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Advanced Biology

Métodos de transfección neuronal

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Neuroscience

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Neuronal Transfection Methods

1.11: Primary Neuronal Cultures

1.15: An Introduction to Developmental Neurobiology

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08:04 min

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April 30, 2023

Overview

-El proceso de transferencia de material genético en las células – la transfección es una poderosa herramienta para la manipulación rápida y eficaz de la expresión génica en las células. Porque este método puede utilizarse para silenciar la expresión de proteínas específicas o a la expresión de las proteínas extranjeras o modificadas, la transfección es una herramienta extremadamente útil en el estudio de los procesos celulares y moleculares que gobiernan la función neuronal. Sin embargo, las neuronas maduras tienen un número de propiedades que los hacen difíciles de transfectar, técnicas especializadas son necesarias para la manipulación genética de este tipo celular.

Este vídeo repasa los principios y fundamento de transferencia de las neuronas. Tres estrategias comunes para transfección neuronal se discuten, incluyendo nucleofection, gene-gun y transducción viral. Además de describir cómo cada una de estas técnicas supera los desafíos asociados con la transferencia de las neuronas, la presentación incluye una descripción de cómo se realizan los tres métodos. Por último, se introducen varias aplicaciones de la transfección neuronal, como la expresión de proteínas de tubulina fluorescente para visualizar la morfología de la neurona y para generar un modelo de cultivo celular de la enfermedad de Parkinson que silencian el gen selectivo.

Procedure

-La transferencia de material genético en las células mamíferas – la transfección es una valiosa herramienta que permite a los científicos a manipular genéticamente las neuronas y tejido neuronal. Las propiedades únicas de las células delicadas hacen transfección difíciles y requieren de técnicas especializadas.

Este video revisaremos los principios detrás de transfectar las neuronas y presentar estrategias comúnmente utilizadas en estas células, incluyendo nucleofection, biolística transfección y transducción viral. Finalmente, se discuten aplicaciones de las técnicas de transfección en investigación de Neurociencia molecular y celular.

Vamos a empezar por revisar cómo funciona la transfección. Mientras que el material genético se puede entregar en proximidad cercana a un cultivo de células añadiendo al medio circundante, nucleótidos eficiente no pueden penetrar las membranas celulares.

Todos los protocolos de la transfección están diseñados para que el material genético pasar esta barrera. Nucleótidos que bloquean la producción de proteínas como el silenciamiento de RNA, inmediatamente pueden realizar su función una vez que entran en el citoplasma. Sin embargo, construcciones de ADN deben ser transportadas en el núcleo de traducción antes de empezar la síntesis de proteínas.

En dividir las células, la ruptura de la envoltura nuclear durante la mitosis puede resultar en la incorporación de DNA transfected en reformar los núcleos de célula hija. Porque más cultivadas las neuronas son las células post mitóticas – o no se dividen -, protocolos de la transfección especializados se requieren para inducir con éxito la expresión génica.

Vamos a empezar nuestro Resumen de estos protocolos con nucleofection. Esta técnica utiliza una combinación de un campo eléctrico inducido y reactivos químicos, que actúan juntos para crear transitoria, poro-como las estructuras celulares y las membranas nucleares. Puesto que los nucleótidos están cargados, el campo eléctrico también unidades de movimiento de ADN a través de los poros.

Para llevar a cabo este procedimiento, las neuronas en suspensión se recogen en un pellet por centrifugación antes de resuspensión en comercial nucleofection reactivo. La mezcla de células después se combinan con el ADN purificado y transferida a una cubeta de electroporación, que dos placas de aluminio características eléctricas que en contacto con el aparato de Nucleofector. Este dispositivo ofrece una serie de pulsos eléctricos rápidos, cuyo número y duración son personalizados según el tipo de célula. Después nucleofection, las células pueden ser diluidas en medio de cultivo y plateadas para un crecimiento continuo.

Por otra parte, la técnica de la pistola de genes explosiones a través de las barreras de la transfección, disparando balas de llevar material genético a través de celulares y las membranas nucleares.

Para hacer balas de pistola de genes, ADN codifican el gen de interés se precipita en granos de la escala del micrón, compuestos generalmente de oro. Después de una incubación de 10 minutos, los granos son lavados y transferidos en la tubería. Continuación, se gira el tubo como la solución seca, resultando en una capa uniforme de cuentas. A continuación, el tubo es cortar cartuchos y cargado en la pistola. Gasolina la entrega de la carga genética se puede realizar en células de cultivo en placas de cultivo estándar por una simple presión sobre el gatillo.

Por último, transducción viral aprovecha el ciclo de vida viral para entregar material genético extraño en el núcleo. RNA que codifican el gen de interés se empaqueta en retrovirus modificados conocidos como vectores lentivirales, que entrar en las células diana por Unión a las proteínas de membrana específicas, desencadenar un evento de fusión de la membrana. El RNA viral es reverso transcribe en una hebra de ADN complementaria que se transporta en el núcleo.

Antes de comenzar este procedimiento, tenga en cuenta que virus pueden infectar las células en su cuerpo, así como los de tu plato, así que siguiendo las directrices de seguridad es extremadamente importante.

El primer paso es generar las partículas lentivirales portadores tu gen de interés. Esto se logra expresando los bloques de edificio del virus en una línea de células humanas optimizada para la producción viral, como las células 293T. Para evitar la propagación innecesaria de virus modificados, los genes necesarios para su montaje se mantienen separados de los vectores de transferencia, cuya secuencia se incluirá en la partícula infecciosa.

Tarda unos 2 días para los virus completamente montados ser liberados en el medio de cultivo, donde puede ser recogidos y concentrados por ultracentrifugación. A continuación, la concentración adecuada, o título, de virus se determina evaluando el éxito de la transducción de señales en una línea celular de prueba. Los vectores lentivirales es entonces agregado a la cultura neuronal y normalmente se incuba durante 24 a 48 horas asegurar que la infección ha ocurrido.

Ahora que usted está familiarizado con las técnicas de transfección comunes, que usted utilice dependerá de los objetivos específicos de los experimentos. Echemos un vistazo a algunos ejemplos.

Para empezar, observar que la maduración de las neuronas en cultivo permite un análisis detallado de los cambios morfológicos que son importantes para la conectividad neuronal, como la formación de espinas dendríticas. Para visualizar la morfología celular con el tiempo, estos investigadores hicieron uso de nucleofection para entregar una proteína fluorescente en cultivan las neuronas. Aquí, una proteína tubulina fluorescente etiquetado fue transfected en un subconjunto de las células, lo que permite análisis detallados de los procesos celulares mediante microscopía de fluorescencia. Porque los niveles de expresión se mantuvieron a lo largo de la vida de la neurona, se podrían realizar análisis morfológico para al menos un mes en la cultura.

Transfección puede utilizarse también para probar el impacto de las mutaciones genéticas específicas en función de la neurona. Una pistola génica puede utilizarse para entregar ADN codificación de tipo salvaje o versiones mutantes de una proteína, y los impactos a corto plazo en la biología celular pueden evaluarse, por ejemplo por la grabación de abrazadera del remiendo de leña de la neurona.

Por último, una estrategia común para las pruebas de función del gen es observar lo que sucede a las células cuando se bloquea su expresión. Para estos experimentos, vectores lentivirales pueden utilizarse para ofrecer construcciones silenciamiento de RNA, que impiden la síntesis de proteínas. En este experimento, knockdown de genes asociados con la enfermedad de Parkinson lleva a una disminución significativa en la viabilidad celular.

Sólo ha visto la introducción de Zeus para transfección de las neuronas. En este video hemos introducido principios de transfección de la neurona, así como los procedimientos y aplicaciones para tres estrategias comunes de transfección.

¡Gracias por ver!

Transcript

Transfection – the transfer of genetic material into mammalian cells – is a valuable tool that allows scientists to genetically manipulate neurons and neuronal tissue. The unique properties of the delicate cells make transfection challenging and necessitate specialized techniques.

This video will review the principles behind transfecting neurons and introduce strategies commonly used on these cells, including nucleofection, biolistic transfection, and viral transduction. Finally, we will discuss applications of transfection techniques in cell and molecular neuroscience research.

Let’s begin by reviewing how transfection works. While genetic material can be delivered in close proximity to a cultured cell by adding it to the surrounding medium, nucleotides cannot efficiently penetrate cell membranes.

All transfection protocols are designed to enable genetic material to bypass this barrier. Nucleotides that block protein production, like silencing RNA, can immediately carry out their function once they enter the cytoplasm. However, DNA-based constructs must be transported into the nucleus for translation before protein synthesis can begin.

In dividing cells, the breakdown of the nuclear envelope during mitosis can result in the incorporation of transfected DNA into reforming daughter cell nuclei. Because most cultured neurons are post-mitotic – or non-dividing – cells, specialized transfection protocols are required in order to successfully induce gene expression.

Let’s start our overview of these protocols with nucleofection. This technique utilizes a combination of an induced electrical field and chemical reagents, which act together to create transient, pore-like structures in both cell and nuclear membranes. Since nucleotides are charged, the electric field also drives movement of DNA through the pores.

To carry out this procedure, neurons in suspension are collected in a pellet by centrifugation prior to resuspension in commercial nucleofection reagent. The cell mixture is then combined with purified DNA and transferred to an electroporation cuvette, which features two aluminum plates that make electrical contact with the Nucleofector apparatus. This device delivers a series of rapid electrical pulses, whose number and duration are customized based on the cell type. After nucleofection, the cells can be diluted in culture medium and plated for continued growth.

Alternatively, the gene gun technique blasts through transfection barriers, by shooting bullets carrying genetic material through both cell and nuclear membranes.

To make gene gun bullets, DNA encoding your gene of interest is precipitated onto micron-scale beads, usually composed of gold. After a 10 minute incubation, the beads are washed and transferred into tubing. The tubing is then rotated as the solution dries, resulting in a uniform coating of beads. Next, the tubing is cut into cartridges and loaded into the gun. Gas-powered delivery of the genetic payload can be performed on cells growing in standard culture plates by a simple pull of the trigger.

Lastly, viral transduction takes advantage of the viral life cycle to deliver foreign genetic material into the nucleus. RNA encoding the gene of interest is packaged into modified retroviruses known as lentiviral vectors, which gain entry into target cells by binding to specific membrane proteins, triggering a membrane fusion event. The viral RNA is then reverse transcribed into a complementary DNA strand that is transported into the nucleus.

Before starting this procedure, note that viruses can infect the cells in your body as well as the ones in your dish, so following safety guidelines is extremely important.

The first step is to generate the lentiviral particles carrying your gene of interest. This is accomplished by expressing the building blocks of the virus in a human cell line optimized for viral production, like 293T cells. To avoid the unnecessary spread of engineered viruses, the genes required for their assembly are kept separate from the transfer vector, whose sequence will be included in the infectious particle.

It takes about 2 days for the fully assembled viruses to be released into the culture medium, where they can be collected and concentrated by ultracentrifugation. Next, the appropriate concentration, or titer, of virus is determined by assessing transduction success in a test cell line. The lentiviral vector is then added to the target neuronal culture and typically incubated for 24 to 48 hours to ensure infection has occurred.

Now that you are familiar with the common transfection techniques, the one you use will depend upon the specific goals of your experiments. Let’s look at some examples.

To begin, observing the maturation of neurons in culture allows for detailed analysis of the morphological changes that are important for neuronal connectivity, like the formation of dendritic spines. To visualize cell morphology over time, these researchers made use of nucleofection to deliver a fluorescent protein into cultured neurons. Here, a fluorescently-tagged tubulin protein was transfected into a subset of cells, allowing for detailed analyses of cell processes via fluorescence microscopy. Because expression levels were maintained throughout the lifetime of the neuron, morphological analysis could be performed for at least a month in culture.

Transfection can also be used to test the impact of specific genetic mutations on neuron function. A gene gun can be used to deliver DNA encoding wild type or mutant versions of a protein, and short-term impacts on cellular biology can be assessed, for example by patch clamp recording of neuron firing.

Lastly, a common strategy for testing a gene’s function is to observe what happens to cells when its expression is blocked. For these experiments, lentiviral vectors can be used to deliver silencing RNA constructs, which prevent protein synthesis. In this experiment, knockdown of genes associated with Parkinson’s disease leads to a significant decrease in cell viability.

You’ve just watched JoVE’s introduction to transfection of neurons. In this video we have introduced principles of neuron transfection, as well as procedures and applications for three common transfection strategies.

Thanks for watching!

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