Producción y focalización de monovalente Quantum Dots

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un protocolo fácil y generalizable para la preparación de puntos cuánticos monovalentes para la obtención de imágenes de una sola molécula de proteínas de membrana diana en células vivas. Esto se logra introduciendo primero una cantidad estequiométrica de un ligando largo de polifosfooligonucleótido en un punto cuántico. El ADN largo envuelve completamente el punto cuántico y evita la unión de una segunda molécula de ADN, generando así puntos cuánticos monovalentes de forma exclusiva y cuantitativa. Separadamente.

Benzo guine funcionalizada, con secuencias complementarias que llevan ADN, está preparada para dirigirse a proteínas de membrana marcadas con snap expresadas en células vivas. A continuación, el tratamiento secuencial de células vivas que expresan proteínas de membrana marcadas con benzoguina, ADN, seguidas de puntos cuánticos monovalentes conduce al marcaje selectivo del receptor objetivo. El paso final es obtener imágenes de la distribución y las trayectorias de difusión de la proteína objetivo mediante microscopía de fluorescencia de molécula única.

En última instancia, se extrae información espacio-temporal dinámica en tiempo real de las proteínas diana en células vivas para revelar cómo funcionan las moléculas diana in vivo. La principal ventaja de este enfoque para sintetizar puntos cuánticos monovalentes es su simplicidad y accesibilidad general. A diferencia de muchos otros enfoques que requieren habilidades o equipos especiales, este enfoque es relativamente sencillo.

En consecuencia, debería estar disponible para cualquier laboratorio y para cualquier disciplina. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando Zeva y yo comenzamos a discutir cómo se podría combinar nuestra experiencia en la síntesis de nanopartículas de ADN para controlar mejor la reactividad de las nanopartículas. Llevamos a cabo los experimentos del principio de aprobación inicial juntos durante un fin de semana.

Cada vez más, nuestra primera prueba funcionó con éxito. En este vídeo, utilizamos puntos cuánticos monovalentes para estudiar la dinámica de una sola partícula del receptor notch en células vivas de mamíferos. Sin embargo, estos puntos cuánticos monovalentes deberían ser de gran utilidad para cualquier estudio que requiera el seguimiento de una sola partícula.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no todos los puntos cuánticos disponibles comercialmente son iguales, ya sea geométrica o químicamente. Por lo tanto, se requerirá cierta optimización. La demostración visual de este método es fundamental en la transferencia de fase y los pasos de adición de ADN relacionados con el fósforo I podrían ser intimidantes para un laboratorio sin experiencia en química multisintética.

Para empezar, diluya 200 microlitros de una solución de un micromolar de puntos cuánticos en fase orgánica con 400 microlitros de cloroformo en un frasco de vidrio de cinco mililitros. Combine estos puntos cuánticos con una mezcla de 400 microlitros de solución de cloroformo de bromuro de tetra butil amonio 0,3 molar y 36 microlitros de pec thiol puro y agite durante la noche. A continuación, añadir 800 microlitros de una solución acuosa de hidróxido de sodio 0,2 molar y agitar durante 30 segundos.

Una transferencia de fase ocurre en unos pocos minutos, indicada por la transferencia de las partículas coloreadas a la fase acuosa por encima de la fase orgánica más densa. Si las partículas se agregan en una tercera fase entre la fase acuosa y la orgánica, aumente el tiempo de incubación con el dial pectoral. Si la fase acuosa permanece clara, los puntos cuánticos no se transfirieron en fase.

Aumente la concentración de pec dial para aliviar la mala transferencia de fase. A continuación, recupera la fase acuosa coloreada. A continuación, concentra los puntos cuánticos recogidos con la columna de espín de racon en un mililitro.

Añadir la solución concentrada de puntos cuánticos en una columna cidex NEP 10 pree equilibrada con 10 milimolares de tampón tris que contenga 30 milimolares de cloruro de sodio. pH ocho eluir los puntos cuánticos con 1,5 mililitros de tampón de elución por flujo de gravedad. Proceda a medir la concentración de puntos cuánticos con espectroscopía de absorción a 350 nanómetros.

Para preparar un ADN monovalente de puntos cuánticos dirigidos, compre o sintetice el ADN de fosfo ocho, prepare un mililitro de solución de puntos cuánticos de 100 ano molares en un tampón tris de 10 milimolares que contiene cloruro de sodio de 30 milimolares pH ocho. A continuación, agregue 500 microlitros de la solución de 100 nanomolares phospho IO eight DNA. Gota a gota hasta los puntos cuánticos acuosos durante un minuto mientras se agita vigorosamente.

Revuelva o coloque la mezcla en una coctelera durante nueve horas más. Retire aproximadamente 10 microlitros de la mezcla de puntos cuánticos para ejecutarla en un gel agros analítico. Además, elimine una concentración similar de puntos cuánticos no conjugados en fase acuosa.

Luego, a aproximadamente dos microlitros de seis x fi llamar tampón de carga para aumentar la densidad de la solución. Ejecute estas dos muestras juntas en un gel AROS de 0,8% de volumen de peso en tampón de bido de sodio durante 15 minutos a 150 voltios. El resultado debe ser una sola banda en el carril de control no conjugado que migre cerca del pozo y dos bandas en el carril con puntos cuánticos conjugados.

Calcula la fracción de puntos cuánticos no conjugados utilizando la intensidad relativa de las dos bandas. Luego use esa fracción para calcular el volumen adicional de 100 nanomolares de fosfo ocho solución de ADN requerido para que coincida con el número de puntos cuánticos cuánticos. Repita el procedimiento una vez más con este volumen calculado o hasta que los puntos cuánticos conjugados colapsen en una sola banda en el gel, lo que indica la conjugación completa de todos los puntos cuánticos.

A continuación, añade 100 microlitros de carboxi de 10 milimolares. Conecte el tiol de seis alcanos a los puntos cuánticos dirigidos monovalentes conjugados y agite durante 10 minutos. Para eliminar el exceso de alcano, agregue 0,5 mililitros de la solución de puntos cuánticos a ACE fitex knap de cinco columnas preequilibradas con tampón elucian.

A continuación, recoja los puntos cuánticos monovalentes dirigidos con un mililitro de tampón elu por flujo de gravedad. Concentre los puntos cuánticos recolectados con una columna de espín céntrica. Estos puntos cuánticos monovalentes dirigidos pueden almacenarse a cuatro grados centígrados por mes, comiendo los puntos cuánticos monovalentes justo antes de un experimento de imagen utilizando reactivos como caseína o células de placa de albúmina de suero bovino que expresan la proteína snap tagg en reflexión interna total, fluorescencia o vidrio de calidad de césped.

En este experimento en particular, utilizamos una línea celular U2 OS que expresa un receptor de muesca y superficies de vidrio de alta calidad después de que las células se hayan adherido al vidrio, retiramos el medio de crecimiento y lavamos con solución salina tamponada con fosfato o PBS. Luego incubar las células durante 10 a 30 minutos a temperatura ambiente en PBS o medios celulares que contengan ADN de benzoilguina, preparados como se detalla en el protocolo de texto después de la incubación con benzo Guin, ADN, lavar cuidadosamente las células con PBS o medios celulares, luego incubar las células durante aproximadamente cinco a 10 minutos con los puntos cuánticos monovalentes. Lave los puntos cuánticos monovalentes no unidos y devuelva las células a un tampón o medio adecuado tanto para la obtención de imágenes como para la imagen de cultivo.

Las células que utilizan un microscopio de césped debido al brillo de los puntos cuánticos monovalentes recogen imágenes a altas velocidades de fotogramas en el césped mientras obtienen imágenes del lado basal de una célula viva. Una vez que los puntos cuánticos están recubiertos con el ADN cargado negativamente, deben migrar en un gel por separado de los puntos cuánticos no rappeados utilizando una alícuota de puntos cuánticos sin envolver como control. Debería aparecer una segunda banda de migración más rápida tras la adición del Phosphol IO eight DN. Se demuestra una formación completa de los puntos cuánticos monovalentes con la pérdida de la banda inmóvil y su colapso en la banda móvil.

Si una alícuota del producto de puntos cuánticos monovalentes migra como una sola banda separable de los puntos cuánticos no envueltos, entonces los puntos cuánticos son realmente monovalentes y están listos para ser utilizados en pasos posteriores. Aquí se muestra un etiquetado representativo de las células que expresan una construcción de cereza M de muesca instantánea a varias concentraciones de puntos cuánticos monovalentes. Puntos cuánticos monovalentes pasivados con PEG 12 colocalizados con cereza M que indican un etiquetado específico.

Por lo general, son preferibles densidades de etiquetado más bajas para el seguimiento de una sola partícula. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar una nanopartícula fluorescente que sea brillante, modular, monovalente y dirigida Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos datos: preparación de los puntos cuánticos monovalentes y etiquetado de fotocélulas en una hora, si se realiza correctamente. Es importante recordar que, utilizando reactivos de partida disponibles en el mercado, podemos producir puntos cuánticos monovalentes con excelentes propiedades fotofísicas que se pueden utilizar para experimentos largos de seguimiento de una sola partícula.

Siguiendo este procedimiento, otras proteínas pueden marcarse con fusiones de etiquetas instantáneas para seguir su dinámica molecular en células vivas. Trabajar con puntos cuánticos puede ser extremadamente difícil de quitar el polvo, así que no olvide usar guantes de gafas de seguridad y batas de laboratorio mientras realiza este procedimiento.