Métodos de transfección neuronal
-La transferencia de material genético en las células mamíferas - la transfección es una valiosa herramienta que permite a los científicos a manipular genéticamente las neuronas y tejido neuronal. Las propiedades únicas de las células delicadas hacen transfección difíciles y requieren de técnicas especializadas.
Este video revisaremos los principios detrás de transfectar las neuronas y presentar estrategias comúnmente utilizadas en estas células, incluyendo nucleofection, biolística transfección y transducción viral. Finalmente, se discuten aplicaciones de las técnicas de transfección en investigación de Neurociencia molecular y celular.
Vamos a empezar por revisar cómo funciona la transfección. Mientras que el material genético se puede entregar en proximidad cercana a un cultivo de células añadiendo al medio circundante, nucleótidos eficiente no pueden penetrar las membranas celulares.
Todos los protocolos de la transfección están diseñados para que el material genético pasar esta barrera. Nucleótidos que bloquean la producción de proteínas como el silenciamiento de RNA, inmediatamente pueden realizar su función una vez que entran en el citoplasma. Sin embargo, construcciones de ADN deben ser transportadas en el núcleo de traducción antes de empezar la síntesis de proteínas.
En dividir las células, la ruptura de la envoltura nuclear durante la mitosis puede resultar en la incorporación de DNA transfected en reformar los núcleos de célula hija. Porque más cultivadas las neuronas son las células post mitóticas - o no se dividen -, protocolos de la transfección especializados se requieren para inducir con éxito la expresión génica.
Vamos a empezar nuestro Resumen de estos protocolos con nucleofection. Esta técnica utiliza una combinación de un campo eléctrico inducido y reactivos químicos, que actúan juntos para crear transitoria, poro-como las estructuras celulares y las membranas nucleares. Puesto que los nucleótidos están cargados, el campo eléctrico también unidades de movimiento de ADN a través de los poros.
Para llevar a cabo este procedimiento, las neuronas en suspensión se recogen en un pellet por centrifugación antes de resuspensión en comercial nucleofection reactivo. La mezcla de células después se combinan con el ADN purificado y transferida a una cubeta de electroporación, que dos placas de aluminio características eléctricas que en contacto con el aparato de Nucleofector. Este dispositivo ofrece una serie de pulsos eléctricos rápidos, cuyo número y duración son personalizados según el tipo de célula. Después nucleofection, las células pueden ser diluidas en medio de cultivo y plateadas para un crecimiento continuo.
Por otra parte, la técnica de la pistola de genes explosiones a través de las barreras de la transfección, disparando balas de llevar material genético a través de celulares y las membranas nucleares.
Para hacer balas de pistola de genes, ADN codifican el gen de interés se precipita en granos de la escala del micrón, compuestos generalmente de oro. Después de una incubación de 10 minutos, los granos son lavados y transferidos en la tubería. Continuación, se gira el tubo como la solución seca, resultando en una capa uniforme de cuentas. A continuación, el tubo es cortar cartuchos y cargado en la pistola. Gasolina la entrega de la carga genética se puede realizar en células de cultivo en placas de cultivo estándar por una simple presión sobre el gatillo.
Por último, transducción viral aprovecha el ciclo de vida viral para entregar material genético extraño en el núcleo. RNA que codifican el gen de interés se empaqueta en retrovirus modificados conocidos como vectores lentivirales, que entrar en las células diana por Unión a las proteínas de membrana específicas, desencadenar un evento de fusión de la membrana. El RNA viral es reverso transcribe en una hebra de ADN complementaria que se transporta en el núcleo.
Antes de comenzar este procedimiento, tenga en cuenta que virus pueden infectar las células en su cuerpo, así como los de tu plato, así que siguiendo las directrices de seguridad es extremadamente importante.
El primer paso es generar las partículas lentivirales portadores tu gen de interés. Esto se logra expresando los bloques de edificio del virus en una línea de células humanas optimizada para la producción viral, como las células 293T. Para evitar la propagación innecesaria de virus modificados, los genes necesarios para su montaje se mantienen separados de los vectores de transferencia, cuya secuencia se incluirá en la partícula infecciosa.
Tarda unos 2 días para los virus completamente montados ser liberados en el medio de cultivo, donde puede ser recogidos y concentrados por ultracentrifugación. A continuación, la concentración adecuada, o título, de virus se determina evaluando el éxito de la transducción de señales en una línea celular de prueba. Los vectores lentivirales es entonces agregado a la cultura neuronal y normalmente se incuba durante 24 a 48 horas asegurar que la infección ha ocurrido.
Ahora que usted está familiarizado con las técnicas de transfección comunes, que usted utilice dependerá de los objetivos específicos de los experimentos. Echemos un vistazo a algunos ejemplos.
Para empezar, observar que la maduración de las neuronas en cultivo permite un análisis detallado de los cambios morfológicos que son importantes para la conectividad neuronal, como la formación de espinas dendríticas. Para visualizar la morfología celular con el tiempo, estos investigadores hicieron uso de nucleofection para entregar una proteína fluorescente en cultivan las neuronas. Aquí, una proteína tubulina fluorescente etiquetado fue transfected en un subconjunto de las células, lo que permite análisis detallados de los procesos celulares mediante microscopía de fluorescencia. Porque los niveles de expresión se mantuvieron a lo largo de la vida de la neurona, se podrían realizar análisis morfológico para al menos un mes en la cultura.
Transfección puede utilizarse también para probar el impacto de las mutaciones genéticas específicas en función de la neurona. Una pistola génica puede utilizarse para entregar ADN codificación de tipo salvaje o versiones mutantes de una proteína, y los impactos a corto plazo en la biología celular pueden evaluarse, por ejemplo por la grabación de abrazadera del remiendo de leña de la neurona.
Por último, una estrategia común para las pruebas de función del gen es observar lo que sucede a las células cuando se bloquea su expresión. Para estos experimentos, vectores lentivirales pueden utilizarse para ofrecer construcciones silenciamiento de RNA, que impiden la síntesis de proteínas. En este experimento, knockdown de genes asociados con la enfermedad de Parkinson lleva a una disminución significativa en la viabilidad celular.
Sólo ha visto la introducción de Zeus para transfección de las neuronas. En este video hemos introducido principios de transfección de la neurona, así como los procedimientos y aplicaciones para tres estrategias comunes de transfección.
¡Gracias por ver!
-El proceso de transferencia de material genético en las células - la transfección es una poderosa herramienta para la manipulación rápida y eficaz de…
-La transferencia de material genético en las células mamíferas - la transfección es una valiosa herramienta que permite a los científicos a manipular genéticamente las neuronas y tejido neuronal. Las propiedades únicas de las células delicadas hacen transfección difíciles y requieren de técnicas especializadas.
Este video revisaremos los principios detrás de transfectar las neuronas y presentar estrategias comúnmente utilizadas en estas células, incluyendo nucleofection, biolística transfección y transducción viral. Finalmente, se discuten aplicaciones de las técnicas de transfección en investigación de Neurociencia molecular y celular.
Vamos a empezar por revisar cómo funciona la transfección. Mientras que el material genético se puede entregar en proximidad cercana a un cultivo de células añadiendo al medio circundante, nucleótidos eficiente no pueden penetrar las membranas celulares.
Todos los protocolos de la transfección están diseñados para que el material genético pasar esta barrera. Nucleótidos que bloquean la producción de proteínas como el silenciamiento de RNA, inmediatamente pueden realizar su función una vez que entran en el citoplasma. Sin embargo, construcciones de ADN deben ser transportadas en el núcleo de traducción antes de empezar la síntesis de proteínas.
En dividir las células, la ruptura de la envoltura nuclear durante la mitosis puede resultar en la incorporación de DNA transfected en reformar los núcleos de célula hija. Porque más cultivadas las neuronas son las células post mitóticas - o no se dividen -, protocolos de la transfección especializados se requieren para inducir con éxito la expresión génica.
Vamos a empezar nuestro Resumen de estos protocolos con nucleofection. Esta técnica utiliza una combinación de un campo eléctrico inducido y reactivos químicos, que actúan juntos para crear transitoria, poro-como las estructuras celulares y las membranas nucleares. Puesto que los nucleótidos están cargados, el campo eléctrico también unidades de movimiento de ADN a través de los poros.
Para llevar a cabo este procedimiento, las neuronas en suspensión se recogen en un pellet por centrifugación antes de resuspensión en comercial nucleofection reactivo. La mezcla de células después se combinan con el ADN purificado y transferida a una cubeta de electroporación, que dos placas de aluminio características eléctricas que en contacto con el aparato de Nucleofector. Este dispositivo ofrece una serie de pulsos eléctricos rápidos, cuyo número y duración son personalizados según el tipo de célula. Después nucleofection, las células pueden ser diluidas en medio de cultivo y plateadas para un crecimiento continuo.
Por otra parte, la técnica de la pistola de genes explosiones a través de las barreras de la transfección, disparando balas de llevar material genético a través de celulares y las membranas nucleares.
Para hacer balas de pistola de genes, ADN codifican el gen de interés se precipita en granos de la escala del micrón, compuestos generalmente de oro. Después de una incubación de 10 minutos, los granos son lavados y transferidos en la tubería. Continuación, se gira el tubo como la solución seca, resultando en una capa uniforme de cuentas. A continuación, el tubo es cortar cartuchos y cargado en la pistola. Gasolina la entrega de la carga genética se puede realizar en células de cultivo en placas de cultivo estándar por una simple presión sobre el gatillo.
Por último, transducción viral aprovecha el ciclo de vida viral para entregar material genético extraño en el núcleo. RNA que codifican el gen de interés se empaqueta en retrovirus modificados conocidos como vectores lentivirales, que entrar en las células diana por Unión a las proteínas de membrana específicas, desencadenar un evento de fusión de la membrana. El RNA viral es reverso transcribe en una hebra de ADN complementaria que se transporta en el núcleo.
Antes de comenzar este procedimiento, tenga en cuenta que virus pueden infectar las células en su cuerpo, así como los de tu plato, así que siguiendo las directrices de seguridad es extremadamente importante.
El primer paso es generar las partículas lentivirales portadores tu gen de interés. Esto se logra expresando los bloques de edificio del virus en una línea de células humanas optimizada para la producción viral, como las células 293T. Para evitar la propagación innecesaria de virus modificados, los genes necesarios para su montaje se mantienen separados de los vectores de transferencia, cuya secuencia se incluirá en la partícula infecciosa.
Tarda unos 2 días para los virus completamente montados ser liberados en el medio de cultivo, donde puede ser recogidos y concentrados por ultracentrifugación. A continuación, la concentración adecuada, o título, de virus se determina evaluando el éxito de la transducción de señales en una línea celular de prueba. Los vectores lentivirales es entonces agregado a la cultura neuronal y normalmente se incuba durante 24 a 48 horas asegurar que la infección ha ocurrido.
Ahora que usted está familiarizado con las técnicas de transfección comunes, que usted utilice dependerá de los objetivos específicos de los experimentos. Echemos un vistazo a algunos ejemplos.
Para empezar, observar que la maduración de las neuronas en cultivo permite un análisis detallado de los cambios morfológicos que son importantes para la conectividad neuronal, como la formación de espinas dendríticas. Para visualizar la morfología celular con el tiempo, estos investigadores hicieron uso de nucleofection para entregar una proteína fluorescente en cultivan las neuronas. Aquí, una proteína tubulina fluorescente etiquetado fue transfected en un subconjunto de las células, lo que permite análisis detallados de los procesos celulares mediante microscopía de fluorescencia. Porque los niveles de expresión se mantuvieron a lo largo de la vida de la neurona, se podrían realizar análisis morfológico para al menos un mes en la cultura.
Transfección puede utilizarse también para probar el impacto de las mutaciones genéticas específicas en función de la neurona. Una pistola génica puede utilizarse para entregar ADN codificación de tipo salvaje o versiones mutantes de una proteína, y los impactos a corto plazo en la biología celular pueden evaluarse, por ejemplo por la grabación de abrazadera del remiendo de leña de la neurona.
Por último, una estrategia común para las pruebas de función del gen es observar lo que sucede a las células cuando se bloquea su expresión. Para estos experimentos, vectores lentivirales pueden utilizarse para ofrecer construcciones silenciamiento de RNA, que impiden la síntesis de proteínas. En este experimento, knockdown de genes asociados con la enfermedad de Parkinson lleva a una disminución significativa en la viabilidad celular.
Sólo ha visto la introducción de Zeus para transfección de las neuronas. En este video hemos introducido principios de transfección de la neurona, así como los procedimientos y aplicaciones para tres estrategias comunes de transfección.
¡Gracias por ver!
-La transferencia de material genético en las células mamíferas - la transfección es una valiosa herramienta que permite a los científicos a manipular genéticamente las neuronas y tejido neuronal. Las propiedades únicas de las células delicadas hacen transfección difíciles y requieren de técnicas especializadas.
Este video revisaremos los principios detrás de transfectar las neuronas y presentar estrategias comúnmente utilizadas en estas células, incluyendo nucleofection, biolística transfección y transducción viral. Finalmente, se discuten aplicaciones de las técnicas de transfección en investigación de Neurociencia molecular y celular.
Vamos a empezar por revisar cómo funciona la transfección. Mientras que el material genético se puede entregar en proximidad cercana a un cultivo de células añadiendo al medio circundante, nucleótidos eficiente no pueden penetrar las membranas celulares.
Todos los protocolos de la transfección están diseñados para que el material genético pasar esta barrera. Nucleótidos que bloquean la producción de proteínas como el silenciamiento de RNA, inmediatamente pueden realizar su función una vez que entran en el citoplasma. Sin embargo, construcciones de ADN deben ser transportadas en el núcleo de traducción antes de empezar la síntesis de proteínas.
En dividir las células, la ruptura de la envoltura nuclear durante la mitosis puede resultar en la incorporación de DNA transfected en reformar los núcleos de célula hija. Porque más cultivadas las neuronas son las células post mitóticas - o no se dividen -, protocolos de la transfección especializados se requieren para inducir con éxito la expresión génica.
Vamos a empezar nuestro Resumen de estos protocolos con nucleofection. Esta técnica utiliza una combinación de un campo eléctrico inducido y reactivos químicos, que actúan juntos para crear transitoria, poro-como las estructuras celulares y las membranas nucleares. Puesto que los nucleótidos están cargados, el campo eléctrico también unidades de movimiento de ADN a través de los poros.
Para llevar a cabo este procedimiento, las neuronas en suspensión se recogen en un pellet por centrifugación antes de resuspensión en comercial nucleofection reactivo. La mezcla de células después se combinan con el ADN purificado y transferida a una cubeta de electroporación, que dos placas de aluminio características eléctricas que en contacto con el aparato de Nucleofector. Este dispositivo ofrece una serie de pulsos eléctricos rápidos, cuyo número y duración son personalizados según el tipo de célula. Después nucleofection, las células pueden ser diluidas en medio de cultivo y plateadas para un crecimiento continuo.
Por otra parte, la técnica de la pistola de genes explosiones a través de las barreras de la transfección, disparando balas de llevar material genético a través de celulares y las membranas nucleares.
Para hacer balas de pistola de genes, ADN codifican el gen de interés se precipita en granos de la escala del micrón, compuestos generalmente de oro. Después de una incubación de 10 minutos, los granos son lavados y transferidos en la tubería. Continuación, se gira el tubo como la solución seca, resultando en una capa uniforme de cuentas. A continuación, el tubo es cortar cartuchos y cargado en la pistola. Gasolina la entrega de la carga genética se puede realizar en células de cultivo en placas de cultivo estándar por una simple presión sobre el gatillo.
Por último, transducción viral aprovecha el ciclo de vida viral para entregar material genético extraño en el núcleo. RNA que codifican el gen de interés se empaqueta en retrovirus modificados conocidos como vectores lentivirales, que entrar en las células diana por Unión a las proteínas de membrana específicas, desencadenar un evento de fusión de la membrana. El RNA viral es reverso transcribe en una hebra de ADN complementaria que se transporta en el núcleo.
Antes de comenzar este procedimiento, tenga en cuenta que virus pueden infectar las células en su cuerpo, así como los de tu plato, así que siguiendo las directrices de seguridad es extremadamente importante.
El primer paso es generar las partículas lentivirales portadores tu gen de interés. Esto se logra expresando los bloques de edificio del virus en una línea de células humanas optimizada para la producción viral, como las células 293T. Para evitar la propagación innecesaria de virus modificados, los genes necesarios para su montaje se mantienen separados de los vectores de transferencia, cuya secuencia se incluirá en la partícula infecciosa.
Tarda unos 2 días para los virus completamente montados ser liberados en el medio de cultivo, donde puede ser recogidos y concentrados por ultracentrifugación. A continuación, la concentración adecuada, o título, de virus se determina evaluando el éxito de la transducción de señales en una línea celular de prueba. Los vectores lentivirales es entonces agregado a la cultura neuronal y normalmente se incuba durante 24 a 48 horas asegurar que la infección ha ocurrido.
Ahora que usted está familiarizado con las técnicas de transfección comunes, que usted utilice dependerá de los objetivos específicos de los experimentos. Echemos un vistazo a algunos ejemplos.
Para empezar, observar que la maduración de las neuronas en cultivo permite un análisis detallado de los cambios morfológicos que son importantes para la conectividad neuronal, como la formación de espinas dendríticas. Para visualizar la morfología celular con el tiempo, estos investigadores hicieron uso de nucleofection para entregar una proteína fluorescente en cultivan las neuronas. Aquí, una proteína tubulina fluorescente etiquetado fue transfected en un subconjunto de las células, lo que permite análisis detallados de los procesos celulares mediante microscopía de fluorescencia. Porque los niveles de expresión se mantuvieron a lo largo de la vida de la neurona, se podrían realizar análisis morfológico para al menos un mes en la cultura.
Transfección puede utilizarse también para probar el impacto de las mutaciones genéticas específicas en función de la neurona. Una pistola génica puede utilizarse para entregar ADN codificación de tipo salvaje o versiones mutantes de una proteína, y los impactos a corto plazo en la biología celular pueden evaluarse, por ejemplo por la grabación de abrazadera del remiendo de leña de la neurona.
Por último, una estrategia común para las pruebas de función del gen es observar lo que sucede a las células cuando se bloquea su expresión. Para estos experimentos, vectores lentivirales pueden utilizarse para ofrecer construcciones silenciamiento de RNA, que impiden la síntesis de proteínas. En este experimento, knockdown de genes asociados con la enfermedad de Parkinson lleva a una disminución significativa en la viabilidad celular.
Sólo ha visto la introducción de Zeus para transfección de las neuronas. En este video hemos introducido principios de transfección de la neurona, así como los procedimientos y aplicaciones para tres estrategias comunes de transfección.
¡Gracias por ver!
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Q1: Why do neurons require specialized transfection techniques compared to other mammalian cells?
Most cultured neurons are post-mitotic, or non-dividing cells, unlike rapidly dividing cells where the nuclear envelope breaks down during mitosis to incorporate transfected DNA. This unique property of mature neurons necessitates specialized protocols that can directly deliver genetic material across both cell and nuclear membranes without relying on cell division to facilitate DNA entry into the nucleus.
Q2: How does nucleofection enable genetic material to cross neuronal cell membranes?
Nucleofection combines an induced electrical field with chemical reagents to create transient pore-like structures in both cell and nuclear membranes. Since nucleotides are charged, the electric field drives DNA movement through these pores. Neurons are collected in a pellet, resuspended in commercial nucleofection reagent, mixed with purified DNA, and transferred to an electroporation cuvette where rapid electrical pulses are delivered.
Q3: What is the process for preparing gene gun bullets for biolistic transfection?
DNA encoding the gene of interest is precipitated onto micron-scale gold beads and incubated for 10 minutes. The beads are then washed and transferred into tubing that is rotated as the solution dries, creating a uniform coating. The tubing is cut into cartridges and loaded into the gene gun for gas-powered delivery through cell and nuclear membranes.
Q4: How do lentiviral vectors deliver genetic material into neuronal nuclei?
Lentiviral vectors are modified retroviruses that gain entry into target cells by binding to specific membrane proteins, triggering membrane fusion. The viral RNA is reverse transcribed into complementary DNA and transported into the nucleus. Lentiviral particles are generated by expressing viral building blocks in optimized cell lines like 293T cells, then collected and concentrated by ultracentrifugation before adding to target neuronal cultures.
Q5: How can transfection be used to visualize neuronal morphology changes in culture?
Researchers use nucleofection to deliver fluorescent proteins, such as fluorescently-tagged tubulin, into cultured neurons. This allows detailed analysis of morphological changes important for neuronal connectivity, like dendritic spine formation. Because expression levels are maintained throughout the neuron's lifetime, morphological analysis via fluorescence microscopy can be performed for extended periods, such as at least one month in culture.
Q6: What are the advantages of using lentiviral vectors for gene silencing studies in neurons?
Lentiviral vectors can deliver silencing RNA constructs that prevent protein synthesis, allowing researchers to observe cellular effects when gene expression is blocked. This approach is particularly useful for functional studies, such as knockdown of genes associated with Parkinson's disease, which can reveal impacts on cell viability and other cellular processes relevant to an introduction to cellular and molecular neuroscience research.
Q7: How can gene gun transfection be used to assess the impact of genetic mutations on neuronal function?
A gene gun delivers DNA encoding wild-type or mutant versions of a protein into neurons, enabling short-term assessment of cellular effects. Researchers can evaluate impacts on neuronal function using techniques like patch clamp electrophysiology principle applications to measure changes in neuron firing patterns and other electrophysiological properties resulting from the mutation.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:49
Principles of Transfection
1:57
Nucleofection
3:07
Gene Gun Transfection
4:03
Viral Transduction
5:53
Applications
7:40
Summary
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