Name: Subclonación Plus Inserción (SPI) - Un nuevo método recombinería para la rápida construcción de la orientación de genes Vectores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprende el método de subclonación más inserción (SPI) para construir vectores de targeting génico en E. coli. Esta técnica recombinera permite generar vectores personalizados en una sola reacción, acelerando la creación de modelos transgénicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

T.R.R concibió el proyecto, diseñó y realizó experimentos y preparó el manuscrito. E.J.K y S.E.M realizaron experimentos. Todos los autores contribuyeron intelectualmente al manuscrito final. Este trabajo fue financiado por una beca de innovación de la Universidad de Leicester para SEM y por una beca de investigación senior del Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (MRC) para S.M.C (MR/J009202/1). La secuenciación del ADN fue realizada por los Laboratorios de Proteínas y Ácidos Nucleicos (PNACL), Centro de Servicios Básicos de Biotecnología, Universidad de Leicester. Deseamos agradecer a A. Francis Stewart por proporcionar los plásmidos Rox y Dre. Los plásmidos pL451 y pL452 se obtuvieron del Instituto Nacional del Cáncer (NCI), Frederick, EE. UU.

1. gene targeting Diseño <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ordene un clon BAC apropiado que cubre la región genómica de interés. Asegúrese de que este es isogénica con el tipo de células madre embrionarias que ser modificado, por ejemplo, los clones RPCI-23 y RPCI-24 BAC para la orientación de genes con C57BL / 6 ES células. </li><li> Aplicar gen convencional criterios de orientación en el diseño de los ataques de vectores. Los parámetros clave incluyen si se requiere la modificación a ser constitutivo o condicional, definiendo exones críticos (CE) para la supresión en una estrategia gen knockout y el espaciamiento y la colocación de cintas intrónicos. NOTA: Cada uno de ellos ha sido discutido en detalle en otra parte 10. </li><li> Elija regiones genómicas cada uno de 5-6 kb que flanquean el sitio de modificación de destino. NOTA: Por consiguiente, el tamaño del inserto subclonado es típicamente 10-12 kb, aunque el límite superior puede ser tan alto como 80 kb con un bajo número de copias del plásmido como subclonación p15A, etc. pBR322 y hasta 200 kb con un BACvector. </li></ol> 2. Multiplex recombinería Oligos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Oligos de diseño para el esqueleto del plásmido (plásmido subclonación) y el marcador seleccionable (casete de inserción). Diseñar cada oligo tal que contiene 180 pb HA que flanquea el sitio diana genómico y 20 pb de la secuencia de cebado específico de la casete de inserción o el plásmido subclonación (Figura 2). NOTA: brazos de homología no deben contener elementos repetitivos, la presencia de elementos repetitivos se traducirá en la orientación incorrecta y subclonación. Elementos repetitivos pueden ser detectados mediante el uso de herramientas basadas en la web, como el &#39;&#39; Repite Enmascarador &#39;&#39;. </li><li> Incluir un sitio único de enzima de restricción (RE) sobre uno de los oligos de vectores para linealizar el vector genes de la orientación para la orientación de células ES (Figura 2). </li><li> Compruebe los parámetros oligo utilizando un programa analizador de oligo. Tenga cuidado de evitar estructuras secundarias en la región de cebados. </li><li> Shorter HA (50 pb) del casete de inserción es tolerada y produce menor número de recombinantes, pero asegúrese de que el plásmido subcloning HA es siempre más larga (180 pb). </li><li> Determinar la orientación del inserto de ADN genómico de lo particular clon BAC utilizando herramientas basadas en web como &#39;&#39; cloneDB &#39;&#39;. Establecer la dirección de replicación del oriS comprobando el mapa de la columna vertebral plásmido BAC utilizados en la construcción de la biblioteca BAC. NOTA: oris es generalmente opuesta a la dirección de la transcripción del marcador de cloranfenicol (CHL) para todos los plásmidos BAC utilizados comúnmente. </li><li> Añadir dos enlaces terminales de fosforotioato (PTO) al extremo 5 &#39;del oligo que es opuesta a la dirección de la replicación en el clon BAC. Añadir una modificación 5 &#39;fosfato a la oligo inverso (Figura 2). NOTA: La asimétrica phosphorothioated casete PCR tras la digestión Red genera un ssDNA intermedio que puede cebar la cadena retrasadadel tenedor de replicación. NOTA: Maximal multiplex frecuencia de recombinación se observa con los cassettes protegidas filamento de revestimiento. Principal capítulo protegida o casetes protegidas duales no puede producir eficiencias de recombinación equivalentes en una loci. </li><li> Ordene oligos con la página o la purificación HPLC. </li></ol> 3. Transformación BAC clon con pSC101 BADgbaA recombinería plásmido. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para hacer que la E. coli cepa que lleva el recombinería BAC competentes, transformada con el plásmido pSC101 BADgbaA que contiene los genes rojos 16. NOTA: El plásmido pSC101 BADgbaA contiene los genes rojos y RecA bajo el control de la inducible araC-P BAD promotor de arabinosa, un marcador de selección de tetraciclina y el replicón pSC101 sensible a la temperatura. <ol><li> Apuñalar a una punta de pipeta estéril en el cultivo de agar BAC e inocular 5,0 ml de caldo lisogenia (LB) pH 8,0 que contenía 12,556; g ml -1 Chl. Crece a 37 ° C durante 5 horas con agitación a 200 rpm. </li><li> Chill 10% (v / v) de solución de glicerol, tubos de microcentrífuga y cubetas de electroporación sobre hielo. Enfriar una gran centrifugadora y microcentrífuga refrigerada a 4 ° C. </li><li> Determinar la densidad óptica (DO) del cultivo usando un espectrofotómetro y medir la absorbancia a 600 nm. Preparar células electrocompetentes (como se describe a continuación) cuando se alcanza una lectura OD 600 de 0,3 a 0,8. </li><li> Centrifugar las células en un tubo de centrífuga de 50 ml en un gran centrifugar a 1216 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células con 1 ml de frío 10% de glicerol y centrifugar las células a 17.949 xg durante 20 segundos a 4 ° C. Realice el lavado de paso un total de 3 veces. </li><li> Resuspender las células en un volumen total de 50 l de 10% de glicerol y añadir 10-200 ng del plásmido pSC101 recombineering BADgbaA. Obtener una única suspensión celular mediante pipeteoarriba y abajo varias veces y luego transferir las células a un pre-refrigerada 1 mm cubeta de electroporación de brecha. </li><li> Electroporar las células con un ajuste de 1,8 kv, 25 mF y 200 Ω. NOTA: Compruebe los ajustes correctos para cada marca de electroporador. Una constante de tiempo de la electroporación menos de 4 indica la presencia de sal y otras impurezas. </li><li> Inmediatamente recuperar las células en 1 ml de LB y transferir las células a un tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Mantener el cultivo GBAA BAC a 30 ° C durante 2 horas con agitación a 200 rpm. NOTA: El plásmido pSC101 BADgbaA se pierde cuando las células se cultivaron a 37 ° C debido a la inactivación del factor de replicación sensible a la temperatura repe. Se cultivan las células GBAA a 30 ° C para mantener las funciones recombinería. </li><li> Añadir 9 ml de LB que contienen 12,5 mg ml -1 Chl y 4 mg ml -1 tetraciclina (Tet) a la cultura GBAA BAC recuperado. Crecer elBAC GBAA cultivo O / N a 30 &#160; ° C con agitación a 200 rpm. NOTA: La eficiencia de transformación de la electroporación el plásmido superenrollado GBAA es suficientemente alta para permitir el crecimiento de saturación de O / N en medios líquidos. </li></ol></li></ol> 4. Preparación de Inserción Casetes y Subclonación plásmidos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para incorporar HA en el casete (s) de inserción y el plásmido subclonación, lleve a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los oligos largo modificados como se describe a continuación. <ol><li> Opcional: para evitar plásmido arrastre en la reacción recombinería, utilice un origen R6K o plantilla plásmido estrecho rango de huéspedes similar a amplificar el casete de inserción. </li><li> Alternativamente, linealizar el plásmido plantilla usando un compendio RE (Tabla 2). Elegir un RE que corta fuera de la región amplificación por PCR y es inactivado por calor. El calor inactiva la RE como recomienda la manufacturer. </li><li> Configurar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un sistema de ADN hotstart polimerasa de alta fidelidad. Preparar una mezcla maestra de PCR como se detalla (Tabla 3). Realizar ciclos térmicos como se muestra (Tabla 3). </li></ol></li><li> Analizar los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Cargar 1-5 l de cada PCR en un 1% (w / v) en gel de agarosa que contiene 0,5 mg ml -1 bromuro de etidio (EtBr). NOTA: La presencia de productos de amplificación no específicos no interfiere en la reacción recombinería. En algunos casos, sin embargo, dímeros de cebadores pueden disminuir la eficiencia recombinería. </li><li> Purificar los productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR. <ol><li> Opcional: eliminar la plantilla plásmido de PCR mediante tratamiento con DpnI seguido por PCR de limpieza. Eluir el ADN en un volumen mínimo de agua desionizada estéril (según lo recomendado por el fabricante). NOTA: La adición de DpnI para no purificado de PCR reacciones resultados en reducción de la eficacia de la escisión del XXe plantilla de ADN plásmido metilado. </li></ol></li><li> Cuantificar PCR de ADN amplificado mediante análisis en gel de agarosa en contra de un conjunto conocido de patrones de ADN, por ejemplo, λ digestión con HindIII o mediante el uso de un espectrofotómetro NanoDrop. </li></ol> 5. Subcloning Plus Inserción <ol style="margin-left: 40px;"><li> Diluir la O / N BAC GBAA cultivo de 50 veces mediante la adición de 200 l en 10 ml de LB + Chl + Tet. Crecer en 30 &#160; ° C con agitación a 200 rpm durante 1 hr 50 min. Incluir una muestra a ser utilizada como control negativo. </li><li> Enfríe todos los materiales y equipos recombinería a 4 ° C como se describe en el paso 3.1.2. </li><li> Verter LB agar pH 8 placas que contienen la concentración correcta del antibiótico selectivo apropiado (s) que permita la selección del fragmento de ADN que se inserta, así como para la selección del vector de subclonación (Tabla 4). NOTA: Algunos antibióticos son sensibles al pH. Uso LBagar pH 8 como una regla. </li><li> Preparar una solución al 10% de L-arabinosa (v w /). Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras. NOTA: arabinosa induce la expresión de las proteínas recombinería a partir del plásmido GBAA. </li><li> Compruebe el diámetro exterior de la cultura GBAA BAC utilizando un espectrofotómetro. Una vez que un OD 600 de 0,25-0,3 se alcanza, inducir a las proteínas recombinería como se describe en el siguiente paso. </li><li> Añadir 200 l de la solución de arabinosa 10% a 10 ml del cultivo de BAC para lograr una concentración final de 0,2% de arabinosa. Incluir un cultivo no inducido (sin arabinosa) para ser utilizado como control negativo. </li><li> Transferir la cultura BAC a un 37 &#160; ° C incubadora de agitación e inducir la expresión Roja durante 45 minutos con agitación a 230 rpm. NOTA: La expresión de proteínas rojas es ineficiente a 30 ° C. </li><li> Centrifugar las células y lavar con 10% de glicerol 3 veces tal como se describe en el paso 3.1.5. </li><li> Añadir 600-1,000 ng de cada uno del plásmido subclonación y el casete (s) de inserción a la reacción recombineering. Incluir un único vector y vector más Insertar controles individuales para comprobar el dominio de la recombinación y la integridad del vector y los cassettes. </li><li> Obtener una única suspensión celular pipeteando arriba y abajo. Realizar electroporación como se describe en el paso 3.1.7 y posterior recuperación en 1 ml de LB a 37 ° C durante 1 hora para los plásmidos multicopia o en 10 ml de LB a 37 ° C durante 3 horas para los vectores del BAC. </li><li> Placa de diferentes diluciones de la cultura por ejemplo, recuperado, 90%, 10%, 1% en las placas de agar de doble selección y crecer a 37 &#160; ° C durante 16 horas. </li></ol> 6. Análisis de recombinantes <ol style="margin-left: 40px;"><li> Opcional: Pick 6 a 12 colonias y realizar colonia PCR utilizando un cebador flanqueante HA y un cebador específico de inserción. Incluya el plásmido subclonación y el cas de inserciónplásmido Sette, así como el clon BAC padre como controles negativos. <ol><li> Realizar análisis en gel de agarosa de los PCR de colonias. Identificar los clones positivos por la presencia de una banda brillante en el tamaño esperado. NOTA: La alta eficiencia del proceso de clonación recombinantes SPI genera principalmente correctos. </li></ol></li><li> Escoja colonias en 5 ml de LB pH 8 que contiene el antibiótico selectivo y crecer O / N a 37 ° C. </li><li> Preparar minipreparaciones de ADN utilizando un kit de purificación de la columna según las instrucciones del fabricante. </li><li> Preparar ADN miniprep BAC utilizando el aislamiento de fenol-cloroformo estándar o un protocolo similar. </li><li> Realizar digiere RE en el ADN miniprep. ADN separadas por electroforesis en gel de agarosa. Analizar los patrones de RE para identificar los clones que contienen los fragmentos de tamaños esperados del vector de orientación correcta. Elija un RE que discrimina claramente entre el inserto (s) vector que carece y el vector que contiene el inserto (s). </li><li> Optional: para obtener células que carecen de la BAC, que todavía está presente en la E. coli después recombinería, utilice el ADN plásmido miniprep transformar DH5alfa o DH10B E. células de E. coli. </li><li> Realizar la secuenciación de ADN a través de la HA y el casete de inserción para comprobar errores de síntesis de oligo. </li></ol>

<ol><li>Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+1+%28HDAC1%29%2C+but+not+HDAC2%2C+controls+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).</li>
<li>Harvey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+carcinogen-induced+tumorigenesis+in+p53-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice.</a> Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).</li>
<li>Waterhouse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoproliferative+disorders+with+early+lethality+in+mice+deficient+in+Ctla-4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4.</a> Science. 270, 985-988 (1995).</li>
<li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51, 503-512 (1987).</li>
<li>Hasty, P., Rivera-Pérez, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+length+of+homology+required+for+gene+targeting+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).</li>
<li>Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+DNA+sequences+into+the+human+chromosomal+beta-globin+locus+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination.</a> Nature. 317, 230-234 (1985).</li>
<li>Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+transgene+insertion+into+human+chromosomes+by+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors.</a> Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).</li>
<li>Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-strand-break+repair+model+for+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The double-strand-break repair model for recombination.</a> Cell. 33, 25-35 (1983).</li>
<li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309, 255-256 (1984).</li>
<li>Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F. A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFu%2C+J+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. Soriano, P. M., Wassarman, P. M. 477, Academic Press. 125-144 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+logic+for+DNA+engineering+using+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).</li>
<li>Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li>
<li>Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modification+of+bacterial+artificial+chromosomes+by+ET-recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+homologous+recombination-based+method+of+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering.</a> Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+recombineering+approach+by+adding+RecA+to+%CE%BB+red+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An improved recombineering approach by adding RecA to λ red recombination.</a> Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).</li>
<li>Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+recombineering+plasmids+for+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria.</a> Gene. 379, 109-115 (2006).</li>
<li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RecE+enhances+linear-linear+homologous+recombination+and+facilitates+direct+cloning+for+bioprospecting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting.</a> Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).</li>
<li>Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecE%2FRecT+and+Redalpha%2FRedbeta+initiate+double-stranded+break+repair+by+specifically+interacting+with+their+respective+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners.</a> Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).</li>
<li>Maresca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+heteroduplex+intermediates+in+lambda+Red+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination.</a> BMC Mol. Biol. 11, 54(2010).</li>
<li>Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red+recombineering+in+Escherichia+coli+occurs+through+a+fully+single-stranded+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate.</a> Genetics. 186, 791-799 (2010).</li>
<li>Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+recombineering-based+method+for+generating+conditional+knockout+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations.</a> Genome Res. 13, 476-484 (2003).</li>
<li>Chan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombineering+based+approach+for+high-throughput+conditional+knockout+targeting+vector+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction.</a> Nucleic Acids Res. 35, e64(2007).</li>
<li>Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).</li>
<li>Lee, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+Escherichia+coli-based+chromosome+engineering+system+adapted+for+recombinogenic+targeting+and+subcloning+of+BAC+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA.</a> Genomics. 73, 56-65 (2001).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li>
<li>Valenzuela, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+engineering+of+the+mouse+genome+coupled+with+high-resolution+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis.</a> Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).</li>
<li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoproteomics+profiling+of+HDAC+inhibitors+reveals+selective+targeting+of+HDAC+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes.</a> Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).</li>
<li>Mulryan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+vas+deferens+contraction+and+male+infertility+in+mice+lacking+P2X1+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors.</a> Nature. 403, 86-89 (2000).</li>
<li>Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+basis+of+processivity+in+lambda+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).</li>
<li>Antoch, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+the+mouse+circadian+Clock+gene+by+transgenic+BAC+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue.</a> Cell. 89, 655-667 (1997).</li>
<li>Rostovskaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 40, e150(2012).</li>
<li>Giraldo, P., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters%3A+use+of+YACs%2C+BACs+and+PACs+in+transgenic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals.</a> Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).</li>
<li>Hill, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+trimming%3A+minimizing+clone+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC trimming: minimizing clone overlaps.</a> Genomics. 64, 111-113 (2000).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
</ol>

T.R.R es el inventor de una solicitud de patente británica sobre tecnología de recombinación multiplex.

Construcción de líneas de células madre embrionarias y modelos de ratón históricamente ha incluido la orientación de genes utilizando construcciones de plásmidos que contenían el alelo modificado 4. Sin embargo, la construcción de estos vectores complejos orientación de genes ha demostrado ser un cuello de botella significativo en la producción oportuna de tales modelos. El desarrollo de estrategias de construcción vector recombinería basada ha permitido mejorar los diseños vectoriales y montaje vector más eficiente. Sin embargo, los protocolos recombinería actuales todavía implican varios pasos, requieren de purificación de plásmido intermedio y utilizan diferentes cepas bacterianas. Subclonación de inserción plus ofrece un nuevo enfoque para la construcción de vectores que se pueden realizar en un solo evento electroporación en la cepa huésped BAC residente. La utilidad de SPI en la dirección de genes fue probado aquí en una variedad de aplicaciones de construcción del vector. En todos los casos examinados aquí, SPI demostró ser eficiente y se produjo el plásmido recombinante correcta.En la mayoría de los casos, las múltiples cintas de diferentes fueron insertados correctamente en el vector de direccionamiento. Grandes casetes de ADN y vectores fueron alojados fácilmente en el protocolo SPI y demostraron la flexibilidad de este sistema. SPI se basa en el uso de secuencias de homología largas y fosforotioato (PTO) la protección de los casetes de ADN lineales. Modificación PTO confiere protección contra exonucleasas al ADN lineal 20,21 y la larga HA aumenta la eficiencia de recombinación para permitir la multiplexación. Sin embargo, la síntesis de secuencias de oligo largos aumenta las posibilidades de acumulación de errores especialmente supresiones. Las mutaciones en el oligo pueden ser particularmente perjudicial si cubren regiones codificantes de proteínas. La secuenciación del ADN a través de la HA y cubre la longitud completa de la cinta insertada es muy recomendable para eliminar clones con las alteraciones de la secuencia. También se sugiere el uso de un sistema de ADN polimerasa de alta fidelidad para evitar la introducción de unaerrores y PCR. La longitud y la composición de la HA del plásmido subclonación es más crítica respecto a la de la casete de inserción (datos no mostrados). Para aplicaciones especialmente sensibles como la construcción de vectores knockin, donde no se toleran las mutaciones en las regiones de exón, la HA del casete de inserción se puede acortar (50-120 pb) para evitar problemas asociados con oligos largos. El casete de inserción también se puede dejar phosphorothioated no modificada o dual (donde el conocimiento de la dirección de la replicación no está disponible). Pero multiplexación en estos casos todavía requiere mucho protegidos HA plásmidos subclonación. Una advertencia de esta estrategia particular es la disminución de la eficiencia de multiplexación que potencialmente pueden afectar SPI clonación en diferentes loci. La longitud de la casete de inserción y el plásmido subclonación es otro parámetro importante en el SPI clonación. Moléculas de ADN más grandes electroporar menos eficiencia y el efecto es acumulativo, dada la rerequisito de introducir todos los casetes en la misma célula (datos no mostrados). La multiplexación es más eficiente con casetes de inserción más pequeños. Fragmentos de ADN mayores de 3 kb también poner un límite en el procesamiento de ssDNA Roja mediada, que es más eficiente hasta 3 kb 30. Casetes Inserción de más de 3 kb son duales resecado y recombinan menos eficiente a través de una vía independiente beta 20. Por lo tanto, la detección de colonias suficientes para identificar el clon correcto se vuelve importante en estos casos. Una mayor duración de la post electroporación recombinación también aumenta las posibilidades de recuperación del clon correcto en ejercicios difíciles SPI. Hasta cuatro cassettes pequeños (&lt;1,5 kb) pueden ser insertados simultáneamente con el proceso de SPI, aunque la eficiencia de multiplexación disminuye con cada casete adicional (datos no mostrados). Sin embargo, esto refleja el resultado de un experimento óptima SPI y es recomendable tener en cuenta los límites de multiplexación cuando se utiliza muchas grandes cassettes. </p&gt; El desarrollo de herramientas de edición del genoma como agrupados interspaced regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) Sistema endonucleasa -cas9 ha permitido la creación de nuevas modificaciones del genoma y ha llevado a la ingeniería del genoma más eficiente 36. Sin embargo, estas nuevas tecnologías han complementado vectores de genes objetivo en lugar de ellos suplantado. Se prevé que el sistema de CRISPR-cas podría sustituir a la selección de antibióticos y perfeccionar el protocolo recombineering multiplex.

El desarrollo de tecnologías de segmentación de genes ha permitido la construcción de líneas celulares y modelos de ratón para investigar diferentes sistemas biológicos 1-3. Una primera etapa clave en la modificación de una secuencia genómica es el diseño y la construcción de un gen vector dirigido 4. Vectores de abordaje son construcciones de plásmidos que llevan el alelo de interés que contiene las modificaciones deseado (s) flanqueados por un marcador de selección (por ejemplo, neomicina), y las regiones genómicas largos requeridos para la recombinación homóloga eficiente en células de mamífero 5. Modificación del gen preciso se consigue mediante la introducción del vector de orientación en células madre embrionarias (ES) 6 o células somáticas 7, con lo cual la recombinación homóloga entre tramos idénticos de secuencia de ADN en el vector de direccionamiento y los resultados locus genómico en la transferencia de la modificación prevista al genoma mediante conversión génica 8. Tal modified células ES pueden ser inyectadas en blastocistos de ratón para producir descendencia (quimeras) que luego pueden transmitir estos alelos modificados a través de la línea germinal 9. Una ruta alternativa para producir ratones transgénicos implica la microinyección de un vector de expresión de genes en cigotos de ratón unicelulares, que conduce a la integración aleatoria del vector en el genoma del ratón 10. Los métodos tradicionales de la construcción del vector se han basado en convencional &#39;cortar y pegar&#39; clonación usando enzimas de restricción y ligasas de ADN para clonar el marcador de selección diferente y fragmentos genómicos en un esqueleto del vector. Sin embargo, un factor limitante inherente de clonación tradicional es el posicionamiento y la elección de los sitios de restricción, especialmente con secuencias de ADN más largos. Esto a menudo requiere múltiples etapas de subclonación y también introduce las secuencias de ADN extrañas en el vector, que a menudo conduce a una menor eficiencia de la orientación de genes. Recombinería (eng recombinogenicineering) es una tecnología de la ingeniería de ADN que supera estas limitaciones mediante el uso de recombinación homóloga (HR) mediada por las proteínas de recombinación del fago en E. coli células 11,12. Dado que cualquier región de una secuencia homóloga puede servir como un sustrato de recombineering, se eliminan las limitaciones de disponibilidad de sitios de restricción. Las secuencias de ADN de gran tamaño pueden ser modificados sin problemas directamente in vivo, por tanto, también la preservación de su integridad estructural 13. Recombinería es muy eficiente con homologías cortas (50 pb) 14 y por lo tanto brazos de homología (HA) pueden ser convenientemente incorporados en las secuencias de oligo sintéticos. En un experimento típico recombinería, un oligo o un fragmento de ADN bicatenario (dsDNA) contiene HA se electroporación en recombinería E. competente células de E. coli que contienen el objetivo situado ya sea en el cromosoma o en un plásmido 15. El potencial de recombinación es conferida por la expresión inducible de la rec Redombination proteínas del fago 16,17 o las proteínas RECET del profago rac 18. La exonucleasa Red / RecE convierte dsDNA lineales a un ADN monocatenario (ssDNA) intermedio, que luego se une por su socio, Red / RecT, una proteína de recocido de una sola hebra (SSAP) 19. El recocido de una larga ssDNA o un corto oligo a su secuencia diana complementaria se produce en el capítulo menos del tenedor de replicación y conduce a la incorporación de la secuencia en el sitio diana. Retardamien hebra ssDNA recombinación es la base de la alta eficiencia de recombineering y puede ser descrita por el &quot;beta&quot; modelo de recombinación 20,21. Un flujo de trabajo típico recombinería para construir un vector de orientación de genes involucra cualquiera de las dos siguientes rutas. Una ruta implica la subclonación de la región genómica deseada de un clon BAC de ratón en un plásmido seguido de la inserción secuencial de sitios de recombinación LoxP, un marcador de selección <shasta&gt; 22 etc., o la ruta alternativa implica la orientación del BAC locus genómico con los diferentes elementos de la orientación del vector de múltiples rondas de recombinería 10,23 y después subclonando el locus modificado en un plásmido mediante reparación brecha clonación 24,25. Variaciones sobre este tema se han utilizado en diferentes tuberías recombinería de alto rendimiento como parte de los programas de producción de gran ratón 26,27. Sin embargo, estos procedimientos implican etapas complicadas y largas, requieren el uso de vectores especializados y E. coli cepas (por ejemplo, células que expresan Cre) y utilizar una o más etapas intermedias de purificación de ADN vector y re-transformación (Tabla 1). Subclonación de inserción más (SPI) es una técnica recombineering novela que combina beta recombinación y reparación brecha de la clonación en un único proceso (Figura 1). Montaje vector SPI es simple, rápida y flexible y ofrece una mejora significativa en recombi estándaringe- se acerca (Tabla 1). Aquí, nos demuestran la facilidad y utilidad de usar SPI para diferentes aplicaciones en la construcción del vector con un énfasis particular en la construcción de diseños de vectores no estándar y desafiantes. Los casos de prueba incluyen la construcción de un vector knockin indicador fluorescente, una expresión de la proteína etiquetada vector knockin dual, un fluorescente reportero vector BAC y un vector knockout condicional. Estos examinaron diversamente el requisito de localizar un receptor de superficie celular, purificar un complejo de proteína nuclear o condicionalmente ablación de la expresión de un gen.

<table><tbody><tr><td>Antibióticos excepto Zeocin</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>ampicilina, A9518-5G; cloranfenicol, C1919-5G; Blasticidina, 15205-25MG; gentamicina, G1264-50MG; Higromicina, H3274-50MG; Kanamicina,: K1876-1G; Clorhidrato de tetraciclina, T7660-5G; Trimetoprim, 92131-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeocina</td><td>Invivogen:&nbsp;</td><td>ant-zn-1</td><td>Zeocin también está disponible en Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>C57BL/6 clones de BAC</td><td>CHORI: https://bacpac.chori.org/&nbsp;</td><td>Las bibliotecas RPCI-23 o RPCI-24 BAC</td><td>129/Sv Los clones de BAC se pueden obtener de Invivogen o Life technologies/</td></tr><tr><td>Fisher KOD sistema de polimerasa de ADN de inicio en caliente</td><td>Millipore: https://www.merckmillipore.com</td><td>71086-3</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinosa</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleótidos largos</td><td>IDT: https://www.idtdna.com; Enlace de genes: https://www.genelink.com</td><td>Ultramers IDT o oligonucleótidos largos de enlace génico</td><td>PTO y fosfato disponibles como modificaciones personalizadas. Se recomienda encarecidamente la purificación de PAGE para oligonucleótidos largos.</td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR MinElute</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>28004</td><td>Se prefieren los kits de purificación de PCR de elución mínima.</td></tr><tr><td>Kit de preparación QIAPrep Spin Mini</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>27104</td><td>Se prefiere la columna de sílice o kits de matriz similares.</td></tr><tr><td>Enzimas de restricción</td><td>NEB: https://www.neb.com</td><td>DpnI: R0176L</td><td>Consulte el sitio web de NEB para obtener una lista de RE.</td></tr></tbody></table>

subclonación plus inserción (spi) - un nuevo método recombinería para la rápida construcción de la orientación de genes vectores

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

La segmentación génica se refiere a la modificación precisa de un locus genético mediante recombinación homóloga. La generación de nuevas líneas celulares y modelos de ratones transgénicos utilizando este método requiere la construcción de un vector "objetivo", que contiene secuencias de ADN homólogas al gen diana, y ha sido durante muchos años un paso limitante en el proceso. La construcción de vectores se puede realizar in vivo en células de Escherichia coli utilizando recombinación homóloga mediada por recombinasas de fagos utilizando una técnica denominada recombinación. La recombinación es la técnica preferida para subclonar las secuencias de homología largas (>4 kb) y varios elementos de orientación, incluidos los marcadores de selección necesarios para mediar el intercambio alélico eficiente entre un vector de dirigüismo y su locus genómico afín. Los protocolos de recombinación típicos siguen un esquema iterativo de integración paso a paso de los elementos de segmentación y requieren pasos intermedios de purificación y transformación. Aquí, presentamos una nueva metodología de recombinación de ensamblaje vectorial utilizando un enfoque multiplex. La reparación de la brecha plásmida se realiza mediante la captura simultánea de la secuencia genómica de las bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos de ratón y la inserción de marcadores de selección duales de bacterias y mamíferos. Este método de subclonación más inserción es altamente eficiente y produce una mayoría de recombinantes correctos. Presentamos datos para la construcción de diferentes tipos de vectores condicionales de genes knockout, o knock-in, y vectores reporteros de BAC que se han construido utilizando este método. La construcción de vectores SPI amplía en gran medida el repertorio de la caja de herramientas de recombinación y proporciona un método sencillo, rápido y rentable para construir estos vectores altamente complejos.

Las metodologías de selección de genes se pueden utilizar para generar ratones transgénicos con alelos knockout, knock-in y marcados. Aquí, describimos un método mejorado de recombinación en E. coli, que denominamos 'subclonación más inserción', que se puede utilizar para generar rápidamente vectores de orientación génica personalizados.

Subclonación Plus Inserción (SPI) - Un nuevo método recombinería para la rápida construcción de la orientación de genes Vectores

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

El objetivo general del siguiente experimento es construir vectores de genes dirigidos utilizando la subclonación más la inserción. Esto se logra transformando la parte posterior que contiene E. coli con un plásmido recombinante. El segundo paso consiste en generar casetes de inserción fosforolados asimétricos y subclonar plásmidos mediante reacción en cadena de la polimerasa.Tras la adición de arabinosa, se expresan las proteínas recombinantes GBAA y se electroporan el casete de inserción modificado terminal y el plásmido de subclonación. La secuencia de ADN deseada se cautiva simultáneamente desde la parte posterior y se modifica con el casete de inserción en el plásmido de subclonación. La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes, como la recombinación estándar, es que la construcción del vector de orientación génica se puede realizar en una sola reacción.Para comenzar, diseñe oligonucleótidos para el casete de inserción y el plásmido de subclonación, diseñe cada oligonucleótido de tal manera que contenga 180 brazos de homología de pares de bases que flanquean el sitio objetivo genómico y 20 pares de bases, una secuencia de cebado específica para el casete de inserción o el plásmido de subclonación. A continuación, determine la orientación de la inserción de ADN genómico del clon posterior utilizando una herramienta basada en la web como clon db. Establezca la dirección de replicación desde o ES comprobando el mapa de la columna vertebral del plásmido posterior utilizado en la parte posterior.Construcción de la biblioteca, agregue dos enlaces de fosfo ocho terminales, por lo que el extremo cinco primo del oligo que es opuesto a la dirección de replicación en el clon posterior. A continuación, agregue una modificación de fosfato de cinco primos al oligo inverso. En primer lugar, introduzca una punta de pipeta estéril en el cultivo de agar trasero e inocule 5,0 mililitros de caldo de avena.Cultive el cultivo a 37 grados centígrados durante cinco horas con agitación a 200 RPM. A continuación, enfríe, solución de glicerol al 10%, microcentrífuga, tubos y electroporación, cubetas en enfriador de hielo, centrífuga grande refrigerada y microcentrífuga a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, determine la densidad óptica del cultivo utilizando un espectrofotómetro.Medición de la absorbancia. A 600 nanómetros. Prepare las celdas electrocompetentes cuando se alcance una lectura de OD 600 de 0,3 a 0,8.Cuando el cultivo esté listo, centrifuga las células en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Lavar las células con un mililitro de glicerol frío al 10% y volver a centrifugar. Realice estos pasos de lavado un total de tres veces.Resuspenda las células en un volumen total de 50 microlitros y agregue de 10 a 200 nanogramos del plásmido recombinante. Obtenga una suspensión de una sola celda pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces, y luego transfiera las celdas a una electroporación de preenfriamiento. Vete. A continuación, coloque el vete en un dispositivo de electroporación y electroaccione las celdas inmediatamente, recupere las celdas en un mililitro de LB y transfiera las celdas a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.Cultive el cultivo posterior a 30 grados centígrados durante dos horas con agitación a 200 RPM. Pasado este tiempo, añadir nueve mililitros de LB al cultivo recuperado. Crecer durante la noche a 30 grados centígrados con agitación a 200 RPM para incorporar los brazos de homología en el casete de inserción y el plásmido de clonación subc.Realice la PCR utilizando los oligonucleótidos modificados largos preparados anteriormente. Alternativamente, linealice la plantilla de plásmido usando una enzima de restricción, elija una que corte fuera de la región de amplificación de PCR y esté activada por calor. Configure la PCR utilizando un sistema de ADN polimerasa de arranque en caliente de alta fidelidad.Prepare una mezcla maestra de PCR y realice ciclos térmicos de acuerdo con las mejores prácticas. Después de la reacción, analice los productos de PCR mediante electroforesis en gel AROS. Cargue de uno a cinco microlitros de cada PCR en un gel de 1%aros.A continuación, purifique los productos de PCR con un kit de purificación de PCR. Cuantifique el ADN amplificado por PCR contra un conjunto conocido de estándares de ADN o mediante el uso de un espectrofotómetro NanoDrop. Después de una incubación durante la noche, diluya el cultivo de GBAA trasero 50 veces y prepare un cultivo separado para un control negativo.Cultive los cultivos diluidos a 30 grados centígrados agitando a 200 RPM durante una hora y 50 minutos. A continuación, enfríe todos los materiales y equipos recombinados a cuatro grados centígrados como se demostró anteriormente. Prepare una solución de 10% de peso por volumen de OSE y filtre la esterilización a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras.Cuando la OD del cultivo posterior alcance el nivel deseado, se proceda a inducir las proteínas recombinantes. Añadir 200 microlitros de la solución árabe al 10% a 10 mililitros del cultivo posterior para lograr una concentración final de aose del 0,2%Incluir un cultivo no inducido para utilizarlo como control negativo. Transfiera los cultivos a una incubadora agitadora a 37 grados centígrados e induzca la expresión roja durante 45 minutos con agitación a 230 RPM.Gire las células y lávelas con glicerol al 10% tres veces, como se muestra anteriormente a 600 a 1000 nanogramos. Cada uno de los casetes de inserción y el plásmido de subclonación para la reacción de recombinación incluye un control de solo vector y vector más un solo inserto para verificar la competencia de recombinación y la integridad del vector. A continuación, obtenga una suspensión de una sola celda y opere eléctricamente las celdas como se muestra anteriormente.Permitir la recuperación en medios LB a 37 grados Celsius durante una hora para plásmidos multicopia o en 10 lb a 37 grados Celsius durante tres horas para vectores posteriores. Completar diferentes diluciones con el cultivo recuperado en doble selección. Agar por favor y crezca a 37 grados centígrados durante 16 horas.Cuando esté listo, recoja las colonias en cinco mililitros de LB que contengan el antibiótico selectivo y crezca durante la noche a 37 grados centígrados. A continuación, utilice un kit de purificación en columna para preparar el ADN de mini preparación, introduzca la enzima de restricción adecuada y, a continuación, identifique los clones que contienen los tamaños de fragmento esperados mediante electroforesis en gel. Por último, realice la secuenciación del ADN a través de los brazos de homología y el casete de inserción para comprobar si hay errores de fotosíntesis de oli.En este ejemplo, el análisis de digestión por restricción de un inserto P dos RX one EYFP que contiene clones mostró el patrón esperado que indica que contienen el vector knockin ensamblado correctamente. Este esquema ilustra el concepto de recorte de bactas. El uso de la subclonación más el análisis de inserción de los productos de PCR confirmó que los casetes se incorporaron correctamente.Además, cuando se analizaron los clones retro positivos después de agregar la enzima de restricción adecuada, se obtuvo el patrón esperado. El análisis de digestión por restricción de 12 clones de R SR dos SBI mostró un ensamblaje vectorial correcto en la mayoría de los recombinantes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir vectores de orientación génica rápidamente utilizando la subclonación más la inserción.

subcloning-plus-insertion-spi-novel-recombineering-method-for-rapid

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Técnicas de recombinación homóloga en gran medida...

Recombinería homólogos Construcciones recombinación en<em&gt; Drosophila</em

Usando el montaje de ADN, múltiples vectores de CRISPR pueden ser construidos en paralelo en una única reacción de clonación, por lo que la construcción de un gran número de vectores de CRISPR una tarea simple. Tomate raíces peludas son un excelente sistema modelo para validar vectores de CRISPR y generar materiales mutantes.

De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

Aquí se presenta un método de edición gen rápida y eficiente basado en RMCE en el locus de AAVS1 humanas pluripotentes células madre (hPSCs) que mejora los sistemas anteriormente descritos. Usando esta técnica, líneas isogénicas se pueden generar rápida y fiable para los estudios comparativos adecuados, facilitar la investigación transgénesis mediada con hPSCs.

Generación rápida y eficiente de las células madre pluripotentes recombinante humana mediada por la recombinasa Cambio en el cassette<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada paso a paso para el montaje de construcciones multigénicos utilizando el sistema de clonación modular basado en la clonación Golden Gate. También ofrece recomendaciones sobre pasos críticos para garantizar un montaje óptimo basado en nuestras experiencias.

Montaje rápido de construcciones multigénicas mediante clonación modular Golden Gate

Este protocolo utiliza reporteros fluorescentes y clasificación celular para simplificar los experimentos en cadena en líneas de macrófagos y células T. Se utilizan dos plásmidos para estos experimentos simplificados de knock-in, a saber, un plásmido que expresa CRISPR / Cas9 y DsRed2 y un plásmido donante de recombinación homóloga que expresa EBFP2, que se integra permanentemente en el locus Rosa26 en las células inmunes.

Knock-in de genes por CRISPR/Cas9 y clasificación celular en líneas de macrófagos y células T

El virus adenoasociado recombinante (rAAV) se usa ampliamente para la administración clínica y preclínica de genes. Un uso poco apreciado de los rAAV es la transducción robusta de células cultivadas sin necesidad de purificación. Para los investigadores nuevos en rAAV, proporcionamos un protocolo para la clonación de casetes transgénicos, la producción de vectores crudos y la transducción de cultivos celulares.

Expresión de transgenes en células cultivadas utilizando vectores virales adenoasociados recombinantes no purificados

Aquí, presentamos un protocolo para obtener el vector de expresión pVAX1-PRRSV mediante la introducción de sitios de restricción adecuados en el extremo 3' de los insertos. Podemos linealizar el vector y unir fragmentos de ADN al vector uno por uno mediante la tecnología de recombinación homóloga.

Un enfoque de clonación sin fisuras para la construcción de vectores de expresión del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino

Describimos un protocolo para un método de clonación de alto rendimiento, la clonación de lanzadera basada en CRISPR (clonación CRISPRshuttle), que permite la transferencia de fragmentos de ADN de interés entre vectores sin necesidad de amplificación por PCR de los fragmentos de ADN.

Clonación de lanzadera basada en CRISPR: un método de clonación de alto rendimiento

La prueba de elevación de laberinto es una de las pruebas más utilizadas para medir la ansiedad-como el comportamiento de los ratones. A continuación, presentamos una película que muestra los procedimientos detallados para la realización de la prueba.

Laberinto elevado Plus para ratones

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

Aprende el método de subclonación más inserción (SPI) para construir vectores de targeting génico en E. coli. Esta técnica recombinera permite generar vectores personalizados en una sola reacción, acelerando la creación de modelos transgénicos.

Subclonación Plus Inserción (SPI) - Un nuevo método recombinería para la rápida construcción de la orientación de genes Vectores (Video) | JoVE Journal

Subclonación Plus Inserción (SPI) - Un nuevo método recombinería para la rápida construcción de la orientación de genes Vectores

Explorar más videos