la concentración de las muestras</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>SW 55 TI</td><td>utilizado para la concentración de las muestras</td></tr><tr><td colspan="4">Materiales y equipos para la evaluación de liposomas e imágenes ópticas</td></tr><tr><td>Zymosan-A de Saccharomyces cereviciae</td><td>Sigma</td><td>Z4250-250MG</td><td>utilizado para la inducción de la inflamación</td></tr><tr><td>Solución salina isotónica (0,9%)</td><td>Fresenius GmbH</td><td>PZN-2159621</td><td>utilizada para la dilución de Zymosan-A</td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>Ohmeda Isotec 4</td><td></td><td>utilizado para anestesiar animales</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Actavis GmbH&nbsp;</td><td>PZN-7253744</td><td>anestesia</td></tr><tr><td>Thermo Mat Pro 20 W</td><td>Lucky Reptile</td><td>61202-HTP-20</td><td>utilizado para mantener calientes a los animales durante la anestesia</td></tr><tr><td>Omnican-F (inyección de 1 ml)&nbsp;</td><td>Braun</td><td>PZN-3115465</td><td>utilizado para la aplicación subcutánea e intravenosa de sondas Crema para</td></tr><tr><td>ojos con pantenol</td><td>Jenapharm</td><td>PZN-3524531</td><td>utilizada para prevenir la sequedad de los ojos de los animales durante la anestesia</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada Hanks</td><td>PAA Laboratories /Biochrom AG</td><td>L2045</td><td>sin Mg2+, Ca2+ y rojo fenol. Para la dilución de sondas y para el lavado de células</td></tr>, <tr><td>los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos</td><td>BD Biosciences</td><td>354108</td><td>utilizan para el cultivo celular seguido de microscopía&nbsp;</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular</td><td>Greiner BioOne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medios de cultivo celular</td><td>Gibco (life technologies GmbH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero de ternero fetal&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de poli-L-lisina (0,01%, 50&nbsp; ml)</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>utilizado para recubrir portaobjetos de cámara de cultivo celular</td></tr><tr><td>Mountant Permafluor</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>S21022-3 Solución de</td><td>montaje para microscopía</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>AppliChem</td><td></td><td>Tinción de ADN para microscopía</td></tr><tr><td>Hera-Safe</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>banco de trabajo estéril utilizado para el cultivo celular</td></tr><tr><td>Célula HERA</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>Incubadora utilizada para el cultivo celular</td></tr><tr><td>LSM510-Meta</td><td>Zeiss</td><td></td><td>utilizado para microscopía</td></tr> <tr><td>confocalSistema de imagen de fluorescencia in vivo Maestro-TM</td><td>CRi, Woburn</td><td></td><td>utilizado para la obtención de imágenes de fluorescencia de cuerpo entero de animales pequeños</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro (Ultrospec 4300 pro UV)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>utilizado para la medición de la absorción</td></tr><tr><td>Espectrofluorómetro (Jasco FP-6200)</td><td>Jasco</td><td></td><td>utilizado para la medición de la emisión</td></tr><tr> de fluorescencia<td colspan="4">Animals</td></tr><tr><td>Ratones NMRI (8-12 semanas de edad, macho)</td><td>Elevage Janvier, Francia</td><td></td><td>utilizado para ensayos de inflamación</td></tr></tbody></table>

fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para en vivo imagen Óptico

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

La imagen óptica ofrece una amplia gama de modalidades de diagnóstico y ha atraído mucho interés como herramienta para la obtención de imágenes biomédicas. A pesar del enorme número de técnicas de imagen disponibles en la actualidad y de los avances en la instrumentación, sigue siendo necesario disponer de sondas altamente sensibles que sean adecuadas para la obtención de imágenes in vivo. Un problema típico de las sondas fluorescentes preclínicas disponibles es su rápido aclaramiento in vivo, lo que reduce su sensibilidad de imagen. Para evitar el aclaramiento rápido, aumentar el número de moléculas de colorante en el sitio objetivo y, por lo tanto, reducir la autofluorescencia de fondo, se realizó la encapsulación del colorante fluorescente de infrarrojo cercano, DY-676-COOH en liposomas y la verificación de su potencial para la obtención de imágenes in vivo de la inflamación. El DY-676 es conocido por su capacidad de autoenfriarse a altas concentraciones. Primero determinamos la concentración adecuada para el autoenfriamiento y luego encapsulamos esta concentración de enfriamiento en el interior acuoso de los liposomas pegilados. Para corroborar el potencial de enfriamiento y activación de los liposomas, utilizamos un método de congelación severo que conduce al daño de las membranas liposomales sin afectar el tinte encapsulado. Los liposomas caracterizados por un alto nivel de extinción por fluorescencia se denominaron Lip-Q. Demostramos mediante experimentos con diferentes líneas celulares que la captación de Lip-Q es predominantemente por fagocitosis, lo que a su vez permitió la caracterización de su potencial como herramienta para la obtención de imágenes in vivo de la inflamación en modelos de ratones. Además, utilizamos un modelo de edema inducido por zimosano en ratones para corroborar el potencial de Lip-Q en imágenes ópticas de inflamación in vivo. Teniendo en cuenta la posible absorción debido al efecto de mejora de la permeabilidad y retención (EPR) inducido por la inflamación, se comparó una formulación de liposomas siempre activa con una concentración baja y no apagada de DY-676-COOH (denominado Lip-dQ) y el DY-676-COOH libre con Lip-Q en ensayos con animales.

La encapsulación de altas concentraciones de colorantes fluorescentes tales como el colorante NIRF DY676-COOH utilizado aquí en el interior acuoso de los liposomas conduce a un alto nivel de extinción de la fluorescencia. Extinción de la fluorescencia, un fenómeno observado con muchos fluoróforos a alta concentración, puede ser explotado en varias en aplicaciones de formación de imágenes in vivo, donde se exigen una alta sensibilidad y detección fiable de la zona objetivo. El uso de liposomas también p...

El uso de fluoróforos para la obtención de imágenes in vivo puede verse muy limitado por la opsonización, el aclaramiento rápido, la baja sensibilidad de detección y los efectos citotóxicos en el huésped. La encapsulación de fluoróforos en liposomas mediante hidratación y extrusión de película conduce a la extinción y protección de la fluorescencia, lo que permite obtener imágenes in vivo con una alta sensibilidad de detección.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para En Vivo Imagen Óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar un liposoma activado que permita obtener imágenes in vivo de la inflamación con una alta sensibilidad. Esto se logra preparando primero una película lipídica compuesta de fosfolípidos en el segundo paso. Las vesículas espontáneas se forman hidratando la película de fosfolípidos con una solución de concentración apagada de un colorante fluorescente de infrarrojo cercano.Las vesículas formadas espontáneamente o SFV se extruyen para garantizar la homogeneidad de las vesículas liposomales y luego los liposomas se purifican a partir de las moléculas de colorante residuales no encapsuladas. En última instancia, las mediciones espectrométricas de la absorbancia y la emisión de fluorescencia se utilizan para mostrar el estado de enfriamiento del colorante encapsulado mientras está in vivo. Las imágenes de fluorescencia del infrarrojo cercano se utilizan para demostrar el potencial de los liposomas para obtener imágenes de procesos inflamatorios.La principal ventaja de esta tecnología frente a otras ya existentes es que podemos determinar la señal directamente tras la internalización del agente de contraste en las células. Eso significa que se activan en la célula para que la señal que se detecta provenga exclusivamente de las células. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico y la terapia del cáncer.Dado que los fagocitos, como los macrófagos asociados a tumores, pueden absorber y degradar los liposomas liberando fármacos terapéuticos o sondas de imagen dentro de los tumores. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la eficiencia de la encapsulación está influenciada por las propiedades del uso de DAI y la efectividad del proceso de hidratación. Para iniciar la dispersión vesical formada espontáneamente, comience agregando aproximadamente tres mililitros de cloroformo a un matraz de fondo redondo, seguido del volumen apropiado de soluciones de tallo de fosfolípidos recién preparadas en una proporción molar de 6.5 a tres a 0.5 para el marcaje fluorescente doble de los liposomas. A continuación, agregue 0.3 molar por ciento N-B-D-D-O-P-E a la solución lipídica.A continuación, utilice un evaporador rotativo para evaporar el cloroformo de la solución de fosfolípidos orgánicos a presión reducida a 300 milibares y 55 grados centígrados. Después de formar una película homogénea de fosfolípidos, reduzca la presión a 10 milibares durante una o dos horas para eliminar cualquier depósito residual de cloroformo mientras el cloroformo se evapora. Disuelva el tampón de interés de ácido carboxílico colorante fluorescente y llene un recipiente de doer con nitrógeno líquido.A continuación, encienda un baño ultrasónico a 50 grados centígrados. Ahora transfiera un volumen apropiado del colorante ácido carboxílico al matraz de fondo redondo para hidratar la película de fosfolípidos secos y el vórtice al matraz vigorosamente hasta que se forme una dispersión de vesículas formada espontáneamente, asegurándose de que todos los fosfolípidos se dispersen para evitar la pérdida de lípidos. A continuación, congele con cuidado el matraz de fondo redondo que contiene la dispersión SFV en nitrógeno líquido.Y después de tres a cinco minutos, coloque el matraz en el baño ultrasónico para descongelar la dispersión y vórtice el matraz vigorosamente durante uno o dos minutos más. A continuación, para facilitar la formación de vesículas homogéneas, aspire la dispersión de SFV en una jeringa de un mililitro y, a continuación, utilice un extrusor básico de lipo sofas para pasarla a través de una membrana de policarbonato de 100 nanómetros a una segunda jeringa de un mililitro. Extruya la dispersión de nuevo en la primera jeringa, repitiendo la transferencia 10 veces.La solución debe pasar de una apariencia nebulosa a una dispersión clara. Después del 10º ciclo de extrusión, retire la segunda jeringa y extruya la dispersión por última vez directamente en un tubo de reacción estéril de 1,5 mililitros. Ahora transfiera 0,5 mililitros de la dispersión de vesícula extruida al lecho de gel de una columna de cromatografía en gel de 28 centímetros cargada con perlas G 25 empapadas en tampón tris y deje que la muestra se drene en la matriz de gel.Eluir los liposomas con tampón tris y recoger la fracción de liposomas hasta que el liposoma se drene por completo. A continuación, concentrar los liposomas eluidos por ultracentrifugación y dispersarlos en un volumen adecuado de tampón tris estéril. Las micrografías electrónicas de los liposomas deben revelar una morfología mayoritariamente unal de las vesículas liposomales para analizar las capacidades de extinción y activación de la fluorescencia de los liposomas. A continuación, transfiera un total de 100 nanomolares de los lípidos apropiados a dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.A continuación, transfiera un ácido dicarboxílico libre equivalente al contenido de colorante del labio Q en otro tubo de 1,5 mililitros e incube un tubo de cada sonda a cuatro grados centígrados y el segundo a 80 grados centígrados negativos. A la mañana siguiente, se puso a calentar el bloque a 30 grados centígrados. Llene una caja de enfriamiento con hielo picado y equilibre una alícuota de tampón tris a temperatura ambiente.A continuación, descongele rápidamente las sondas del almacenamiento de menos 80 grados Celsius a 30 grados Celsius durante cinco minutos mientras equilibra las sondas de cuatro grados Celsius a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, enfríe todas las sondas en hielo durante un minuto antes de volver a transferirlas a temperatura ambiente. Ahora agregue tampón tris a cada una de las sondas hasta un volumen final de 100 microlitros.Y luego, después de otra incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, pipetea 80 microlitros de cada sonda en un veterinario de vidrio de bajo volumen y mide la absorción de 400 a 900 nanómetros en un espectrómetro. Regrese las sondas a sus tubos correspondientes y luego transfiera 80 microlitros de cada una a cubetas de vidrio adecuadas. Para medir las emisiones de fluorescencia en un fluorímetro espectral excitando las sondas a 674 nanómetros y midiendo la fluorescencia de 694 a 800 nanómetros.Para evaluar las propiedades de detección de inflamación de los liposomas, llene una jeringa con 50 microlitros de xina por solución, otra con 50 microlitros de solución salina isotónica y otra con la solución de sonda experimental, todo ello diluido en un HBSS hasta un volumen final de 150 microlitros. Después de confirmar la sedación con un pellizco en los dedos de los pies, aplique crema para los ojos al animal de experimentación y luego coloque el ratón sobre una colchoneta tibia. Inyecte el xon una solución por vía subcutánea en la pata trasera derecha del animal y la solución salina en la pata trasera izquierda.A continuación, inyecte inmediatamente la sonda por vía intravenosa y obtenga una imagen del animal a partir de entonces. Por último, guarde las imágenes resultantes como cubos de imagen. Obtención de imágenes de los animales cada dos horas durante 10 horas después de la inyección, y luego nuevamente a las 24 horas.Las sondas liposomales revelan una absorción fagocítica predominante que es inhibida por el agotamiento de energía, como se puede ver a través de la absorción de Q labial por líneas celulares de micrófagos espejo altamente fagocíticas y líneas celulares de glioblastoma humano mofagocítico. De acuerdo con la absorción fagocítica observada en líneas celulares cultivadas, la inyección intravenosa de LIP Q conduce a un aumento dependiente del tiempo en la intensidad de fluorescencia del edema en modelos de ratones con fluorescencia de fondo muy baja y con una intensidad de fluorescencia máxima detectada entre ocho y 10 horas después de la inyección. Por el contrario, se observa una fluorescencia de infrarrojo cercano relativamente fuerte de todo el animal después de la aplicación del ácido carboxílico libre o del labio liposomal siempre activo DQ en comparación con el labio Q. La rápida perfusión y eliminación del ácido carboxílico libre, como se observa de cero a cuatro horas después de la inyección, interfiere con las imágenes, lo que hace que no sea posible una detección fiable del edema.Además, el labio liposomado no apagado DQ revela una fluorescencia máxima del edema dentro de las dos a cuatro horas posteriores a la inyección que permanece casi constante hasta ocho horas y luego disminuye gradualmente de manera similar al labio apagado. Las imágenes de fluorescencia de edema basadas en Q de los órganos de ratones sacrificados 24 horas después de la administración de la sonda revelan una leve fluorescencia ex vivo del hígado, la vesícula biliar y los riñones, y una fluorescencia muy baja o nula del bazo, los pulmones y el corazón que sirve como evidencia para la eliminación de las sondas a través de la ruta biliar patológica. Mientras asiste a este procedimiento, es importante recordar usar una alta concentración del tinte para apagar la gripe y dispersar los fosfolípidos correctamente.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar liposomas activados para la obtención de imágenes in vivo de la inflamación con una alta sensibilidad. ¿Bien? No olvide que para la utilización de animales en investigación, debe seguir las pautas internacionales, y esto significa que debe solicitar la utilización de animales en experimentos. Necesita la aprobación del comité de ética local.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Se describe un multi-ángulo de rotación del sistema de formación de imágenes ópticas (Maroi) para la cuantificación in vivo de un marcador fluorescente emitido por saposina C (SAPC)-dioleilfosfatidil serina (DOPS) nanovesículas. El empleo de modelos de ratón de cáncer y la artritis, demostramos cómo el análisis de la curva de la señal de Maroi se puede utilizar para la cartografía precisa y caracterización biológica de los procesos de enfermedad.

En vivo de imágenes óptico de tumores del cerebro y la artritis Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

La ampliación de la base y la aplicabilidad de la fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) mediante encuestas a los principios pertinentes y demostrar su compatibilidad con una gran variedad de fluoróforos y condiciones de anticuerpos dirigidos.

Un paso más allá de BRET: Fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE)

Los estudios de biomoléculas in vivo son cruciales para comprender la función molecular en un contexto biológico. Aquí describimos un método novedoso que permite la internalización de biomoléculas fluorescentes, como el ADN o las proteínas, en microorganismos vivos. También se presenta y discute el análisis de datos in vivo registrados por microscopía de fluorescencia.

Internalización y Observación de fluorescente Biomoléculas en microorganismos que viven a través de electroporación

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

La utilización de receptores de etiquetado pHluorin de Seguimiento de localización subcelular y el Tráfico

Estimulación de ultrasonido pulsado (LIPUS) de baja intensidad es una modalidad de estimulación mecánica no invasiva de células endógenas o ingeniería con alta resolución espacial y temporal. Este artículo describe cómo implementar LIPUS a un microscopio de epifluorescencia y cómo minimizar el desajuste de impedancia acústica en el camino de ultrasonido para evitar artefactos mecánicos no deseados.

La multiplexación enfocada ultrasonido estimulación con microscopía de fluorescencia

El objetivo de este protocolo es sintetizar liposomas marcados con fluorescencia y utilizar la citometría de flujo para identificar la localización in vivo de liposomas a nivel celular.

Preparación, administración y evaluación de la captación celular in vivo específica del tejido de liposomas marcados con colorante fluorescente

Presentamos un protocolo para el uso de la microendoscopía láser confocal de fibra óptica (LMC) para estudiar de forma no invasiva la distribución espacio-temporal de los liposomas en el ojo tras la inyección subconjuntival.

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Aprende a preparar liposomas activables con fluoróforos encapsulados en infrarrojo cercano para imagen óptica in vivo de procesos inflamatorios con alta sensibilidad.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para En Vivo Imagen Óptico (Video) | JoVE Journal

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para En Vivo Imagen Óptico

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