Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético In Situ Con el método TUNEL
16 de diciembre de 2014
Este video describe la disección, el procesamiento de tejidos, el seccionamiento y el marcaje TUNEL basado en fluorescencia del músculo esquelético del ratón. También describe un método para el análisis semiautomatizado del etiquetado TUNEL.
El objetivo general de este procedimiento es detectar roturas de ADN y muerte celular en C dos. Esto se logra mediante secciones de tejido de primera permea para permitir que los reactivos de túnel ingresen al núcleo celular. A continuación, la enzima TDT se utiliza para unir covalentemente las DTP a tres extremos principales de las roturas de ADN en estas células.
A continuación, el DUTP se marca con una sonda fluorescente. En última instancia, la señal positiva del túnel se cuantifica en secciones de tejido que reflejan la frecuencia relativa de las roturas del ADN en las células. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la transferencia de sur o la inmunohistoquímica, es que es relativamente rápida, específica y proporciona una forma de eliminar el ruido y la autofluorescencia.
Comience fijando las extremidades traseras aisladas en 4%Para formaldehído en PBS en un tubo de 15 mililitros, permita que la fijación dure de cuatro a un máximo de 24 horas a cuatro grados centígrados. Solo se necesitan dos horas si el tejido es embrionario. Sin embargo, después de la fijación, reemplace la solución con sacarosa al 10% para crioproteger el tejido e incubarlo durante la noche a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, cambie la solución a sacarosa filtrada estéril al 30% y continúe la incubación durante la noche o hasta que las extremidades traseras se hundan hasta el fondo del tubo. Al incrustar, es importante que las extremidades traseras estén completamente sumergidas en el medio de incrustación. Los moldes de inclusión se pueden colocar directamente sobre hielo seco o en pentano isop sobre hielo seco para congelar el medio.
Al crioseccionar. Los bloques cortan secciones de transferencia de 10 micras de espesor o más delgadas, las secciones más gruesas no serán penetradas por los reactivos de etiquetado del túnel. Recoja estas secciones delgadas en portaobjetos de gelatina o vidrio recubierto de unión vectorial a temperatura ambiente.
Muy rápidamente, transfiera los portaobjetos a hielo seco para su almacenamiento. Primero descongele una tira de una sección de tejido congelado a temperatura ambiente y déjela secar durante 16 a 64 horas. Una vez que el portaobjetos esté a temperatura ambiente, rehidrate la sección en un frasco de acoplamiento lleno de PBS durante 10 minutos.
Repita este paso de rehidratación una vez, luego seque cuidadosamente el portaobjetos con una toallita de laboratorio sin alterar la sección de tejido para que penetre en la sección, coloque el portaobjetos en una cámara de humedad y pipetee 50 microlitros de reactivos comerciales a base de saponina no proteolítica en la sección. No pipetee directamente sobre las secciones, ya que puede desprenderse o dañarse. A continuación, coloque un pequeño trozo de película paradistinta sobre la sección para distribuir el reactivo.
Si se forman burbujas, vuelva a aplicar la película para. Deje que el portaobjetos se incube durante una hora después de una hora. Retire los reactivos mediante dos lavados de cinco minutos en PBS y séquelo con cuidado.
Junto a las roturas de ADN etiquetadas por TDT, utilice un kit disponible en el mercado. Primero, haga el tampón XTDT y pipetee la sección. A continuación, incubar el portaobjetos durante cinco minutos en la cámara de humidificación.
En segundo lugar, haga una mezcla de etiquetado TDT de acuerdo con las instrucciones del kit o una corredera de control positivo. Agregue ADN a la mezcla de etiquetado TDT. Para un portaobjetos de control negativo, omita la enzima TDT de la mezcla.
Ahora, con una toallita, retire la mayor cantidad posible de tampón del portaobjetos y plételo en la mezcla de etiquetado. 50 microlitros deberían ser suficientes. Nuevamente, extienda la solución con paraform sin hacer burbujas.
Deje que el portaobjetos se incube en la cámara durante una hora ahora a 37 grados centígrados. En tercer lugar, haga el tampón de un x tope de acuerdo con las instrucciones del kit. Después de retirar la mezcla de etiquetado con la toallita de laboratorio, agregue entre dos y 300 microlitros de la mezcla de parada para cubrir completamente la sección.
A continuación, incube el portaobjetos durante cinco minutos en la cámara. En este paso no se utiliza ninguna película para. Para eliminar el tampón de parada, use dos lavados de dos minutos en PBS.
Ahora pipetee 50 microlitros de solución de marcado de fluoresceína recién preparada. En el portaobjetos, aplique el perfil e incube durante 20 minutos en la cámara, pero ahora a oscuras. Retire la solución de etiquetado con un solo lavado de dos minutos en PBS mientras lava y diluye algunos ganchos.
3, 3, 2, 5, 8 a un microgramo por mililitro en PBS. Después de los lavados, cubra las secciones con uno a 200 microlitros de la solución de ganchos diluidos. Luego incubar el portaobjetos durante cinco minutos, protegido de la luz para eliminar los ganchos para manchar, usar tres lavados de cinco minutos en PBS.
A continuación, seque cuidadosamente el portaobjetos con una toallita de laboratorio y aplique un cubreobjetos para la obtención de imágenes. Visualice la sección utilizando filtros dpi, fitzy y rojo de Texas para separar las señales de tinción de ganchos, tinción de túnel y autofluorescencia en tres canales de color falsos en una sola imagen. Estandarice y mantenga la misma configuración de imagen entre todas las diapositivas para que se puedan comparar fácilmente.
No utilice ningún ajuste automático de exposición o ganancia como referencia anatómica. Utilice una imagen brillante de campo claro de una sección adyacente de la extremidad trasera teñida con h y e en el software de análisis de imágenes. Apague el canal del túnel.
A continuación, trace manualmente el contorno de la zona muscular que se va a cuantificar utilizando los otros canales. Convierta el área trazada en una máscara. A continuación, vuelva a encender el canal del túnel y ajuste el umbral de intensidad mínima para excluir la señal autofluorescente.
Utilice el mismo límite de umbral en todas las secciones analizadas en el estudio. A continuación, convierta los píxeles del umbral en una máscara. En cada imagen, combine la máscara de área muscular y la máscara de túnel de umbral.
Esto hace una representación de la señal del túnel dentro del área muscular trazada. Ahora cuantifique la máscara combinada para determinar el número de objetos positivos del túnel y el área total de píxeles de la señal del túnel dentro del músculo. Utilice estos valores para el análisis estadístico.
Los objetos positivos de túnel de bajo aumento pueden aparecer como fragmentos brillantes e irregulares en el músculo esquelético. Sin embargo, a mayor aumento, se deben observar algunos objetos tunnel positivos con la morfología apoptótica clásica si el tipo de muerte celular involucró esta apoptosis. El control positivo con ADNs D añadidos debe exhibir una abundante señal positiva de túnel distribuida uniformemente a través de todos los tejidos.
En la sección. El control negativo sin enzima TDT debe tener un fondo de baja intensidad y mostrar solo autofluorescencia. Con el protocolo descrito, se encontró que las células óseas y endoteliales de los glóbulos rojos contribuyeron a la señal autofluorescente en las secciones de extremidades superiores preparadas.
La verdadera señal positiva del túnel fue mucho más intensa. Podría aislarse de la señal autofluorescente utilizando un umbral de intensidad de píxeles. Otra opción para aislar la señal del túnel fue restar digitalmente el canal rojo de autofluorescencia del canal del túnel.
Con esta técnica, se produce la muerte de las células del músculo esquelético. En un modelo de ratón de AME, el marcaje en túnel reveló más células apoptóticas en ratones con AME de cinco días de edad que en los controles. Al cuantificar la tinción del túnel, se demostró que esta observación era estadísticamente significativa para múltiples grupos musculares dentro de la extremidad posterior.
Una vez dominada, la técnica del túnel se puede realizar en unas cuatro horas para generar resultados cuantitativos fiables.
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Descripción general
Este video describe un método para detectar roturas del ADN y muerte celular en el músculo esquelético de ratón mediante etiquetado TUNEL. Se detallan la disección, el procesamiento del tejido y el análisis semiautomatizado implicados en esta técnica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Histología
Antecedentes
- Comprender las roturas del ADN es fundamental para estudiar la muerte celular.
- La marcación TUNEL es un método específico para detectar estas roturas.
- Los métodos tradicionales pueden ser más lentos y menos específicos.
- Esta técnica tiene como objetivo mejorar la velocidad y precisión de la detección.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para cuantificar roturas de ADN en secciones de tejido.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos de muerte celular.
- Ofrecer una alternativa más rápida a los métodos existentes.
Métodos Utilizados
- Diseción del músculo esquelético de ratón.
- Procesamiento del tejido para preparar muestras para análisis.
- Etiquetado de TUNEL basado en fluorescencia para detectar roturas de ADN.
- Análisis semiautomatizado para cuantificar las señales positivas de TUNEL.
Resultados Principales
- Detección exitosa de roturas de ADN en tejido muscular.
- Cuantificación de señales positivas para TUNEL que reflejan la muerte celular.
- Demuestra la rapidez y especificidad del método.
- Comparación con métodos tradicionales que resalta sus ventajas.
Conclusiones
- El método de marcado TUNEL es eficaz para estudiar la muerte celular.
- Este enfoque puede mejorar la investigación en biología muscular.
- Proporciona una herramienta valiosa para futuros estudios sobre el daño del ADN.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección del daño en el ADN en el músculo esquelético proporciona una comprensión mecanicista de las vías de muerte celular relevantes para los modelos de enfermedades neuromusculares y la evaluación de la eficacia terapéutica. El método TUNEL permite la medición cuantitativa y reproducible de la apoptosis en cortes de tejido, lo que contribuye a la validación de dianas y al descubrimiento de compuestos prometedores en la fase preclínica. Al aislar la señal verdadera de la autofluorescencia mediante la sustracción digital de canales, el ensayo mejora la confianza predictiva en la confirmación de mecanismos patológicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas al confirmar el daño del ADN como un mecanismo patológico en modelos de enfermedad.
- Valor operativo: Permite la validación funcional del blanco mediante la medición directa de la muerte celular en tejidos relevantes.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al cuantificar la eficacia de las intervenciones terapéuticas en la apoptosis in vivo.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Genera mediciones cuantitativas estandarizadas de la señal positiva para TUNEL para campañas de cribado de compuestos.
- Reproducibilidad: La cuantificación semiautomatizada garantiza una detección de señal consistente entre secciones y grupos experimentales.
- Reducción de ruido: La sustracción digital de canales excluye la autofluorescencia, mejorando la sensibilidad y fiabilidad del ensayo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Aplicado en modelos murinos de AME para evaluar la muerte celular en células del músculo esquelético, lo que demuestra su utilidad traslacional.
- Reducción del riesgo mecanicista: Confirma la participación de la apoptosis en la muerte celular, reduciendo la ambigüedad en el análisis de vías.
- Continuidad preclínica: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de la modulación del blanco con resultados fenotípicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y las pruebas de eficacia preclínica, proporcionando lecturas cuantitativas de apoptosis que orientan las decisiones de continuar o descartar un proyecto.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la detección de roturas de ADN y la aclaración de los mecanismos de muerte celular en el músculo esquelético.
- Selección: Proporciona salidas cuantitativas listas para ensayos, para evaluar los efectos de compuestos sobre la apoptosis a nivel tisular.
- Análisis: Genera máscaras de señal basadas en umbrales y recuentos de objetos que permiten comparaciones estadísticas entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la validación preclínica mediante modelos de apoptosis relevantes para la enfermedad en músculo de ratón.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable basada en fluorescencia para la detección de apoptosis en múltiples tipos de tejidos y modelos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en torno a las vías de muerte celular.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y la reproducibilidad mediante ajustes de imagen fijos y una cuantificación semiautomatizada.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir decisiones tempranas de avance o interrupción basadas en datos y en la eficacia de la apoptosis.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo mediante la cuantificación del impacto terapéutico sobre el daño al ADN y la muerte celular.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología, corte de tejidos y microscopía de fluorescencia.
- Depende de un criostato, microscopio de fluorescencia y software de análisis de imágenes con capacidad de separación de canales.
- Necesita la estandarización de los protocolos de fijación, inclusión y corte de tejidos entre los equipos.
- Debe tener en cuenta la autofluorescencia específica del tejido proveniente de fuentes como glóbulos rojos, hueso y células endoteliales.
- Está limitado por artefactos inducidos durante el procesamiento del tejido que pueden afectar la eficiencia de la enzima TdT y la relación señal-ruido.
