Internalización y Observación de fluorescente Biomoléculas en microorganismos que viven a través de electroporación

El objetivo de este procedimiento es interiorizar y visualizar biomoléculas como el ADN o proteínas marcadas con flúor orgánico dentro de microorganismos vivos mediante un método basado en la electroporación. Esto se logra incubando primero células electrocompetentes con biomoléculas marcadas con fluorescencia antes de transferirlas a un vehículo de electroporación. Al aplicar un alto voltaje a través de la veta, las formaciones transitorias de poros tanto en la pared celular como en la membrana celular permitirán la difusión biomolecular en las células.

A continuación, las células se incuban en un medio rico para permitir que se recuperen antes de que se elimine el exceso de biomoléculas no internalizadas. Finalmente, las células se transfieren a una almohadilla de baja fluorescencia y nutrientes mínimos, y luego se superpone una cubierta de vidrio en la parte superior para formar un sándwich agrícola de vidrio. En última instancia, la microscopía de esencia se utiliza para analizar la ubicación, el patrón de difusión y las propiedades dinámicas de las biomoléculas marcadas dentro de las células vivas.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de las limitaciones de la obtención de imágenes de células vivas. Debido a la rápida falla de las proteínas fotofluorescentes como la GFP, razonamos que al cargar células vivas con biomoléculas marcadas con fuerza fluorada orgánica, trasplantaríamos microorganismos vivos. Las principales ventajas de esta fuerza son el brillo, la fotoestabilidad y el tamaño pequeño.

Luego esperamos seguir la localización y difusión del ADN o las proteínas en sus entornos nativos en escalas de tiempo mucho más largas, que coincidirían con muchos procesos biológicos importantes. La principal ventaja de estas técnicas sobre los métodos existentes, como la microinyección, es que también se puede aplicar a microorganismos que son más pequeños que el diámetro de una aguja de microinyección típica. Una ventaja adicional de la electroporación es que se puede cargar un gran número de células al mismo tiempo con biomoléculas fluorescentes y visualizarlas en paralelo, lo que hace que la electroporación sea una técnica de rendimiento visual particular.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la difusión y el comportamiento dinámico de las biomoléculas marcadas con fluorescencia in vivo, también se puede aplicar en otros contextos, como las biomoléculas de electrodos que no están marcadas, pero puede, por ejemplo, desencadenar una respuesta fisiológica cuando la célula la internaliza. Para construir almohadillas aros para bacterias o microscopía fluorescente de levadura, comience preparando unos dos medios de baja fluorescencia, A continuación, derrita rápidamente una solución de 2%aros en agua destilada con un microondas de laboratorio. Agregue un volumen correspondiente de la rosa de AH caliente al medio y pipetee suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo. Para evitar la formación de burbujas, pipetee inmediatamente aproximadamente 200 microlitros de la mezcla obtenida en un cubreobjetos de microscopio de tamaño estándar.

Deje el cubreobjetos en el banco durante un minuto a temperatura ambiente hasta que el gel se solidifique o hasta que el gel se solidifique o hasta que se almacene temporalmente, coloque un segundo cubreobjetos limpio sobre la almohadilla fresca y aplique suavemente presión desde la parte superior hasta el frasco en la rosa de huevo, comenzando con un stock de biomoléculas fluorescentes preparadas en un tampón de baja fuerza iónica. Transfiera hasta cinco microlitros de las biomoléculas a una alícuota de 20 microlitros de bacterias competentes o 50 microlitros de células de levadura competentes. La cantidad de biomoléculas fluorescentes incubadas con las células se correlaciona directamente con la cantidad de biomoléculas internalizadas por célula.

Después de la electroporación, incube la mezcla en hielo durante un máximo de 10 minutos. Al mismo tiempo, seleccione una veta de electroporación con un espaciado de electrodos adecuado y enfríe con hielo. Transfiera la mezcla de celdas a la veta preenfriada.

Golpee suavemente el vete unas cuantas veces para eliminar las burbujas de la solución. Retire la humedad del vete con una toalla de papel y colóquelo en el electro ator. Aplique un pulso de alto voltaje a las celdas justo después de este proceso.

Verifique que la constante de tiempo que se muestra en el electro ador esté entre cuatro y seis milisegundos. Las constantes de tiempo más bajas a menudo se deben a la presencia de exceso de sal o burbujas dentro de la qve, y pueden disminuir o inhibir completamente la absorción de biomoléculas en las células. Los pulsos de voltaje más altos mejoran la carga de la celda, pero también pueden afectar la viabilidad de la celda inmediatamente después de la electroporación.

Agregue 500 microlitros de medios enriquecidos y transfiera las células a un tubo nuevo de 1,5 mililitros. Deje que la membrana celular se recupere incubando las bacterias a 37 grados centígrados o la levadura a 29 grados centígrados durante dos a 10 minutos. Después de la incorporación de la biomolécula y la recuperación del crecimiento, gire las células durante un minuto en una centrífuga preenfriada de cuatro grados centígrados y deseche el agente supino Reese.

Suspenda el pellet en 500 microlitros de tampón y repita los procesos de centrifugado y remoción y suspensión del tampón. Tres veces más. Estos pasos de lavado eliminarán todos los rastros de biomoléculas no internalizadas de la suspensión celular.

En el caso de la internalización de proteínas marcadas y la purificación adicional, el paso se realiza pipeteando la suspensión celular en un tubo de 1,5 mililitros equipado con un filtro de membrana de 0,22 micras en la parte superior. Separe las celdas del tampón mediante centrifugación mientras se asegura de que quede suficiente líquido por encima del filtro para evitar que las celdas se sequen y desechen la fracción de flujo a través. Debajo del filtro, agregue 500 microlitros de PBS fresco sobre las celdas y repita la combinación de un giro hacia abajo seguido de una edición de PBS fresco.

Dos veces más. Realiza un último giro a 3.300 g durante un minuto. Para eliminar el lavado anterior de PBS, vuelva a suspender las celdas con 150 microlitros de PBS.

Por último, retira el cubreobjetos superior de la almohadilla aros previamente hecha. Cargue las celdas en la almohadilla pipeteando 10 microlitros de la suspensión de celdas gota a gota. Después de colocar un nuevo cubreobjetos limpio en la parte superior de la almohadilla levantada, las células sándwich ahora están listas para la microscopía fluorescente.

Los controles negativos, como los controles no clasificados, que se han incubado con biomoléculas marcadas o las células vacías, que no han sido electroclasificadas ni incubadas, también deben prepararse en paralelo con las muestras cargadas, las células cargadas se pueden obtener en cualquier microscopio de fluorescencia adecuado. Mientras que el modo de imagen de campo amplio permite la obtención de imágenes y el análisis a nivel de célula, césped o alta iluminación baja u óptimo para la observación y el seguimiento de una sola molécula. Para evitar el fotoblanqueo excesivo de las biomoléculas, asegúrese de que todas las iluminaciones láser del escenario estén apagadas o bloqueadas con un filtro opaco antes de cargar la muestra.

Además, apague la ganancia de la cámara E-M-C-C-G para evitar daños por sobreexposición a la cámara. Para una configuración de microscopio invertido, coloque el sándwich de almohadilla Aris en la platina del microscopio con el lado cubierto de la célula hacia abajo, hacia el objetivo inferior. Luego, encienda la luz halógena de la parte superior y enfoque las células en el modo de microscopía de luz blanca transmitida antes de encender el láser, tome una fotografía de las células en el modo de transmisión de luz blanca.

Esta foto se utilizará como un mapa de referencia posicional que correlacionará las regiones de fluorescencia biomolecular con las ubicaciones reales de las células dentro del mismo campo de visión. Para la medición de la viabilidad, utilice un calentador de objetivo ajustado a la temperatura óptima y grabe imágenes secuenciales del mismo campo de visión bajo iluminación de luz blanca cada 30 minutos sin mover la platina, apague la iluminación superior superior y proteja su muestra de todas las demás fuentes de luz ambiental en el laboratorio. A continuación, encienda la cámara CCD y comience la adquisición de datos.

Comience a registrar el ion fluorescente justo antes de encender la iluminación láser. Después de realizar la microscopía fluorescente, comience el análisis de datos abriendo todas las fotografías con un software de procesamiento de imágenes como Image J para comenzar a normalizar todos los parámetros fundamentales de la imagen, como el brillo o el contraste en todas las imágenes, presionando el botón de configuración y seleccione el propagar a todas las demás imágenes. La opción uno puede determinar cualitativamente si la carga de la celda fue exitosa, ya que las celdas cargadas deben ser significativamente más brillantes que las celdas no electroporadas utilizadas como control negativo para una imagen dada.

Utilice la herramienta de selección a mano alzada y rodee diferentes regiones de fluorescencia con polígonos dibujados a mano. Compare la intensidad de fluorescencia entre todos los polígonos pertinentes eligiendo la opción de medición en el menú de análisis. Repita este proceso manualmente o mediante un script automatizado para extraer la intensidad por píxel de todas las celdas de cada muestra y controles negativos.

Cuando una célula electro clasificada está cargada con una o varias biomoléculas fluorescentes, su intensidad de emisión media será mayor que la intensidad media de una muestra de control negativa. Para evaluar la viabilidad de las células, cuente manualmente el porcentaje de células que se dividen intactas por las células que no se dividen y las células dañadas. En el mismo campo de visión para el que se registraron datos cada 30 minutos a lo largo de varias divisiones, no siempre es posible contar directamente el número de biomoléculas internalizadas por célula, especialmente cuando las biomoléculas se difunden rápidamente o cuando las células están cargadas con más de cinco biomoléculas marcadas.

El análisis de fotoblanqueo celular permite evaluar el número de biomoléculas marcadas por célula en tales condiciones. Usando el botón de selección a mano alzada, trace el contorno de una célula fluorescente dada y extraiga y trace la fluorescencia de la célula en bruto en función del tiempo debido a los efectos de fotoblanqueo. El gráfico de intensidad frente al tiempo será una curva exponencialmente decreciente, las células muy cargadas, pero para las células que contienen menos de 10 biomoléculas, se deben distinguir pasos claros.

Calcule la autofluorescencia promedio después del fotoblanqueo promediando los valores brutos de intensidad fluorescente cerca de la parte del extremo de la cola plana del experimento, que podría ser, por ejemplo, de los últimos 50 a 100 fotogramas de imagen en la serie de lapso de tiempo. Después de determinar la intensidad de referencia también, calcule la intensidad del fotoblanqueo dependiente del tiempo restando la autofluorescencia de referencia de los datos de fluorescencia sin procesar, luego bloquee los datos de intensidad de fotoblanqueo resultantes y cuantifique la altura de cada paso manualmente o utilizando un algoritmo. Este proceso debe repetirse para varias celdas que exhiban más de 100 pasos en total para obtener una estimación precisa de la altura promedio del paso, este valor corresponde a la intensidad unitaria de fluoro cuatro debido al blanqueo de un solo fluoro cuatro.

Finalmente, el número de moléculas internalizadas por célula se puede calcular dividiendo la intensidad celular resta de referencia en el tiempo igual a cero por el fluoro unitario. Cuatro intensidades para este protocolo de electroporación. La cantidad de ADN o proteína marcada con fluorescencia que puede internalizarse en bacterias o levaduras se puede controlar ajustando la cantidad de sondas de ADN presentes dentro del tampón de electroporación.

Cuando la tasa de internalización biomolecular es alta, el tiempo de vida del fotoblanqueo de la biomolécula marcada, que se puede encontrar trazando primero la intensidad fluorescente en función del tiempo y luego extrayendo su constante de tiempo exponencial, proporciona información sobre la fotoestabilidad de los tintes in vivo. En el caso de bajas tasas de incorporación, la cuantificación de la intensidad fluorescente proporcionará un medio para aproximar el número total de biomoléculas dentro de una célula dada. La electroporación también se puede utilizar para incorporar proteínas en bacterias o levaduras.

En el caso de la proteína marcada con fluorescencia. Dado que los fluoróforos libres en sí mismos pueden internalizarse de manera muy eficiente, es importante eliminar todo el exceso de fluoróforos libres y no unidos covalentemente del stock de proteínas. Por último, las moléculas doblemente marcadas también pueden internalizarse utilizando nuestro método para permitir la observación de los trastes de una sola molécula en células vivas durante varios segundos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que también debe preparar y analizar las muestras de control, como las celdas no electro, que se incuban con una biomolécula marcada o las celdas vacías, que no están electroporadas ni incubadas con una molécula marcada. Estos controles nos permiten evaluar el nivel de autofluorescencia celular y la deficiencia de los pasos de lavado, y como tales son necesarios para evaluar si el experimento de electroporación ha sido exitoso después de sus desarrollos. Esta técnica abrió nuevas vías para que los investigadores en el campo de la biofísica y la tercera biología exploraran la difusión y el comportamiento dinámico de la biomolécula de etiqueta en microorganismos vivos.

Y esto en una escala de tiempo de uno a dos órdenes de magnitud más larga que con proteínas autofluorescentes como las GFP. Transfirió la flexibilidad del marcaje d orgánico in vivo, lo que hizo que los experimentos de amenaza de una sola molécula fueran mucho más factibles para el estudio de la dinámica intramolecular e intermolecular en células vivas.