Name: Un posible modelo de pez cebra de la enfermedad renal poliquística: Derribo de Wnt5a Causas Los quistes en el pez cebra Riñones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprende a generar un modelo de pez cebra de enfermedad renal poliquística mediante el derribo de wnt5a con morfolinos. Este método permite visualizar la formación de quistes renales en vivo usando microscopía de fluorescencia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el NIH (DK093625 a la LH, y DK069909 y DK047757 a JHL) y la Administración de Veteranos (Premio al Mérito I01BX000820 a JHL). Nos gustaría agradecer al Dr. Michael paquete y el Dr. Jie Él en la Universidad de Pennsylvania pez cebra Core para proporcionar un apoyo esencial.

Declaración de Ética: NOTA: Todos los experimentos de pez cebra fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en la Eastern Virginia Medical School. 1. Preparación morfolino <ol><li> Diseño y síntesis de traducción-bloqueo (aumentación) y el empalme de inhibición (Splice-) morfolino anti-sentido (MO) oligonucleótidos para el gen de interés según las instrucciones del fabricante (Figura 1A). Por favor, consulte la información del fabricante en la Tabla 1. NOTA: OM se envían como acciones liofilizados en botellas de vidrio. </li><li> Añadir alto grado agua estéril a las botellas de vidrio para volver a suspender MOS a una concentración final de 25 mg / l. Asegúrese de que el oligonucleótido se disuelva por completo. Si algunos restos sólidos, caliente el frasco que contiene la solución de oligonucleótido a 65 ° C durante 5 a 10 minutos y agitar brevemente. </li><li> La solución madre, MO en RT. No se puede almacenar a 4 ° C o -20 °; C porque las temperaturas más bajas podrían causar el oligonucleótido MO para unirse a la pared del recipiente. Medir la concentración de la solución madre usando un espectrofotómetro (véase Tabla 1) cada vez que se realiza una nueva MO solución madre. </li><li> Preparar la solución de trabajo de MO en el día de la inyección mediante la dilución de la solución madre con alto grado de agua estéril a la dosis deseada. Añadir 0,5% de rojo de fenol para alcanzar una concentración de 0,05%. Por ejemplo, para hacer que la solución de trabajo 5 l con una concentración de 15 ng / nL, agregue 3 l MO solución stock y 0,5 l 0,5% de rojo de fenol al 1,5 l de agua. NOTA: Con esta concentración de trabajo, cada gota (500 pl) de inyección contiene 7,5 ng de MO y dos gotas contiene 15 ng de MO. </li></ol> 2. Preparación del aparato de inyección <ol><li> Compra de vidrio agujas pre-tiró (véase el cuadro 1 para información detallada). Como alternativa, retire la aguja de inyección wi vidrioth un extractor de aguja. </li><li> Encienda el compresor de aire y ajustar el valor a 50 psi de presión. Encienda la fuente de luz del microscopio de disección y Pico bomba de microinyección y ajustar la configuración de la siguiente manera: mantener la presión de 20 psi, expulsar la presión de 10 psi, valor del período de 2,5 y 100 microsegundos gama de gating. </li><li> Cargar el vidrio aguja pre-desmenuzado con 5 l de la solución de inyección y colocar la aguja en una posición vertical con la punta hacia abajo. Espere hasta que toda la solución llega a la punta de la aguja sin burbujas de aire visibles. Coloque el soporte de la aguja en una posición apropiada al lado del microscopio e inserte la aguja de vidrio en el soporte. Ajuste el ángulo de inyección a 45 grados. </li><li> Llevar la punta de la aguja a la vista bajo el microscopio, alto del escenario, y se centran en la región más delgada de la punta. Rompa la punta de la aguja con unas pinzas de punta fina. </li><li> Coloque una regla y un tubo capilar con diámetro interior de 0,15 mm de lado a lado con el microscopio;inyectar la solución en un extremo del tubo capilar para hacer una columna de líquido. Ajustar el tiempo de expulsión para llegar a cada 17 gotas por la columna de líquido de longitud 1 mm, entonces el volumen de cada gota es 1 nl (volumen de la gota = π x radio de 2 x longitud (de la columna de líquido) / count (de gotas). NOTA: Una gota con un diámetro de 0,1 mm da un volumen de inyección de alrededor de 500 pl (volumen de la gota = 4/3 x π x radio de 3). </li></ol> 3. Preparación de fertilizados embriones de pez cebra y de inyección con Morpholinos <ol><li> Configure Tg (wt1b: GFP) parejas reproductoras de pez cebra transgénico de acuerdo con los protocolos publicados para la cría de peces cebra estándar y mantenimiento. Recoger los embriones después de desove natural, y mantenerlos en una placa de Petri de 10 cm llena de agua E3 (5 mM NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO4). Iniciar MO inyección de inmediato 13. Monitorear morfología del embrión bajo el microscopio y hacer la inyección segura de MO es en el de unoetapa de célula, o no más tarde de la etapa de cuatro células. <ol><li> Transferir los embriones a una placa de Petri de 10 cm con forma de cuña agar valles. Aspirar el agua E3 extra y presionar suavemente los embriones en los comederos. </li><li> Manipular los embriones con la micropipeta para visualizar embriones en estadio de 1 célula bajo el microscopio de disección. Penetrar en el corion y luego la yema para inyectar una o dos gotas de MO en la yema (1 gota = 500 pl). La transferencia de los embriones inyectados a un 10 cm placa de Petri con agua E3 y se incuba a 28,5 ° C. </li></ol></li><li> Después de las inyecciones, toma de embriones muertos y registrar el número de embriones inyectados. Cambie el agua E3 en el plato de cada 24 a 48 horas. </li></ol> 4. Experimentos fenotipo de rescate <ol><li> Seleccione un orthologue de otra especie que tiene una estructura de base par primario diferente (generalmente 3-7 pares de bases desajustes) y es, por lo tanto, resistentes a la MO, para el rescate. Por ejemplo, en este experimento, elegimosratón porque la secuencia de ratón Wnt5a ARNm es diferente de la secuencia de pez cebra. </li><li> Diseñar un conjunto de cebadores con el cebador directo comenzando en el sitio de la traducción y el cebador inverso en cerca del final de la región codificante del mRNA. Añadir una secuencia de promotor T7 en el extremo 5 &#39;final de la secuencia del cebador hacia adelante. En este experimento, se utilizaron los siguientes el primer secuencias; adelante: 5&#39;-taa tac gac tca etiqueta cta GGA cta tga tgc tgc tga agc tga a- 3 &#39;y revertir: 5&#39;-tca ctt gca gac gta CTG gtc- 3&#39;. </li><li> Realizar una reacción en cadena de polimerasa 50 l (PCR) con el conjunto de cebadores (0.5 M de cada cebador) diseñado arriba y 0.1 g de ADN plantilla que contiene la secuencia de ADNc de ratón Wnt5a con el siguiente programa de PCR: 1 ciclo a 95 ° C durante 5 min; 35 ciclos de 95 ° C (30 seg), 58,5 ° C (30 segundos), 72 ° C (1 min); y paso de extensión final a 72 ° C durante 7 minutos. </li><li> Después de terminar tél ciclo, ejecute 2 l de producto de PCR en un 1% en gel de agarosa para asegurarse de que la banda es el tamaño correcto. Se purifica el producto de PCR con un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Comprueba la concentración de ADN con un espectrofotómetro. Almacenar el producto de PCR purificado a -20 ° C o usar directamente en la transcripción de ARN tapado en la siguiente etapa. </li><li> Sintetizar in vitro capsulado ARNm con un kit de síntesis de ARN tapado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diluir el ARNm en 20 l de agua libre de RNasa y determinar la concentración. Alícuota de la ARN y almacenar a -80 ° C. </li><li> En el día de la inyección, preparar una solución de trabajo del ARNm con RNasa libre de agua estéril. Tenga en cuenta que 40 pg es generalmente la dosis ARN alta a la que no se producen efectos no específicos o tóxicos de la ARN. Mantenga la solución de trabajo en el hielo. Inyectar el embrión con MO y luego el ARNm de rescate, o co-inyectar los dos juntos. Por ejemplo, si la concentración de la prepar mRNAed en el paso 4,5 es de 0,6 mg / l, añadir 0,67 l de mRNA (0,4 g) a 4,33 l de RNasa libre de agua para hacer una concentración final de 0,08 mg / l, y luego una gota (500 pl) de cada inyección contiene 40 pg de mRNA. Preparar MO como se describe en el paso 3. </li></ol> 5. Preparación de embriones inyectados de Imagen Fluorescente <ol><li> Después de incubación a 28,5 ° CO / N, añadir 0,003% N-feniltiourea (PTU) al agua para evitar melanization E3, que afecta a la observación de la estructura pronefros mediante microscopía de fluorescencia. Sin embargo, no añada PTU antes de la gastrulación, ya que afecta el desarrollo embrionario temprano. </li><li> A las 48 HPF, dechorionate manualmente los embriones con pinzas finas. Tomar imágenes de 48 y 72 embriones HPF bajo un microscopio de disección luz. NOTA: Estas imágenes pueden ser tomadas sin anestesia. </li><li> Aproximadamente 10 min antes de la imagen bajo el microscopio de fluorescencia, anestesiar los embriones colocándolos enuna placa de Petri de 10 cm que contiene 160 mg / ml tamponada tricaína. Espere 5-10 minutos, y luego toque ligeramente el pez cebra para confirmar que no se mueven y por lo tanto la anestesia está trabajando. </li><li> Después de que los embriones son anestesiados, montarlos en el 3% de metilcelulosa y les orientan en posición prona con un microscopio de disección (por favor consulte la Tabla 1). </li><li> Observe la estructura pronefros bajo un microscopio de fluorescencia (por favor consulte la Tabla 1) y tomar fotografías a diferentes aumentos (10X y 20X). </li></ol>

<ol><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+deficiency+causes+ciliary+abnormalities+and+cystic+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys.</a> J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).</li>
<li>Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pronephros%3A+a+model+for+understanding+cystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease.</a> Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).</li>
<li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age%2C+kidney+weight%2C+and+body+surface+in+normal+man%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).</li>
<li>Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number+in+patients+with+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Nephron number in patients with primary hypertension.</a> N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).</li>
<li>Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number%2C+renal+function%2C+and+arterial+pressure+in+aged+GDNF+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice.</a> Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).</li>
<li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish%3A+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li>
<li>Igarashi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+nonmammalian+organisms+for+studies+of+kidney+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).</li>
<li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defect+in+a+novel+Nek-family+kinase+causes+cystic+kidney+disease+in+the+mouse+and+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish.</a> Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).</li>
<li>Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrocystin-4+is+required+for+pronephric+duct-dependent+cloaca+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish.</a> Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Wnt5a+in+prostate+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Wnt5a in prostate gland development.</a> Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).</li>
<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+coreceptor+Ryk+regulates+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+by+modulating+the+degradation+of+the+core+planar+cell+polarity+component+Vangl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2.</a> J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease.</a> Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La enfermedad renal poliquística (PKD) es una de las principales causas de enfermedad renal terminal en los seres humanos y se caracteriza por la progresiva formación de quistes, agrandamiento renal y desarrollo de túbulos anormal 14. PKD autosómica dominante (PQRAD) es una enfermedad genética en la que la mutación de cualquiera de PKD1, que codifica policistina-1 (PC1), o PKD2, que codifica policistina-2 (PC2), los resultados en los riñones poliquísticos. Muchos otros genes, especialmente los que codifican p...

El pez cebra (Danio rerio), los embriones se han usado ampliamente como un modelo para estudiar el desarrollo del riñón y enfermedad renal poliquística. Hay muchas ventajas en el uso del pez cebra como modelo animal: la viabilidad de estudiar las interacciones genéticas, la capacidad de utilizar morfolinos antisentido (MO) durante caída de proteínas, la oportunidad para ensayar rápidamente un gran número de embriones, y la facilidad de ver fenotipos de órganos en larvas 1 viviente. Los pronefros es el primer riñón para desarrollar en los vertebrados y es funcional en larvas de pez cebra 2. La estructura de los pronefros pez cebra es relativamente simple en comparación con los metanefros de mamíferos, la tercera y última riñón a desarrollar en los mamíferos. La nefrona es la unidad de trabajo del riñón, con cada riñón humano contiene entre 500,000-1,000,000 nefronas 3,4 y cada riñón de ratón que tiene aproximadamente 13.000 nefronas 5, por lo que es difícil de observar la estructura nefrona única in riñones humanos o de ratón. El pez cebra tiene sólo dos nefronas y cada nefrona pez cebra contiene todos los componentes principales que se encuentran en el glomérulo y los túbulos de ratones y seres humanos 6 y tipos de células renales especializados similares. En comparación con otros modelos de vertebrados tales como Xenopus, la nefrona pez cebra se asemeja más a la nefrona de mamíferos, ya que tiene un sistema cerrado 7. En los últimos años, el genoma pez cebra ha sido secuenciado, lo que permite la amplia introducción de herramientas genéticas, amplios recursos de mutantes, y colecciones de líneas transgénicas reportero en modelos de pez cebra. Las formas pronefros pez cebra entre 12 a 72 h después de la fecundación (HPF) y pueden ser visualizados fácilmente en los embriones transparentes. La proteína del tumor de Wilms WT1 es un factor esencial para el desarrollo del riñón. Líneas de pez cebra transgénicos que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor wt1b Tg (wt1b: GFP) mostrar expre GFPsión encuentra específicamente en las regiones pronéfricos en embriones de pez cebra, a partir de 17 HPF 8. Nefronoptisis (NPHP), una enfermedad renal quística autosómica recesiva, es causada por mutaciones de genes NPHP 9. NPHP4 desmontables por morfolino causó la formación de quistes en la Tg (wt1b: GFP). Peces 10 Por lo tanto, este pez transgénico es un modelo adecuado para la observación de las estructuras del riñón y formación de quistes durante el desarrollo del riñón. Es importante destacar que la influencia de moduladores de desarrollo del riñón puede ser estudiada usando esta cepa en un tiempo y mano de obra de manera eficiente. Nuestro trabajo se describe el uso de Tg (wt1b: GFP) de pescado como un modelo para visualizar la formación de quistes renales después de la modulación de genes. Utilizamos inicio y empalme de sitio antisentido OM para derribar el gen Wnt5a en el pez cebra. Wnt5a es una glicoproteína secretada no canónica de la familia Wnt que juega un papel importante en el desarrollo de diversos órganos y postnatal celularfunción 11. Wnt5a trabaja a través de vías de Wnt no canónica, incluyendo la vía de la polaridad celular planar (PCP), que se ha encontrado a desempeñar un papel en la división celular orientado durante la elongación tubular renal. Wnt5a regula la vía / PCP Wnt mediante la formación de un complejo con el receptor tirosina quinasa (Ryk), que transduce más Wnt5a de señalización mediante la formación de un complejo con la proteína de la polaridad celular planar VANGL 2 (Vangl2), promoviendo así la estabilidad Vangl2 12. Los defectos en la vía de PCP pueden resultar en la división celular aleatoria y causar la formación de quiste renal. Utilizamos la Tg (wt1b: GFP) de la línea de pez cebra para observar la formación de quistes renales tras caída Wnt5a. La Tg (wt1b: GFP) modelo de pez cebra permite obtener imágenes en vivo y la observación puntual de la estructura del riñón. Después caída Wnt5a, formación de quistes renales se encontró a partir de las 24 HPF; en 72 hpf, los quistes se pueden encontrar en los glomérulos y los túbulos proximales. Este método también podría ser usado para sotros Creen genes que podrían causar la formación de quistes renales.

<table><tbody><tr><td>0.5% Fenol-Rojo</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Indicador de color para inyección</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Genn Tools, LLC</td> <td>(personalizado)</td><td>Personalizado diseñado para el gen de interés</td></tr><tr><td>Aguja pre-tirada</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-PP</td><td>Si se requiere una gran cantidad de aguja, también puede comprar un extractor de agujas y preparar la aguja en el laboratorio</td></tr><tr><td>T7 mMessage Kit</td><td>Ambion</td><td>1344</td><td>Para la transcripción in vitro para hacer ARNm tapado para el experimento de rescate</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>Para la prevención de la melanización</td></tr><tr><td>Tricaína</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>También llamado 3-aminobenzoato de etilo, para la anestesia del pez cebra</td></tr><tr><td>Metil celulosa</td><td>Sigma</td><td>M-0387</td><td>Para la posición del pez cebra&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de purificación QIAquick PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Para la purificación de productos de PCR para la síntesis de ARN de tapa.</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>para PCR</td></tr><tr><td>Tag DNA Polymerasa</td><td>Invitrogen</td><td>10342-053</td><td>para PCR</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td>Para medir la concentración de morfolino y ARN</td></tr><tr><td>Compresor de aire</td><td>Werther International, Inc.</td><td>Panther Compact 106</td><td>Fuente de aire para inyección</td></tr><tr><td>Pico bomba de microinyección</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>PV830 Pnematic PicoPump</td><td>Se pueden utilizar otros tipos de sistemas de microinyección.</td></tr><tr><td>Micro-fabricante</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>MMJR</td><td>Diestro (MMJL para zurdos)</td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>5430-ALL</td><td>Para sujetar la aguja para la micromanipulación</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont</td><td>Herramientas quirúrgicas finas</td><td>11253-20</td><td>Para romper la punta de la aguja</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica M205C&nbsp;</td><td></td><td>Para la observación y la obtención de imágenes de embriones de pez cebra</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Zeiss Axio Obserer D1m &nbsp;</td><td></td><td>Para la obtención de imágenes de pronefros de pez cebra</td></tr><tr><td>Tubo capilar (diámetro interno de 0,15 mm)</td><td>VitroCom</td><td>CV1525Q-100</td><td>Para medir el volumen de cada gota inyectada</td></tr></tbody></table>

un posible modelo de pez cebra de la enfermedad renal poliquística: derribo de wnt5a causas los quistes en el pez cebra riñones

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

La enfermedad renal poliquística (PKD) es una de las causas más comunes de enfermedad renal terminal, una enfermedad devastadora para la que no hay cura. Los mecanismos moleculares que conducen a la formación de quistes en la PKD siguen siendo algo inciertos, pero se cree que muchos genes están involucrados. Wnt5a es una glicoproteína no canónica que regula una amplia gama de procesos de desarrollo. Wnt5a funciona a través de la vía de polaridad de células planas (PCP) que regula la división celular orientada durante la elongación de las células tubulares renales. Se ha descubierto que los defectos de la vía PCP causan la formación de quistes renales. Nuestro artículo describe un método para desarrollar un modelo de enfermedad renal quística del pez cebra mediante la eliminación del gen wnt5a con oligonucleótidos de morfolino (MO) antisentido wnt5a. Se utilizaron peces cebra transgénicos Tg (wt1b:GFP) para visualizar la estructura renal y los quistes renales después del derribo de wnt5a. Se utilizaron dos MO antisentido distintos (AUG - y sitio de empalme) y ambos dieron lugar a un fenotipo de cola rizada hacia abajo y formación de quistes después del derribo de wnt5a. La inyección de ARNm Wnt5a de ratón, resistente a los MOs debido a una diferencia en la estructura del par de bases primarias, rescató el fenotipo anormal, demostrando que el fenotipo no se debía a efectos "fuera del objetivo" del morfolino. Este trabajo apoya la validez del uso de un modelo de pez cebra para estudiar la función de wnt5a en el riñón.

Wnt5a derribar se logró mediante la introducción de traducción bloqueando MO (agosto-MO) o el exón / intrón empalme frontera MO (empalme-MO) a los embriones de pez cebra en la etapa de una célula. El AUG-MO se dirige al codón de inicio y, por lo tanto, inhibe tanto mensaje Wnt5a materna y cigóticos. El empalme de MO se dirige a la tercera sitio donador de empalme y sólo inhibe la transcripción cigóticos de Wnt5a (Figura 1A). La aumentación y morphants splice- phenocopied uno al otro co...

Describimos un método para generar un posible modelo de pez cebra de la enfermedad renal poliquística. Utilizamos peces Tg(wt1b:GFP) para visualizar la estructura del riñón. La eliminación de wnt5a se realizó mediante inyección de morfolino. Se observó la formación de quistes pronefricos después del derribo de wnt5a en este pez cebra transgénico GFP.

Un posible modelo de pez cebra de la enfermedad renal poliquística: Derribo de Wnt5a Causas Los quistes en el pez cebra Riñones

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

El objetivo general del siguiente experimento es generar un posible modelo de pez cebra de la enfermedad renal poliquística. Esto se logra inyectando morfo contra Wind five A en embriones transgénicos de pez cebra WT one BGFP en la etapa de una célula. A continuación, se realiza un experimento de rescate mediante microinyección de ratón Wint five A Mr.Nna, con el Wint five a morpho.A continuación, los embriones inyectados se anestesian y se incrustan a las 48 y 72 horas después de la fecundación para controlar la estructura renal y la formación de quistes. Después de la caída del viento cinco A, los resultados muestran que la caída del viento cinco A causa la formación de quistes renales propensos en el pez cebra transgénico WT one BG FP basado en la microscopía de fluorescencia de estructuras renales pronas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la construcción de un modelo de enfermedad renal porque la transparencia del embol de los peces cubierta con el uso de proteína fluor específica del riñón transgénico permite una visión directa de las estructuras renales en un organismo AL.Este método puede proporcionar información sobre el derribo que causa la formación de quistes renales en el pez cebra. También se puede aplicar para analizar muchos otros genes que se sospecha que causan la formación de quistes renales. Este protocolo es simple y requiere menos tiempo.Después de diseñar y sintetizar morphos de acuerdo con las instrucciones del fabricante, agregue agua estéril de alta calidad a las botellas de vidrio para resuspender completamente a una concentración final de 25 microgramos por microlitro. Use un espectrofotómetro para medir la concentración y almacene la solución madre a temperatura ambiente el día de la inyección, use agua estéril de alta calidad para diluir el morphos a la concentración deseada y al 0.5% rojo de fenol a una concentración final de 0.05%A continuación, encienda el compresor de aire y ajuste la configuración de presión a 50 si. A continuación, encienda la fuente de luz del microscopio de disección y la bomba de inyección pico micro y ajuste la configuración de la siguiente manera.Use cinco microlitros de solución inyectable para cargar una aguja de vidrio preextraída y coloque la aguja en posición vertical con la punta apuntando hacia abajo cuando no haya burbujas de aire visibles, inserte la aguja en el soporte. Ajuste el ángulo de inyección a 45 grados. Ponga la punta de la aguja a la vista bajo el microscopio, en lo alto de la platina, y concéntrese en la región más delgada de la punta.A continuación, utilice unas pinzas de punta fina para romper la aguja. Consejo, coloque un tubo capilar con un diámetro interior de 0,15 milímetros bajo el microscopio. Inyecte la solución en un extremo.Ajustar el tiempo de expulsión en la bomba de microinyección pico hasta que 17 gotas formen una columna de líquido de un milímetro de largo. Esto hace que el volumen de cada gota sea igual a un nanolitro. Establezca parejas reproductoras de pez cebra transgénico WT one BG FP de acuerdo con los protocolos publicados para la cría y el mantenimiento estándar de pez cebra.Después de un desove natural, recoja los embriones y transfiéralos a una placa de Petri con agua E tres. Usando los embriones entre la etapa de una y cuatro células, transfiéralos a una placa de Petri de 10 centímetros con canales de barrena en forma de cuña. Después de aspirar el medio, presione suavemente los embriones en los canales bajo el microscopio de disección, oriente los embriones para visualizar la célula.Luego, con la aguja de inyección, penetre el Corian y luego la yema para inyectar una o dos gotas de morpho en la yema. Transfiera los embriones inyectados a una placa de Petri de 10 centímetros con agua E tres e incube a 28,5 grados centígrados. Registre el número de embriones viables inyectados para realizar un experimento de rescate de fenotipos.Seleccione un tronco ortogonal de un gen de otra especie que tenga una estructura de par de bases primarias diferente que, por lo tanto, sea resistente al morfo. En este ejemplo, el ratón fue cinco A. Diseñe un conjunto de cebadores con el cebador directo comenzando en el sitio de inicio de traslación y el cebador inverso cerca del final de la región de código MR NA.Agregue una secuencia de promotores T siete en el extremo cinco primos de la secuencia de cebadores directos con los cebadores y un microgramo de ADN molde que contenga el viento del ratón. Cinco secuencias A-C-D-N-A. Configure una reacción de PCR de 50 microlitros y ejecútela utilizando el programa que se muestra aquí.Después de verificar el tamaño del producto de PCR, purificarlo y comprobar la concentración, utilice un kit de síntesis de ARN con tapa para sintetizar in vitro ARNm con tapa. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, use 20 microlitros de agua libre de ARN para diluir el MR NA y determine la concentración alícuota y almacene el ARN a menos 80 grados centígrados el día de la inyección. Prepare una solución de trabajo de MR NA que administre una dosis de 40 picogramos o menos para evitar efectos inespecíficos o tóxicos para el embrión.Manteniendo la solución de MNA en hielo, inyecte morfosis y luego ARNm en los embriones o coinyecte las soluciones. Al día siguiente, retire los embriones muertos y verifique que los embriones hayan pasado por gas. A continuación, añadir 0,003% de fenil THREA o PTU al agua E tres para prevenir el melón a las 48 horas después de la fecundación.Use pinzas finas para recubrir manualmente los embriones antes de usar un microscopio de disección para tomar imágenes inmediatamente y a las 72 horas después de la fertilización aproximadamente 10 minutos antes de la imagen bajo un microscopio de fluorescencia, anestesiar los embriones colocándolos en una placa de Petri de 10 centímetros que contenga 160 microgramos por microlitro de trica tamponada. Utilice 3% de metilcelulosa para montar los embriones y, bajo un microscopio de disección, orientarlos en posición prona. Luego usando una imagen de aumento de 10 veces y 20 veces.Los embriones bajo un microscopio de fluorescencia wind five A knockdown se lograron mediante la introducción de un morpho que bloquea la traducción, también llamado morpho UG o morpho de empalme de borde de introducción al exón, también llamado morpho de empalme a los embriones de pez cebra. En la etapa de una célula, el morfo A UG se dirige al codón de inicio y, por lo tanto, inhibe tanto la expresión materna como la cigótica win five a. El morph del empalme se dirige al sitio donante del tercer empalme e inhibe solo la transcripción cigótica de win five A Como se demostró aquí, el fenotipo A UG y el fenotipo de morfinas de empalme se copiaron entre sí con múltiples defectos, incluida la cola rizada, el eje corporal descendente y el edema pericárdico.Esta figura muestra que el ratón se convirtió en cinco, un ARNm rescata parcialmente el fenotipo morfo, lo que demuestra que no se debe a los efectos fuera del objetivo que se muestran aquí. El pez transgénico WT one BGFP expresa GFP impulsada por el promotor WT one B y delinea la estructura profica. Los peces mostraron formación de quistes glomerulares después del viento cinco a las 48 horas después de la fertilización.Los peces control inyectados solo con rojo fenol mostraron un desarrollo frico prono normal formando glomerular fusionado en forma de U con túbulos que se extienden lateralmente a las 72 horas después de la fertilización. Las estructuras glomerulares se desarrollaron aún más con asas vasculares y tanto los embriones inyectados con A UG como con el morfo de empalme desarrollaron quistes en los glomérulos y los tubos proximales como se ve en esta figura: tinción de HNE de las secciones histológicas transversales de 72 horas después de la fertilización, los embriones morant revelaron formación de quistes, estructuras glomerulares interrumpidas y tubos renales dilatados. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo desarrollar un posible modelo de fase gery de la enfermedad renal quística por derribo del envejecimiento del viento y observar la formación del sistema con la línea facial del informe de gripe.Una vez que se demuestre que la mutación genética da lugar a la formación de quistes renales en el pez cebra, se pueden realizar más experimentos para investigar los mecanismos detallados de la formación de quistes renales.

a-possible-zebrafish-model-polycystic-kidney-disease-knockdown-wnt5a

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

A continuación, presentamos un enfoque sistemático para desarrollar fisiológicamente relevante, sensible y...

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

El riñón adultos de pez cebra es un sistema excelente para estudios de regeneración y enfermedad renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe varios métodos que se pueden aplicar para evaluar la composición de túbulos nefrona y para evaluar la reabsorción renal.

Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

El pez cebra es un poderoso sistema modelo para la biología del desarrollo y la investigación de enfermedades humanas debido a su similitud genética con los vertebrados superiores. Este protocolo describe una metodología para crear embriones haploides de pez cebra que se pueden utilizar para estrategias de detección directa para identificar mutaciones recesivas en genes esenciales para la embriogénesis temprana.

La producción de embriones de pez cebra mediante haploide<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilización

El pez cebra es un organismo experimental excelente para estudiar los procesos de desarrollo de vertebrados y la enfermedad humana modelo. A continuación, describimos un protocolo sobre cómo realizar una pantalla manual de alto rendimiento químico en embriones de pez cebra con todo el montaje hibridación in situ (ojalá) de lectura.

Un manual de la pantalla pequeña molécula Acercarse De Alto Rendimiento Utilizando embriones de pez cebra

El pez cebra es una herramienta popular para modelar la enfermedad renal crónica (ERC). Sin embargo, su pequeño tamaño hace que sea imposible para evaluar la función renal utilizando métodos tradicionales. Se describe un ensayo de aclaramiento renal tinte fluorescente 1 que permite el análisis cuantitativo de la función renal pez cebra en la ERC.

Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

El método aquí descrito permite realizar un análisis cronológico del desarrollo de órganos en embriones de pez cebra mediante el uso de un microscopio de fluorescencia de disección capaces de realizar seccionamiento óptico y estrategias simples de reajuste para corregir la deriva focal y plana.

Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

Las lesiones renales efectuados desde nefrotóxicos, que incluyen medicamentos que van desde antibióticos a los agentes quimioterapéuticos, pueden dar lugar a trastornos complejos cuya patogénesis se conoce por completo. Este protocolo se muestra cómo el pez cebra se puede utilizar para el modelado de la enfermedad de estas condiciones, que se pueden aplicar a la identificación de medidas renoprotective.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

Este trabajo presenta un nuevo modelo in vivo de lesión renal segmentaria utilizando el pez cebra transgénico GFP de riñón. El modelo permite la inducción de la ablación específica de las células epiteliales del riñón para mostrar los mecanismos celulares de la lesión nefrona y la reparación.

Enfoque preciso de la ablación celular para modelar lesiones renales agudas en el desarrollo de pez cebra

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

Aquí, presentamos un protocolo para el desarrollo y la caracterización de un modelo de epilepsia de pez cebra resultante de la inhibición transitoria del gen DEPDC5.

Análisis conductual y fisiológico en un modelo de epilepsia de pez cebra

Este protocolo describe los procedimientos para inducir lesiones renales agudas (AKI) en peces cebra adultos utilizando cisplatino como agente nefrotoxico. Detallamos los pasos para evaluar la reproducibilidad de la técnica y dos técnicas para analizar la inflamación y la muerte celular en el tejido renal, la citometría de flujo y tunel, respectivamente.

Modelo de lesión renal aguda inducida por cisplatino en pez cebra adulto

Aprende a generar un modelo de pez cebra de enfermedad renal poliquística mediante el derribo de wnt5a con morfolinos. Este método permite visualizar la formación de quistes renales en vivo usando microscopía de fluorescencia.

Un posible modelo de pez cebra de la enfermedad renal poliquística: Derribo de Wnt5a Causas Los quistes en el pez cebra Riñones

Explorar más videos