Subclonación Plus Inserción (SPI) - Un nuevo método recombinería para la rápida construcción de la orientación de genes Vectores

El objetivo general del siguiente experimento es construir vectores de genes dirigidos utilizando la subclonación más la inserción. Esto se logra transformando la parte posterior que contiene E. coli con un plásmido recombinante. El segundo paso consiste en generar casetes de inserción fosforolados asimétricos y subclonar plásmidos mediante reacción en cadena de la polimerasa.

Tras la adición de arabinosa, se expresan las proteínas recombinantes GBAA y se electroporan el casete de inserción modificado terminal y el plásmido de subclonación. La secuencia de ADN deseada se cautiva simultáneamente desde la parte posterior y se modifica con el casete de inserción en el plásmido de subclonación. La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes, como la recombinación estándar, es que la construcción del vector de orientación génica se puede realizar en una sola reacción.

Para comenzar, diseñe oligonucleótidos para el casete de inserción y el plásmido de subclonación, diseñe cada oligonucleótido de tal manera que contenga 180 brazos de homología de pares de bases que flanquean el sitio objetivo genómico y 20 pares de bases, una secuencia de cebado específica para el casete de inserción o el plásmido de subclonación. A continuación, determine la orientación de la inserción de ADN genómico del clon posterior utilizando una herramienta basada en la web como clon db. Establezca la dirección de replicación desde o ES comprobando el mapa de la columna vertebral del plásmido posterior utilizado en la parte posterior.

Construcción de la biblioteca, agregue dos enlaces de fosfo ocho terminales, por lo que el extremo cinco primo del oligo que es opuesto a la dirección de replicación en el clon posterior. A continuación, agregue una modificación de fosfato de cinco primos al oligo inverso. En primer lugar, introduzca una punta de pipeta estéril en el cultivo de agar trasero e inocule 5,0 mililitros de caldo de avena.

Cultive el cultivo a 37 grados centígrados durante cinco horas con agitación a 200 RPM. A continuación, enfríe, solución de glicerol al 10%, microcentrífuga, tubos y electroporación, cubetas en enfriador de hielo, centrífuga grande refrigerada y microcentrífuga a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, determine la densidad óptica del cultivo utilizando un espectrofotómetro.

Medición de la absorbancia. A 600 nanómetros. Prepare las celdas electrocompetentes cuando se alcance una lectura de OD 600 de 0,3 a 0,8.

Cuando el cultivo esté listo, centrifuga las células en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Lavar las células con un mililitro de glicerol frío al 10% y volver a centrifugar. Realice estos pasos de lavado un total de tres veces.

Resuspenda las células en un volumen total de 50 microlitros y agregue de 10 a 200 nanogramos del plásmido recombinante. Obtenga una suspensión de una sola celda pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces, y luego transfiera las celdas a una electroporación de preenfriamiento. Vete. A continuación, coloque el vete en un dispositivo de electroporación y electroaccione las celdas inmediatamente, recupere las celdas en un mililitro de LB y transfiera las celdas a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Cultive el cultivo posterior a 30 grados centígrados durante dos horas con agitación a 200 RPM. Pasado este tiempo, añadir nueve mililitros de LB al cultivo recuperado. Crecer durante la noche a 30 grados centígrados con agitación a 200 RPM para incorporar los brazos de homología en el casete de inserción y el plásmido de clonación subc.

Realice la PCR utilizando los oligonucleótidos modificados largos preparados anteriormente. Alternativamente, linealice la plantilla de plásmido usando una enzima de restricción, elija una que corte fuera de la región de amplificación de PCR y esté activada por calor. Configure la PCR utilizando un sistema de ADN polimerasa de arranque en caliente de alta fidelidad.

Prepare una mezcla maestra de PCR y realice ciclos térmicos de acuerdo con las mejores prácticas. Después de la reacción, analice los productos de PCR mediante electroforesis en gel AROS. Cargue de uno a cinco microlitros de cada PCR en un gel de 1%aros.

A continuación, purifique los productos de PCR con un kit de purificación de PCR. Cuantifique el ADN amplificado por PCR contra un conjunto conocido de estándares de ADN o mediante el uso de un espectrofotómetro NanoDrop. Después de una incubación durante la noche, diluya el cultivo de GBAA trasero 50 veces y prepare un cultivo separado para un control negativo.

Cultive los cultivos diluidos a 30 grados centígrados agitando a 200 RPM durante una hora y 50 minutos. A continuación, enfríe todos los materiales y equipos recombinados a cuatro grados centígrados como se demostró anteriormente. Prepare una solución de 10% de peso por volumen de OSE y filtre la esterilización a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras.

Cuando la OD del cultivo posterior alcance el nivel deseado, se proceda a inducir las proteínas recombinantes. Añadir 200 microlitros de la solución árabe al 10% a 10 mililitros del cultivo posterior para lograr una concentración final de aose del 0,2%Incluir un cultivo no inducido para utilizarlo como control negativo. Transfiera los cultivos a una incubadora agitadora a 37 grados centígrados e induzca la expresión roja durante 45 minutos con agitación a 230 RPM.

Gire las células y lávelas con glicerol al 10% tres veces, como se muestra anteriormente a 600 a 1000 nanogramos. Cada uno de los casetes de inserción y el plásmido de subclonación para la reacción de recombinación incluye un control de solo vector y vector más un solo inserto para verificar la competencia de recombinación y la integridad del vector. A continuación, obtenga una suspensión de una sola celda y opere eléctricamente las celdas como se muestra anteriormente.

Permitir la recuperación en medios LB a 37 grados Celsius durante una hora para plásmidos multicopia o en 10 lb a 37 grados Celsius durante tres horas para vectores posteriores. Completar diferentes diluciones con el cultivo recuperado en doble selección. Agar por favor y crezca a 37 grados centígrados durante 16 horas.

Cuando esté listo, recoja las colonias en cinco mililitros de LB que contengan el antibiótico selectivo y crezca durante la noche a 37 grados centígrados. A continuación, utilice un kit de purificación en columna para preparar el ADN de mini preparación, introduzca la enzima de restricción adecuada y, a continuación, identifique los clones que contienen los tamaños de fragmento esperados mediante electroforesis en gel. Por último, realice la secuenciación del ADN a través de los brazos de homología y el casete de inserción para comprobar si hay errores de fotosíntesis de oli.

En este ejemplo, el análisis de digestión por restricción de un inserto P dos RX one EYFP que contiene clones mostró el patrón esperado que indica que contienen el vector knockin ensamblado correctamente. Este esquema ilustra el concepto de recorte de bactas. El uso de la subclonación más el análisis de inserción de los productos de PCR confirmó que los casetes se incorporaron correctamente.

Además, cuando se analizaron los clones retro positivos después de agregar la enzima de restricción adecuada, se obtuvo el patrón esperado. El análisis de digestión por restricción de 12 clones de R SR dos SBI mostró un ensamblaje vectorial correcto en la mayoría de los recombinantes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir vectores de orientación génica rápidamente utilizando la subclonación más la inserción.