Análisis de la especificidad de la proteína lisina metiltransferasas Usando SPOT Péptido Arrays

El objetivo general del siguiente experimento es investigar la especificidad del sustrato de las proteínas lisina metiltransferasas o PK mts. Esto se logra mediante la identificación de un sustrato inicial y la preparación de matrices de péptidos con varias variantes de este sustrato que contienen intercambios de aminoácidos individuales en diferentes posiciones. Como segundo paso, la matriz de péptidos se incuba con el PKMT en presencia de un donante de grupo metilo radiactivo, lo que permite la detección de la metilación del péptido mediante la transferencia de radiactividad al punto peptídico correspondiente.

A continuación, el array se expone a una película de rayos X y se analiza cuantitativamente para determinar la actividad de metilación en cada uno de los péptidos. Y para definir el perfil de especificidad del PKMT, los resultados muestran qué aminoácidos en el péptido sustrato son críticos para su metilación por el PKMT. La principal ventaja de esta técnica o de los métodos existentes, como la metilación de péptidos individuales, es que se pueden probar varios péptidos diferentes en un experimento de manera rentable.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metilación de proteínas lym, como la especificación de nuevos sustratos previamente desconocidos de PK mtss. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la especificidad de PK mts. También se puede aplicar a otros sistemas como proteínas quinasas, otro método de proteínas, transferasas, o agregar a transferasas.

Tuve la idea de este método por primera vez cuando me familiaricé con la posibilidad de preparar grandes matrices de péptidos personalizadas a costos razonables utilizando la síntesis de puntos peptídicos. Para comenzar este procedimiento, diseñe secuencias de péptidos para la síntesis utilizando el software multi pep spotter. Ingrese las secuencias peptídicas como un código de una sola letra con cada letra definiendo el aminoácido específico después de este pre hinchamiento, la membrana puntual funcionalizada de amino peg en el extremo, dimetilformamida final o DMF durante 10 minutos. Cuando termine, coloque la membrana húmeda en el marco del sintetizador sin burbujas de aire ni arrugas.

Seque completamente la membrana durante al menos 10 minutos antes de iniciar el programa de síntesis. Lave la membrana tres veces con etanol al 100% para generar el enlace amida con el grupo amino libre en la membrana. Active el grupo carboxilo del aminoácido entrante agregando DIC y acetato de etilo hidroxi amino sino al derivado del aminoácido.

Después de la activación, detecte los volúmenes deseados de aminoácidos activados en la membrana funcionalizada con clavija de aminoácidos utilizando el robot programable. Repita el paso anterior tres veces para asegurar un mejor acoplamiento del primer aminoácido activado. Después de incubar la membrana durante 20 minutos, lávela con DMF para eliminar los aminoácidos desacoplados después de secar y bloquear los grupos amino libres.

Lave la membrana con DMF cuatro veces y luego incube con 20% de piperina en DMF durante 20 minutos para eliminar el grupo protector de FM. Después de lavar y secar la membrana, repita los pasos de eliminación de manchas y F MOC hasta alcanzar la longitud de péptido deseada. Después de la última protección F MOC grupo D, lave la membrana con DMF y etanol al 100%.

A continuación, trate la membrana con azul de fenol al 0,02% de bromo en DMF durante un mínimo de cinco minutos hasta que se vuelva completamente azul. Después de lavar y secar la membrana, retírala del sintetizador y colócala en una caja resistente a los productos químicos. Trátelo con 20 a 25 mililitros de una mezcla de protección D de cadena lateral, que consiste en un 95% de ácido tricloroacético para escindir los grupos protectores de la cadena lateral y reactivos eliminadores para proteger las cadenas laterales de aminoácidos de la modificación.

Después de asegurarse de que la mezcla de protección profunda cubre la membrana, cierre completamente la caja e incube durante una o dos horas mientras agita suavemente después de la incubación. Lave la membrana seis veces con 20 a 25 mililitros de diclorometano durante dos minutos cada una. Después de lavar dos veces con etanol al 100%, seque la membrana en un desecado durante la noche.

A continuación, preincube la membrana de la matriz de péptidos en una bolsa de plástico sellada que contenga el respectivo tampón de metilación sin enzima y amet con grupo metilo marcado radiactivamente Durante 10 minutos, deseche el tampón de preincubación e incube la membrana en ocho mililitros de tampón de metilación que contenga el PKMT respectivo durante una o dos horas. Después de esto, deseche el tampón de metilación en un contenedor de desechos radiactivos y lave las matrices de péptidos cinco veces con 20 mililitros de tampón que contenga 100 milimolares de bicarbonato de amonio y 1% STS durante cinco minutos para eliminar la proteína unida. Después de desechar el último tampón de lavado en el contenedor de residuos radiactivos, incubar la membrana durante cinco minutos en 10 mililitros de solución amplificada.

A continuación, deseche la solución amplificada en el contenedor de residuos radiactivos para disolventes orgánicos. Selle la matriz de péptidos en una bolsa de plástico y colóquela en un casete de radiografía para automóviles. Coloque la película de autorradiografía sobre el péptido en una habitación oscura.

A continuación, cierre el casete con cuidado. Después de exponer la película a menos 80 grados centígrados, revele para analizar los resultados. Finalmente, capture la imagen un par de veces con diferentes tiempos de exposición para evitar la saturación de sustratos de péptidos fuertemente metilados.

Aquí se muestra un ejemplo de una reacción de metilación de una matriz de péptidos con NSD uno. El eje horizontal representa la secuencia del péptido y en la dirección vertical. El aminoácido alterado se indica metilación con nsd, uno muestra que actúa específicamente sobre H tres K 36 y reconoce tres a cuatro residuos de aminoácidos a cada lado de la consolidación de lisina objetivo de los tres experimentos de la matriz de péptidos de NSD uno se muestra aquí.

Alrededor del 85% de los péptidos muestran desviaciones estándar menores que más o menos 20% y más del 97% de los péptidos muestran desviaciones estándar menores que más o menos 30%Los datos del factor de discriminación calculados muestran que NSD uno prefiere los residuos aromáticos en la posición menos dos. En los sitios menos uno y más dos, prefiere los residuos hidrofóbicos. Y en el sitio más uno, hay una preferencia por la arginina, la lisina, la glutamina o la asparagina.

Se pueden encontrar nuevos sustratos peptídicos potenciales mediante búsquedas en bases de datos del proteoma humano. La fuerte metilación de algunos de estos péptidos con ome confirma su identidad como nuevos sustratos de péptidos NSD uno. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar el sustrato inicial más adecuado siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como la metilación de las proteínas correspondientes in vitro y en células para averiguar si las proteínas son aceptadas como sustratos, así como después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la mesilación de proteínas lisina, definieran la especificidad del sustrato de muchos PK mts e identificaran varios sustratos nuevos. Esto ayudó a comprender la importante función biológica de los PK mts.

No olvide que trabajar con radiactividad y solventes orgánicos en la síntesis de péptidos puede ser afirmativo, y siempre se deben tomar las precauciones adecuadas al realizar este procedimiento.