Usando plusTipTracker Software a Medida microtúbulos dinámica en Xenopus laevis Conos de Crecimiento
7 de septiembre de 2014
El paquete de software basado en MATLAB código abierto, plusTipTracker, se puede utilizar para analizar series de imágenes de fluorescencia + Filtros marcado para cuantificar la dinámica de microtúbulos.
El objetivo de este procedimiento es obtener información cuantitativa sobre los microtúbulos más la proteína de seguimiento de extremos o la dinámica de las puntas y los conos de crecimiento vivos utilizando el paquete de software más el seguimiento de puntas. Aquí describimos los pasos para analizar imágenes de la dinámica de EB one GFP y los conos de crecimiento XUS lavis cultivados, pero se puede utilizar un protocolo similar para otros tipos de células después de la adquisición de imágenes en vivo de alta resolución de EB one marcado y conos de crecimiento embrionario cultivados. El primer paso en el procedimiento es usar el comando más punta, obtener pistas para detectar los cometas EB one GFP, vincular los cometas en pistas y determinar los parámetros de la dinámica de los microtúbulos.
El segundo paso es utilizar el comando más las pistas de la punta C para visualizar las pistas de microtúbulos superpuestas a las imágenes del cono de crecimiento. El paso final es utilizar el análisis de grupos de puntas plus para analizar y comparar los parámetros de seguimiento de microtúbulos de grupos de películas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso del seguimiento manual para analizar las pistas individuales más las puntas, es que este método permite la detección, el seguimiento, la visualización y el análisis rápidos y automatizados.
El primer paso en el análisis de imágenes es detectar los cometas EB one GFP, enlazar los cometas en trayectorias y determinar los parámetros de la dinámica de los microtúbulos. Esto se obtiene con el comando más punta. Obtenga pistas antes del análisis de la imagen.
Convierta cada película de lapso de tiempo en una secuencia de archivos de imagen TIFF y guarde cada serie en su propia carpeta llamada imágenes. Tenga en cuenta que las imágenes distinguen entre mayúsculas y minúsculas. Para comenzar el análisis, abra la aplicación MATLAB y escriba más tip get tracks en la ventana de comandos.
Esto hará que aparezca un nuevo cuadro de diálogo. Haga clic en, configure nuevos proyectos y seleccione una o más de las series de imágenes TIFF anteriores seleccionando la carpeta de imágenes adecuada. Al completar este paso, se creará un directorio de archivos.
Haga clic en, está bien. Una vez que se haya mostrado la primera imagen, use el mouse para hacer clic y crear un polígono. Luego abarca la totalidad del cono de crecimiento.
Haga doble clic con el ratón para cerrar el polígono. Aparecerá un cuadro de diálogo si la imagen tiene otro cono de crecimiento. Para analizar, seleccione sí.
De lo contrario, seleccione no. El siguiente paso es seleccionar los proyectos que se analizarán inmediatamente. Haga clic en seleccionar proyectos y seleccione la carpeta.
Para analizar una lista, aparecerá una pantalla pegajosa seleccionada. Selecciona los proyectos en el lado izquierdo de la pantalla y muévelos al lado derecho. Haga clic en, está bien.
Elija una ubicación para guardar la lista de proyectos y haga clic en guardar, seleccione detección, seguimiento y posprocesamiento. Una vez realizadas estas selecciones, el lado derecho del cuadro de diálogo se volverá configurable. Rellene la configuración de posprocesamiento.
Dependiendo de la configuración específica de adquisición de imágenes deseada, haga clic en iniciar. A continuación, el software ejecutará los pasos que se hayan introducido. La ventana de comandos muestra el tiempo restante estimado para cada función e indicará cuándo se ha terminado de ejecutar el paso.
Ahora que se han definido las pistas microtubulares, se utiliza la función más las pistas de punta C para la visualización de las pistas y para mostrar las pistas microtubulares superpuestas en las imágenes de los conos de crecimiento. Esto se obtiene con el comando más las pistas de punta C tipo más las pistas de punta C en la ventana de comandos. Después de que se cargue el cuadro de diálogo, haga clic en seleccionar proyecto.
Seleccione el directorio principal que contiene el proyecto a visualizar y haga clic en seleccionar carpeta. Una vez que aparezca la ventana, elija el archivo a visualizar y haga clic en. Bien, a continuación, haga clic en seleccionar ROI guardado, navegue a la misma región de interés carpeta que la seleccionada en el paso anterior y seleccione el archivo llamado R-O-I-Y-X.
Haga clic en seleccionar directorio de salida para designar dónde MATLAB guardará los archivos de visualización de pista y, a continuación, seleccione convertir película de pista. Aparecerá una pantalla con todas las pistas. Más propina Obtén pistas calculadas a partir de los comentarios de la propina plus.
El paso guarda la serie temporal de pistas en un formato de película. La función final se utiliza para crear grupos de películas para el análisis y la comparación de los parámetros de la pista microtubaria. Esto se obtiene con el comando más el análisis de grupos de puntas.
Una vez que se han ejecutado pistas de obtención de más sugerencia para varias películas y diferentes subconjuntos de datos están listos para la comparación. Escriba más análisis de grupo de propinas en la ventana de comandos: Para seleccionar manualmente los grupos que se van a comparar, primero anule la selección del grupo automático de la jerarquía. A continuación, haga clic en seleccionar proyectos.
Navegue a los directorios principales que contienen todas las carpetas de ROI. Para analizar una lista, seleccione Aparecerá la ventana GUI. Seleccione todos los proyectos para incluir en los grupos desde el lado izquierdo de la pantalla y muévalos al lado derecho.
Haga clic en, está bien. A continuación, elija una ubicación para guardar la lista de proyectos y haga clic en guardar, aparecerá una ventana. Haga clic en.
Bien, y aparecerá la ventana pegajosa de selección de lista. Nuevamente, seleccione solo los archivos que corresponden al primer grupo que debe juntarse y haga clic en. Bien. Ingrese el nombre del grupo y haga clic en OK.
Aparecerá una ventana, responda en consecuencia y continúe seleccionando grupos. A continuación, elija una ubicación para guardar la lista de grupos y haga clic en guardar. Haga clic en seleccionar directorio de salida para elegir dónde se almacenarán las carpetas de salida.
Por último, seleccione el tipo de análisis de grupo que desea realizar. Aquí seleccionamos los datos del grupo de todas las celdas y grupos. Haga clic en comparar grupos.
Esta imagen muestra los parámetros de la dinámica microtubárica obtenida a partir de la función más las pistas de git de punta. En este vídeo se muestran las pistas de microtúbulos obtenidas a partir de las pistas de la función más la punta C. Por último, en esta imagen se muestran los parámetros de los microtúbulos obtenidos a partir del análisis de la función más el grupo de puntas.
Usando una aplicación de hoja de cálculo. Estos parámetros adquiridos de diferentes grupos de películas también se pueden examinar como diagramas de caja utilizando un programa de procesamiento. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar el rastreador de puntas plus para obtener información cuantitativa sobre la dinámica de los microtúbulos más las puntas y los conos de crecimiento vivos utilizando las funciones más pistas git de puntas más pistas C de puntas y análisis de grupos de puntas más.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo describe el uso del paquete de software basado en MATLAB, plusTipTracker, para analizar la dinámica de los microtúbulos mediante +TIPs marcados con fluorescencia. El procedimiento proporciona un enfoque sistemático para cuantificar el comportamiento de las proteínas de seguimiento del extremo positivo de los microtúbulos en conos de crecimiento vivos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Dinámica de los Microtúbulos
Antecedentes
- Los microtúbulos desempeñan un papel fundamental en la estructura y función celulares.
- Las +TIP son proteínas que se asocian con los extremos en crecimiento de los microtúbulos.
- El análisis cuantitativo de la dinámica de las +TIP es esencial para comprender los procesos celulares.
- Los métodos existentes para el seguimiento de microtúbulos pueden ser lentos y menos eficientes.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para analizar la dinámica de microtúbulos utilizando plusTipTracker.
- Mejorar la comprensión del comportamiento de los +TIP en células vivas.
- Mostrar las ventajas del seguimiento automatizado frente a los métodos manuales.
Métodos Utilizados
- Uso del comando plusTip para obtener pistas y detectar cometas EB1-GFP.
- Vinculación de cometas en pistas para determinar los parámetros de la dinámica de microtúbulos.
- Visualización de las pistas de microtúbulos mediante el comando plusTip C tracks.
- Análisis grupal de los parámetros de las pistas de microtúbulos en múltiples videos.
Resultados principales
- Se logró la detección y el seguimiento automatizados de la dinámica de los microtúbulos.
- Las técnicas de visualización proporcionaron una comprensión clara del comportamiento de los microtúbulos.
- El análisis por grupos permitió realizar estudios comparativos entre diferentes condiciones.
- El método resultó ser más rápido y eficiente que los métodos tradicionales de seguimiento.
Conclusiones
- plusTipTracker es una herramienta valiosa para estudiar la dinámica de los microtúbulos.
- El enfoque automatizado mejora la precisión y eficiencia del análisis.
- Este protocolo puede adaptarse para diversos tipos celulares y condiciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación de la dinámica de los microtúbulos en los conos de crecimiento neuronales proporciona información mecanicista sobre la guía axonal y la formación sináptica, procesos relevantes para los modelos de trastornos del neurodesarrollo. El análisis automatizado de las trayectorias de cometas +TIP permite el cribado de alto contenido de compuestos que afectan la regulación del citoesqueleto, apoyando la validación de dianas en las líneas de descubrimiento en neurociencia. Este enfoque reduce el sesgo analítico y aumenta el rendimiento en comparación con el seguimiento manual, mejorando la confianza predictiva en estudios iniciales de interacción con la diana.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la dinámica de polimerización de microtúbulos como lectura funcional de dianas que regulan el crecimiento o la estabilidad axonal.
- Valor operativo: Proporciona parámetros cuantitativos estandarizados (velocidad de crecimiento, frecuencia de pausas, tasa de catástrofe) para la evaluación consistente del fenotipo de dianas en bibliotecas de compuestos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera lecturas reproducibles y multiparamétricas del comportamiento de los microtúbulos, adecuadas para la miniaturización del ensayo y la automatización en formatos de 96 y 384 pocillos.
- Valor operativo: Facilita la estandarización del ensayo entre laboratorios mediante la definición de selección clara de regiones de interés, parámetros de seguimiento y umbrales de análisis por grupos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona los fenotipos de la dinámica de microtúbulos in vitro con mecanismos relevantes para enfermedades en modelos de neurodesarrollo o neurodegenerativos.
- Valor operativo: Facilita la continuidad desde cultivos neuronales primarios hasta la validación en rebanadas organotípicas o in vivo mediante una metodología conservada de seguimiento de +TIP.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, donde los fenotipos cuantitativos del citoesqueleto orientan la selección de dianas antes de la identificación de compuestos líderes y las pruebas de eficacia preclínicas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis de dianas de cinasas, fosfatasas o proteínas asociadas a microtúbulos mediante la medición directa de la dinámica de cometas +TIP en conos de crecimiento vivos.
- Tamizaje: Proporciona salidas normalizadas listas para ensayos (densidad de cometas, longitud de trayectorias, distribuciones de velocidad) que permiten el cálculo del factor Z' y la confirmación de resultados positivos.
- Análisis: Ofrece comparaciones estadísticas a nivel de grupo (media, varianza, cambios en la distribución) esenciales para evaluar los efectos de compuestos en réplicas biológicas.
- Investigación Traducional: Conecta los fenotipos del citoesqueleto con ensayos de crecimiento axonal o formación de sinapsis, alineándose con puntos finales funcionales preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Establece un marco analítico centralizado basado en MATLAB aplicable a diversos tipos celulares (neuronas, fibroblastos, líneas de cáncer) que expresan +TIPs fluorescentes.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la modulación del objetivo al reducir la variabilidad inherente al seguimiento manual y permitir la detección de cambios dinámicos sutiles.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante la detección automatizada de cometas, algoritmos de seguimiento estandarizados y procesamiento por lotes de series de imágenes temporales.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en las decisiones de avance o interrupción al proporcionar perfiles multiparamétricos del citoesqueleto en fases tempranas de la línea temporal del descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en la gravedad cuantitativa del fenotipo de microtúbulos y en la magnitud de la recuperación inducida por compuestos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes de células vivas, entorno MATLAB y marcado con proteínas fluorescentes (por ejemplo, EB1-GFP) en cultivos primarios de neuronas.
- Depende de sistemas de adquisición por lapsos de tiempo de alta resolución y baja fototoxicidad, capaces de capturar la dinámica de cometas +TIP a intervalos de 1–2 segundos.
- Necesita estandarización entre equipos en la definición de la región de interés (perímetro del cono de crecimiento), parámetros de seguimiento (distancia de vinculación, intervalo entre cuadros) y filtros de posprocesamiento.
- Implica consideraciones de adaptación para morfologías celulares variables (por ejemplo, conos de crecimiento frente a ejes axonales) y niveles de expresión de +TIP en diferentes sistemas modelo.
- Limitado por la necesidad de cometas +TIP persistentes y detectables; puede no aplicarse a condiciones con eventos de polimerización de microtúbulos altamente inestables o escasos.
