Localización, identificación y Escisión de depósitos adiposos murino

Debido a la conexión drástico y negativo entre la obesidad y otras comorbilidades, la investigación sobre el papel adiposo desempeña en la enfermedad y la salud en general se justifica. Se presenta un protocolo para el aislamiento y la escisión de los depósitos de tejido adiposo que permitan el estudio de tejido adiposo usando in situ y métodos in vitro.

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la identificación y escisión del depósito adiposo para el análisis de diferentes efectos factoriales sobre y por el tejido adiposo. Esto se logra exponiendo primero los órganos internos y los depósitos adiposos de un ratón adulto. En el segundo paso, se extraen los órganos y el tejido superfluo para exponer mejor los depósitos, lo que permite la identificación de los depósitos en sus ubicaciones correspondientes.

En el paso final, se extrae el tejido adiposo con especial cuidado para evitar la contaminación. En última instancia, el aislamiento y la escisión de estos depósitos proporcionan tejido para el análisis histológico, la expresión de proteínas, la actividad enzimática y el análisis de expresión génica, así como para estudios in vitro. La principal ventaja de este protocolo en particular sobre las metodologías existentes es que permite el aislamiento de múltiples depósitos con una disección mínima, así como una contaminación mínima.

Por lo tanto, este procedimiento puede ayudar a responder preguntas sobre el campo de la obesidad. Por ejemplo, los efectos perjudiciales o incluso beneficiosos del tejido adiposo sobre las enfermedades humanas. Para aislar el tejido adiposo marrón, comience colocando un ratón adulto con etanol, limpio y eutanasiado en posición supina con la espalda contra la mesa.

Luego, use fórceps para levantar la piel justo debajo del diafragma e incida la piel con unas tijeras. Corte transversalmente alrededor de la circunferencia del ratón para exponer el peritoneo. Luego, sosteniendo los apéndices inferiores y el abdomen con una mano, tire de la piel hacia la cabeza con la otra mano para degüelle la mitad superior del ratón revelando el depósito adiposo marrón en forma de mariposa o murciélago.

A continuación, localiza el escapo y el depósito de murciélagos correspondiente. A continuación, utilice un microscopio de disección para eliminar cuidadosamente cualquier tejido adiposo blanco superficial en la parte superior de la mariposa y diseccionar la grasa marrón interescapular, teniendo cuidado de evitar cualquier músculo asociado. Para aislar el tejido subcutáneo o subq adiposo, sostenga los apéndices superiores y el tórax con una mano, y tire de la piel hacia los pies con la otra mano para degüelle la mitad inferior del ratón y revele los depósitos triangulares de subq inguinal.

A continuación, vuelva a colocar el ratón en posición supina y diseccione cuidadosamente los triángulos de grasa subq para aislar la grasa gonadal de la cavidad abdominal. Use unas tijeras para cortar el peritoneo transversalmente directamente debajo del diafragma. A continuación, corte el peritoneo desde el diafragma hasta el recto, a mitad de la corona para exponer los órganos abdominales y diseccione cuidadosamente ambos depósitos de grasa epidérmica de los testículos epi y vasa deia.

Para aislar el tejido adiposo perivascular, mantenga al animal en posición supina y extienda los apéndices superior e inferior hacia afuera. A continuación, levante la apófisis xifoides con pinzas para crear tensión en la parte superior del cuerpo y corte horizontalmente a través del diafragma, exponiendo la parte inferior de la cavidad torácica. Corta a través de la caja torácica superiormente hacia la cabeza, justo al lado del esternón, y luego levanta la caja torácica justo por debajo de la clavícula.

Corte a lo largo de la longitud inferior de la clavícula hacia la axila en ambas direcciones. La cavidad torácica y su contenido ahora deben ser claramente visibles. Una vez que el área esté limpia de líquido, corte los bronquios y los vasos adjuntos para extraer los pulmones y exponer el corazón.

Después de identificar el estómago y el esófago, corte el esófago en la unión gastroesofágica para liberar el estómago. A continuación, identifique los intestinos y el mesenterio circundante. Corta superficialmente a través del mesenterio y luego corta el colon lo más cerca posible del recto para liberar el estómago, el intestino, el colon, el páncreas y el bazo.

Cuando se hayan extirpado los órganos, se cortan las venas hepáticas y el mesenterio de conexión y se extirpan todos los lóbulos del hígado. Corta la capa visceral y la grasa que rodea los riñones, dejando los riñones unidos a la aorta in vivo para que sirvan como marcadores geográficos para los diferentes segmentos de la aorta. Luego, cuando el área alrededor de los riñones esté despejada, use microtijeras y micropinzas para separar la aorta de su unión dorsal a la columna vertebral y su unión ventral al esófago.

En el tórax, siga y separe la aorta desde su origen en el corazón hasta la bifurcación en la región ilíaca. Para aislar el tejido adiposo aórtico, en este punto, se pueden identificar los vasos subclavios. Aísle estos vasos desde el cuello hasta la raíz aórtica para exponer mejor la unión aórtica y la raíz en el corazón.

A continuación, se extirpa el timo y se corta la braquiocefálica, la carótida común izquierda y la subclavia izquierda para permitir el movimiento del corazón. Por último, use un microscopio de disección para ver el tejido adiposo perivascular o la capa P VVA T que rodea la aorta. A continuación, utilice micropinzas para separar suavemente el tejido de la aorta y microtijeras para cortar suavemente la unión del PVAT a la aorta empezando por la región torácica, justo por encima de donde se encuentra el diafragma.

A continuación, utilice micropinzas para separar suavemente el tejido de la aorta y microtijeras para cortar suavemente la unión del PVAT a la aorta, empezando por la región torácica justo superior a donde se encuentra el diafragma. Repita este proceso a lo largo de toda la aorta terminando en la región aórtica infrarrenal, situada justo por encima de la bifurcación ilíaca del vaso aórtico e inferior a las ramas renales murciélago. Y las muestras se pueden diferenciar por análisis histológico con tinción h y e, líneas celulares primarias de adipocitos subcutáneos y perivasculares.

A continuación, los adipocitos se pueden cultivar y diferenciar de preadipocitos a adipocitos para el análisis de microarrays. En estas imágenes representativas, por ejemplo, se confirmó la conversión de preadipocitos cultivados en adipocitos con tinción de rojo O con rojo aceite, los adipocitos aislados, cultivados y diferenciados por este método se pueden utilizar para análisis posteriores in vitro. En este experimento representativo, se observó que la actividad enzimática de MM P dos disminuyó en los adipocitos perivasculares aislados en respuesta a un tratamiento experimental en comparación con los controles no tratados.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar cambiar los guantes y limpiar los instrumentos con frecuencia para minimizar la contaminación. Por lo tanto, después de recolectar estos tejidos, se pueden realizar una variedad de procedimientos en ellos. Por ejemplo, el cultivo celular, el análisis histológico, la medición de proteínas e incluso la expresión génica.

Y luego esos resultados se pueden usar para ayudar a comprender la relación, las similitudes y diferencias entre los diferentes depósitos.