Name: Aislamiento y Escisión de murino Aorta; Una técnica versátil en el Estudio de la Enfermedad Cardiovascular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende a aislar y escindir la aorta murina mediante perfusión con solución salina estéril fría y microscopio de disección. Este protocolo sistemático facilita estudios de enfermedades cardiovasculares y patología aórtica.

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Los autores no tienen reconocimientos.

Todos los animales procedimientos fueron realizados con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Cincinnati y de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH Publication No. 85-23, Revisado 1996). 1. Preparación del ratón <ol><li> Practicar la eutanasia mediante la exposición del animal a una dosis de anestésico supraterapéutica, isoflurano inhalado al efecto. Verifique la eutanasia primario a través pizca de pie, como un estímulo nocivo. Método secundario de la eutanasia, de corte diafragma, tendrá lugar en una próxima etapa. Los métodos alternativos pueden ser utilizados se obtiene la eutanasia sentado. </li><li> Sanitizie la superficie externa del ratón por pulverización de la piel a lo largo de la región abdominal, donde se harán los cortes iniciales, con etanol al 70% hasta el punto de humedad por lo que la piel está húmeda con etanol y los pelos sueltos / seco no entran la región. </li><li> Coloque el ratón sobre un surtablero de lógica en la posición supina con apéndices superiores e inferiores se extendió hacia el exterior. </li><li> Apéndices seguros a la junta con cinta quirúrgica. </li></ol> 2. Aislamiento del corazón y la aorta <ol><li> Después de la colocación apropiada del ratón, el uso de fórceps para localizar y aislar la piel abdominal justo por debajo de la apófisis xifoides del esternón. </li><li> Crear tensión levantando la piel hacia arriba y utilizar las tijeras para quitar la piel superficial, dejando al descubierto la parte superior del peritoneo y la parte inferior de la cavidad torácica. </li><li> Introduzca la cavidad peritoneal levantando el apéndice xifoides y la realización de incisiones laterales apenas inferiores al proceso a lo largo de los márgenes subcostal. </li><li> Diseccionar hasta la cavidad torácica, pasando a través del diafragma, asegurándose de no lacerar el corazón o cualquier principales vasos sanguíneos. </li><li> Extender las incisiones laterales hechas en el paso 2.3 cranealmente para eliminar la porción anterior de la caja torácica. Sinecesario, liberar el corazón de la pared anterior del tórax mediante disección roma. </li><li> Limpie la cavidad torácica de la sangre ajena y líquido utilizando una gasa estéril para absorber el material. Una vez que el área es más visible, retire los pulmones para exponer mejor el corazón y la aorta. </li></ol> 3. La perfusión de corazón y la aorta NOTA: Para obtener la sangre mediante punción cardíaca, hacerlo justo antes de este paso. <ol><li> Llenar una jeringa de 10 cc con 10 ml de hielo frío estéril 1x solución de tampón fosfato (PBS), y adjuntar una aguja de calibre 25 a la jeringa. </li><li> Suavemente inserte la aguja en el ventrículo izquierdo del corazón. </li><li> Cortar la aurícula derecha para aliviar la acumulación de la presión de perfusión. Perfundir el contenido de la jeringa en el ratón más de 2 - 3 minutos. </li><li> Utilice una gasa estéril en la abertura en la aurícula derecha para absorber líquido de perfusión. </li></ol> 4. El aislamiento y la escisión de la aorta <ol><li> Al término de PErfusion, utilizar una gasa estéril para absorber cualquier líquido restante enturbiamiento del campo de visión dentro de la cavidad torácica. </li><li> Exponer los contenidos gastrointestinales cortando caudalmente a través de la pared abdominal, la incisión se extiende a la zona suprapúbica. Extienda la incisión más hacia los miembros inferiores bilateralmente para crear colgajos de piel que pueden ser puestas abajo o extirpados. </li><li> Retire los lóbulos del hígado, el páncreas, el estómago, el bazo y los intestinos para visualizar mejor la aorta. Tenga cuidado cuando la disección de cerca de la región perirrenal, como la aorta es superficial en las ramas de las arterias renales. NOTA: Realice este paso en un preciso y matricularse manera como el tracto gastrointestinal es rico en bacterias que aumenta la propensión a la contaminación. </li><li> Enjuague el área con 1x PBS y retirar todo el fluido por absorción con una gasa estéril. </li><li> El uso de micro tijeras estériles y microforceps, separar la aorta dorsal de la columna vertebral y el esófago ventralmente.Lo mejor es usar una disección roma y la utilización de un microscopio de disección para esto. NOTA: En el aislamiento de la aorta, iniciar caudalmente en la bifurcación ilíaca y mover cranealmente limpieza y separación de la aorta de la superficie dorsal de la cavidad o iniciar cranealmente en las carótidas y arterias braquiocefálica de disección caudalmente. Cualquier método es apropiado y es hasta la comodidad investigadores. </li><li> Retire el tejido adiposo perivascular utilizando finas micro tijeras asegurándose de no eliminar una parte de la pared aórtica. Esto es esencial para minimizar el potencial de contaminación de fibroblastos cuando el cultivo de células del músculo liso aórtico. </li></ol>

<ol><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129 (3), 28-292 (2014).</li>
<li>Ross, R., Harker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperlipidemia+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hyperlipidemia and atherosclerosis.</a> Science. 193 (4258), 1094-1100 (1976).</li>
<li>Clouse, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+aortic+dissection%3A+population-based+incidence+compared+with+degenerative+aortic+aneurysm+rupture%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Acute aortic dissection: population-based incidence compared with degenerative aortic aneurysm rupture.</a> Mayo Clin Proc. 79 (2), 176-180 (2004).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La enfermedad aórtica puede conducir a una patología sistémica significativa y posiblemente a la muerte en casos graves. Las opciones de tratamiento son actualmente limitadas, por lo que es necesaria la investigación continua en el campo10. Los modelos murinos son ideales para estudiar más a fondo la progresión de la enfermedad y las opciones potencialmente terapéuticas4. Por lo tanto, la finalización exitosa del método descrito en este manuscrito proporcionará a los investigadores las herramientas ...

La aorta juega un papel fundamental en la función cardiovascular suministrar al cuerpo con sangre oxigenada y las porciones similares a los demás del cuerpo, es susceptible a la enfermedad. Enfermedades de la aorta comunes son la aterosclerosis y el aneurisma, que son el resultado de factores genéticos y ambientales como la dieta, el tabaquismo y el sedentarismo 1. La aterosclerosis es la deposición de calcio y una placa base de lípidos a la pared aórtica típicamente encontrado en pacientes con hiperlipidemia crónica 2. Los aneurismas se caracterizan por la degradación de los componentes estructurales de la aorta y el adelgazamiento de la pared del vaso, seguido por un aumento del diámetro lo que finalmente puede conducir a la ruptura 3. Los modelos animales son herramientas importantes utilizadas para estudiar el mecanismo de la enfermedad y la eficacia de los tratamientos potenciales. Modelos animales más comunes utilizados en la investigación cardiovascular, investigar específicamente la investigación de los trastornos vasculares y metabólicasincluir ratones modificados genéticamente para alterar los niveles de lípidos, tales como golpe de gracia gen de la apolipoproteína E y lipoproteínas de densidad baja ratones knockout del gen del receptor 4. La mayoría de los métodos para evaluar los mecanismos de la enfermedad y la eficacia de la terapia incluiría el aislamiento y la escisión de la aorta. Una vez que la aorta está localizado y aislado, el análisis morfométrico se puede determinar, como la presencia de un aneurisma, típicamente definido como un incremento mayor que 50% en el diámetro 5. Después necesario el análisis in situ es completa, la aorta se puede escindir para su posterior análisis. Una aorta extirpada puede ser congelado instantáneamente para llevar a cabo estudios moleculares, tales como proteínas y / o ensayos de expresión de genes o fijo utilizando 4% de paraformaldehído y posteriormente incrustado, se seccionaron y se tiñeron para el análisis histológico. El análisis histológico de la aorta puede mostrar las características comunes de la enfermedad aórtica, como la degradación estructural, la formación de placa, y la infiltración de leucocitos &lt;sup&gt; 6,7. Además, una aorta extirpada se puede utilizar para aislar líneas celulares primarias que incluyen células endoteliales y de músculo liso que posteriormente se pueden utilizar para una variedad de estudios in vitro 7. Actualmente, no existen otros métodos para proporcionar esta caracterización en profundidad de la enfermedad de la aorta, así como brindar a los investigadores herramientas para estudiar más a fondo la enfermedad cardiovascular. Técnicas de imagen como la resonancia magnética, tomografía computarizada y la ecografía son los métodos más cercanos para evaluar morfológicamente la aorta, sin embargo esto es difícil en pequeños animales y la obtención de un dispositivo con tecnología adecuada es caro 8. Las líneas celulares inmortalizadas se pueden comprar para investigar los mecanismos potenciales de la enfermedad y la eficacia de las terapias, sin embargo, la naturaleza artificial de estas células son limitantes en el estudio de los efectos sobre el ciclo de vida celular y la apoptosis 9. El objetivo general deeste manuscrito es demostrar el aislamiento estéril y la escisión de la aorta murino en la investigación de la enfermedad cardiovascular.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Med-Vet International</td><td>#RXISO-250</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Fisher</td><td>07-678-001</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Cinta quirúrgica</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>Gasa estéril</td><td>Dukal Corporations</td><td>1312</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 25</td><td>BD</td><td></td><td></td>305122</tr><tr><td>Jeringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y escisión de murino aorta; una técnica versátil en el estudio de la enfermedad cardiovascular

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Enfermedad cardiovascular es un término amplio que describe una enfermedad del corazón y/o de los vasos sanguíneos. El principal vaso sanguíneo que suministra sangre oxigenada al cuerpo es la aorta. La aorta puede verse afectada en enfermedades como la aterosclerosis y el aneurisma. Los investigadores que investigan estas enfermedades se beneficiarían de la observación directa de la aorta para caracterizar la progresión de la enfermedad, así como para evaluar la eficacia de posibles terapias. El objetivo de este protocolo es describir el aislamiento y la extirpación adecuados de la aorta para ayudar a los investigadores que investigan las enfermedades cardiovasculares. El aislamiento y la escisión de la aorta permiten a los investigadores observar los cambios morfométricos macroscópicos, así como preservar y teñir el tejido para observar los cambios histológicos si así lo desean. La aorta se puede utilizar para estudios moleculares para evaluar la expresión de proteínas y genes para descubrir objetivos de interés y mecanismos de acción. Esta técnica es superior a las modalidades de imagen, ya que tienen limitaciones inherentes en la tecnología y el costo. Además, las células primarias aisladas de una aorta recién aislada y extirpada pueden permitir, lo que permite a los investigadores realizar más ensayos in situ e in vitro. El aislamiento y extirpación de la aorta tiene la limitación de tener que sacrificar al animal, sin embargo, en este caso los beneficios superan al daño al ser la técnica más versátil en el estudio de la enfermedad aórtica.

Al finalizar el procedimiento, habrá una aorta intacta procedente del corazón, descendiendo en las cavidades torácica y abdominal con las arterias renales todavía conectados (Figura 1A). Desde aquí, la aorta se pueden obtener imágenes in situ para cuantificar los cambios morfométricos que son de diagnóstico en el estudio de los aneurismas aórticos abdominales (Figura 1B y 1C). Posteriormente, la aorta se puede quitar, fijadas y teñidas para observar los cambios...

La patología de la aorta puede provocar una morbilidad y mortalidad graves, por lo que se justifica la investigación de la progresión de la enfermedad y las posibles terapias. Aquí, presentamos un protocolo para aislar y extirpar la aorta murina para ayudar a los investigadores en su investigación de la enfermedad cardiovascular.

Aislamiento y Escisión de murino Aorta; Una técnica versátil en el Estudio de la Enfermedad Cardiovascular

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

El objetivo general de este procedimiento es esterilizar, aislar y extirpar la aorta murina. Esto se logra exponiendo primero la cavidad torácica y abdominal. El segundo paso es perfundir con solución salina fría y estéril.A continuación, se extirpan los órganos de las cavidades torácica y abdominal, dejando el corazón unido a la aorta. El paso final es extirpar el tejido adiposo perivascular y el tejido de advenimiento de la aorta. En última instancia, se utiliza un microscopio de disección para verificar que se extirpa todo el tejido circundante, y la aorta se puede utilizar para una variedad de análisis experimentales.Por lo tanto, esta técnica es útil para responder preguntas clave en el campo de la investigación cardiovascular, como el desarrollo de aneurismas y la formación de placas ateroscleróticas. Y así se pueden observar los cambios en la biología molecular, como la expresión de genes y proteínas. Después de sacrificar al ratón, verifique el estado de eutanasia con un pellizco en el dedo del pie.A continuación, esterilice la piel humedeciendo el pelaje abdominal con etanol al 70%. A continuación, asegure el ratón en la tabla quirúrgica en posición supina con los apéndices extendidos. Comience la cirugía usando fórceps para localizar y aislar la piel abdominal justo por debajo de la apófisis xifoides.A continuación, levanta la piel y recórtala con unas tijeras. Esto debe exponer la porción superior del peritoneo y la cavidad torácica inferior. Luego, con pinzas y tijeras, levante la apófisis xifoides y haga incisiones laterales justo inferiores a ella a lo largo de los márgenes subcostales.Para diseccionar la cavidad torácica, ingrese a través del diafragma, teniendo cuidado de no dañar el corazón o cualquier vaso principal en el proceso. Ahora se extienden cranealmente las incisiones laterales a lo largo de los márgenes subcostales. Por lo tanto, retire la porción anterior de la caja torácica.Es posible que se requiera una disección roma para extraer el corazón de la pared torácica anterior para completar estas incisiones. Ahora, con una gasa, limpie la cavidad torácica del exceso de líquidos para facilitar el acceso a los órganos. A continuación, retire los pulmones con pinzas y tijeras lóbulo por lóbulo.El corazón y la aorta deben estar completamente expuestos y de fácil acceso para recolectar sangre a través de una punción cardíaca. Haga esto ahora antes de proceder con la perfusión para perfundir el corazón, llene una jeringa de 10 cc con 10 mililitros de hielo estéril frío un XPBS. A continuación, coloque una aguja de calibre 25.Inserte con cuidado la aguja en el ventrículo izquierdo. A continuación, haga una incisión en la aurícula derecha para que no se acumule una presión excesiva en el sistema circulatorio en el siguiente paso. Ahora, durante los próximos dos o tres minutos, expulse lentamente el PBS de la jeringa hacia el corazón.Durante la eyección del PBS, use una gasa estéril para absorber el líquido que saldrá de la aurícula en la incisión. Cuando el PERFUSE eight haya sido expulsado, absorba cualquier líquido restante con una gasa que oscurezca una visión limpia de la cavidad torácica. Para exponer el contenido gastrointestinal, corte codosamente a través de la pared abdominal, extendiendo la incisión hasta el área suprapúbica.Una vez allí, corte bilateralmente hacia las extremidades inferiores para hacer un colgajo de piel, que se puede sujetar con alfileres o extirpar. Al seguir adelante, se extirpan varios órganos, los lóbulos del hígado, el páncreas, el bazo, los intestinos y la parte inferior del esófago. Esto abre la vista a la aorta.Tenga mucho cuidado al diseccionar la región de Perren, ya que hay ramas superficiales desde la aorta hasta las arterias renales en esta región. Realice esta disección con precisión y cuidado, ya que las bacterias del tracto gastrointestinal pueden contaminar los otros tejidos, enjuague el área despejada con un XPBS y absorba el exceso de solución con gasa, la aorta debe ser de fácil acceso. Entonces, con tijeras y fórceps, separe la aorta de la columna vertebral.Una disección roma es apropiada y se recomienda encarecidamente el uso de un microscopio de disección. La aorta se puede extirpar, comenzando por la aorta. Lo que importa es un proceso ordenado de limpieza y separación de los tejidos.Al diseccionar el tejido adiposo perivascular, retírelo con unas microtijeras finas para evitar daños en la pared aórtica. Esto minimiza la posibilidad de contaminación por fibroblastos al cultivar células de músculo liso aórtico. Es muy importante la extirpación cuidadosa del tejido perivascular, adiposo y adventicia.Cualquier tejido sobrante podría causar contaminación en el cultivo celular, pero también sesgar sus ensayos moleculares. Con este procedimiento, una aorta intacta que se origina en el corazón desciende a las cavidades torácica y abdominal. Con las arterias renales aún unidas, se pueden obtener imágenes de la aorta in situ para cuantificar los cambios morfométricos, que son diagnósticos en el estudio de los aneurismas de aorta abdominal.Posteriormente, la aorta se puede extirpar, fijar y teñir para observar los cambios histológicos, como con la tinción de hemat, toin y eoína, o con la tinción de ver Hoff Van Geen para observar las bandas de elastina y así ver la integridad estructural de la aorta. Las células aórticas también se pueden utilizar para el aislamiento celular primario y para estudios in vitro como estudios de viabilidad y localización de proteínas. Después del procedimiento, puede utilizar otras técnicas, como el aislamiento de proteínas y ARN, para observar la expresión de proteínas, la actividad enzimática y la expresión génica.

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Se describe una técnica en la que se trasplanta una sección de la aorta abdominal de un ratón ortotópicamente a justo por debajo de las arterias renales en un receptor alogénico o singénico. Esta técnica puede ser útil en estudios en que se considera el trasplante de las grandes arterias de tamaño uniforme ventajosa.

El trasplante ortotópico aórtica en los ratones para el Estudio de la Enfermedad Vascular

En este video, demostramos un procedimiento para la extirpación quirúrgica de la aorta de cerdos miniatura. Las células endoteliales extraídas de estas aortas aisladas pueden cultivarse posteriormente en condiciones in vitro para estudiar la coagulación y las respuestas inmunitarias.

Aislamiento de la aorta porcina: un procedimiento quirúrgico para extirpar la aorta torácica de cerdos miniatura para su análisis posterior

Describimos procedimientos para cuantificar y caracterizar lesiones ateroscleróticas en modelos de ratón utilizando el corte de precisión del seno aórtico y la aorta ascendente combinado con análisis histoquímico e inmunohistoquímico.

Análisis cuantitativo y caracterización de lesiones ateroscleróticas en el seno aórtico murino

Las células endoteliales vasculares desempeñan un papel importante en muchos trastornos cardiovasculares importantes. Este artículo describe un método simple para aislar y expandir las células endoteliales de la aorta del ratón sin usar ningún equipo especial. Nuestro protocolo proporciona un medio eficaz para identificar mecanismos en la fisiopatología de las células endoteliales.

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

El objetivo de este protocolo es demostrar las técnicas de aislamiento y cultivo de las células del músculo liso vascular primaria murino (CMLV) de la circulación coronaria. Una vez que se han aislado CMLV, que se pueden utilizar para muchas técnicas de cultivo estándar.

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

La reestenosis después de los procedimientos cardiovasculares (cirugía de bypass, angioplastia o stent) es un problema significativo que reduce la durabilidad de estos procedimientos. Una terapia ideal inhibiría la proliferación de células de músculo liso (VSMC) mientras promovía la regeneración del endotelio. Describimos un modelo para la evaluación simultánea de la proliferación VSMC y la función endotelial in vivo.

Lesión por aplastamiento aórtico murino: una eficacia<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de proliferación de células musculares lisas y función endotelial

Protocolos para el estudio de la aorta murina embrionaria y perinatal mediante análisis clonal de en vivo y asignación de destino, explantes aórticos y aislada del músculo liso células se detallan aquí. Estos diversos enfoques facilitan la investigación de la morfogénesis de la aorta embrionaria y perinatal en el desarrollo normal y la patogénesis en la enfermedad.

Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal

Aquí, presentamos un protocolo de trasplante aórtico heterotópico en ratones utilizando la técnica del manguito no sutura en un modelo de murina cervical. Este modelo se puede utilizar para estudiar la patología subyacente de la vasculopatía por aloinjerto crónico (CAV) y puede ayudar a evaluar nuevos agentes terapéuticos para prevenir su formación.

Modelo de trasplante de aórtica cervical murino utilizando una técnica de manguito no sutura modificada

Este protocolo describe modificaciones del método de Langendorff, incluida la profundidad de la canulación de la aorta para el aislamiento simultáneo de miocitos auriculares y ventriculares de ratones adultos.

Modificaciones del método de Langendorff para el aislamiento simultáneo de miocitos auriculares y ventriculares de ratones adultos

Presentamos un método para aislar células endoteliales y núcleos de la luz de arterias carótidas de ratón expuestas a condiciones de flujo estables o alteradas para realizar experimentos ómicos unicelulares.

Aislamiento de células endoteliales de la luz de arterias carótidas de ratón para experimentos multiómicos unicelulares

Este protocolo proporciona una metodología integral para el análisis cuantitativo de las placas ateroscleróticas para facilitar una investigación más profunda sobre los mecanismos y la progresión de la aterosclerosis.

Aislamiento y análisis de lesiones del arco aórtico y la raíz en un modelo de ratón aterosclerótico

Aprende a aislar y escindir la aorta murina mediante perfusión con solución salina estéril fría y microscopio de disección. Este protocolo sistemático facilita estudios de enfermedades cardiovasculares y patología aórtica.

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