Name: Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético In Situ Con el método TUNEL (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprende a detectar daño en el ADN y muerte celular en músculo esquelético de ratón mediante el método TUNEL in situ. Esta técnica ofrece una alternativa rápida y específica para cuantificar roturas de ADN en secciones tisulares.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención RO1-NS065895 de NIH-NINDS y la subvención 5-F31-NS076250-02 de NIH-NINDS. 
Agradecemos a JHU SOM Microscope Facility por el uso del criostato.

NOTA: Todos los animales procedimientos descritos en este protocolo se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud 26. El protocolo (MO13M391) fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Johns Hopkins y Uso. 1. Neonatal ratón Sacrificio, disección, y Fijación <ol><li> Sacrificar un ratón neonatal por inhalación de CO2. </li><li> Inmediatamente cortar el miembro posterior por encima de la rodilla. Hasta días aproximadamente postnatal 7, los huesos de las piernas son lo suficientemente suaves para cortar con tijeras grandes de laboratorio o cuchilla afilada y posteriormente la sección en un criostato. </li><li> Coloque la extremidad posterior en 10 ml de hielo frío 4% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un tubo de 15 ml. </li><li> Inmersión solucionar el miembro posterior en paraformaldehido durante 4-24 horas a 4 ° C. Tejido embrionario sólo requiere varias horass de fijación. <ol><li> Evite fijación más de 24 horas, ya que esto puede reducir la eficiencia TUNEL ensayo. </li></ol></li><li> Cryoprotect la extremidad posterior por inmersión en solución de sacarosa. <ol><li> Cambiar paraformaldehído al 10% de sacarosa en PBS en el mismo tubo de 15 ml, incubar durante la noche a 4 ° C. </li><li> Cambio a 30% de sacarosa en PBS, se incuban durante la noche a 4 ° C o hasta que los sumideros de los miembros posteriores a la parte inferior del tubo. Tissue se puede dejar en 30% de sacarosa durante un período más largo, siempre que la sacarosa ha sido filtrada de forma estéril. </li></ol></li></ol> 2. Tejido incrustación <ol><li> Llenar un molde de inclusión a medio camino marcado con un medio de inclusión. </li><li> Colocar las extremidades posteriores en la parte superior del medio de incrustación, con el lado del corte lo más cerca posible a una de las paredes del molde. Marcar la orientación de la extremidad posterior en el exterior del molde. <ol><li> Insertar varios miembros traseros y corte en el mismo bloque. Sin embargo, es importante asegurarse de que todo hindlimbs en el bloque están orientados paralelos entre sí para obtener secciones en búsqueda de los niveles a lo largo del eje de la extremidad. </li></ol></li><li> Cubra miembros posteriores con medio de incrustación. Si extremidades posteriores cambian mientras se vierte el medio, les re-orientar con unas pinzas de punta roma o un palillo de dientes. </li><li> Permitir medio de inclusión para infiltrarse en el tejido a temperatura ambiente durante al menos 15 min. </li><li> Coloque los moldes directamente en hielo seco o en isopentano en hielo seco para congelar un medio de inclusión. Asegúrese de mantener el nivel de moldes en todo momento y evitar el desplazamiento del tejido embebido. </li><li> Mantenga moldes congelados a -80 ° C hasta que esté listo para cortar, durante hasta varios meses. </li></ol> 3. cryosectioning Embedded extremidades <ol><li> Ajuste la temperatura cámara del criostato a -20 ° C, la temperatura del objeto a -18 ° C; ajustar la temperatura del objeto abajo según sea necesario. </li><li> Equilibrar el bloque de tejido dentro de la cámara del criostato durante al menos 30 min. Temp bloque correctabibliografía es crucial para la calidad de la sección. </li><li> Los cortes de secciones transversales con un espesor de 10 micras o menos. Secciones más gruesas no será totalmente penetradas por reactivos TUNEL. Utilice la placa estabilizadora, cuchillas, y el ángulo de la hoja (típicamente 5 °) recomendado para el criostato. </li><li> Recoger secciones Onto gelatin- o portaobjetos de vidrio recubiertos con Vectabond a temperatura ambiente. Coloque inmediatamente en una caja de portaobjetos en hielo seco. Mantenga la caja portaobjetos en un recipiente aparte con hielo seco colocado cerca del criostato alcance de la mano. <ol><li> Los cortes de secciones transversales en serie a través del eje largo de la extremidad, saltándose 100-200 micras. Recoge al menos 3 secciones adyacentes en cada nivel de serie. </li></ol></li></ol> 4. Ensayo de TUNEL en las patas traseras Secciones utilizando un kit disponible comercialmente (todas las medidas a temperatura ambiente a menos que se indique) <ol><li> Descongele las diapositivas con secciones a temperatura ambiente y se seque durante la noche o el fin de semana. </li><li> Rehidratar secciones por immersing diapositivas en PBS durante 2 x 10 min en un tarro Coplin. Seque con un paño de laboratorio, la eliminación de la mayor cantidad de líquido alrededor de la sección de lo posible. </li><li> Secciones permeabilizar <ol><li> Utilice una no proteolítico, reactivo basado en saponina comercial o 0,5% de Tween 20 y 0,05% de Triton X100 en PBS. </li><li> Colocar el portaobjetos en una cámara de humedad. Una cámara de humedad simple es una caja de puntas de pipeta vacía con tapa hermética, con suficiente agua añadida para cubrir el fondo de la caja. </li><li> Pipetear lo suficientemente reactivo sobre el portaobjetos para cubrir la sección (50 l es suficiente para extremidades de ratón neonatales). No pipetear directamente a la sección, como la agitación repetida puede causar la sección de levantar fuera de la diapositiva. </li><li> Con unas pinzas de punta roma, colocar un pequeño rectángulo de parafina en la parte superior de la sección para extenderse la gota de reactivo y cubrir completamente la sección. Si todas las burbujas se forman bajo la parafina, levante suavemente si fuera poco, en seco, y volver a aplicar. </li><li> Incubar los portaobjetos con permeabilización reactivo durante 1 hora en una cámara de humedad cubierta. Si las secciones comienzan a levantar de la diapositiva, el tiempo de permeabilización puede reducirse a 30 min. </li><li> Lavar los portaobjetos en PBS en una jarra Coplin 2 x 5 min. Los rectángulos parafilm deben flotar en la parte superior y luego se pueden sacar y desechar. </li><li> El uso de un paño de laboratorio, seque todo el líquido alrededor de las secciones como sea posible. </li></ol></li><li> Etiquetado ruptura de ADN mediada por TDT <ol><li> Siga las instrucciones del juego para hacer 1x tampón TdT etiquetado, pipeta etiquetado de amortiguación suficiente sobre el portaobjetos para cubrir sección de tejido (50 l es suficiente para que los miembros de ratones neonatales). Incubar en la cámara de humedad durante 5 min. Alternativamente, sumerja el portaobjetos en tampón TdT etiquetado en una jarra Coplin. </li><li> Siga las instrucciones del juego para hacer mezcla de marcaje TDT. El kit incluye el cobalto, magnesio, y cationes de manganeso; el catión de manganeso funciona bien en una variedad de tejidos, incluyendo el músculo esquelético, el sistema nervioso TISSUES, el hígado, la piel y los huesos. </li><li> Para un control positivo, añadir DNasa (etiquetado &quot;nucleasa&quot; en el kit) a la mezcla de marcaje TdT. Alternativamente, pre-tratar una sección de control positivo con DNasa en tampón de nucleasa durante 1 hora a 37 ° C, de acuerdo con las instrucciones del kit. Mantenga solución de DNasa y secciones tratado con DNasa lejos de otras secciones experimentales para prevenir la contaminación cruzada. </li><li> Para un control negativo, omita la enzima TdT de la mezcla de marcaje. </li><li> Utilice un paño de laboratorio para eliminar la mayor cantidad de tampón TdT etiquetado de la diapositiva como sea posible. Mezcla de marcaje pipeta TDT en el portaobjetos (50 l por sección), cubrir con un nuevo rectángulo de parafina, y se incuba en la cámara de humedad a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Siga las instrucciones del juego para hacer tampón de detención 1x. Utilice un paño de laboratorio para eliminar mezcla de marcaje TdT de la diapositiva, y añadir tampón de parada 200-300 l para cubrir la sección de tejido, e incubar en la cámara de humedad durante 5 min. Al<html> ternatively, sumerja el portaobjetos en tampón de detención en una jarra Coplin. </li><li> Lavar el portaobjetos 2 x 2 min en PBS. Utilice un paño de laboratorio para eliminar la mayor cantidad de PBS de la diapositiva como sea posible. </li></ol></li><li> Fluorescente etiquetado <ol><li> Siga las instrucciones del kit para preparar solución de etiquetado con fluoresceína para etiquetar dNTPs en ADN se rompe. Solución de la pipeta en el portaobjetos (50 l por sección), cubrir con un nuevo rectángulo de parafina, y se incuba en la cámara de humedad durante 20 min. </li><li> Lave los portaobjetos durante 2 minutos en PBS en una jarra Coplin. Utilice un paño de laboratorio para eliminar la mayor cantidad posible de PBS la diapositiva. </li><li> Diluir Hoechst 33258 tinción nuclear a 1 g / ml en PBS y pipeta sobre la corredera (100-200 l es suficiente para cubrir la sección). Incubar en la cámara de humedad durante 5 min. </li><li> Lavar 3x durante 5 min en PBS. </li><li> Cubreobjetos con Antifade medio de montaje de fluorescencia y sellar los bordes con esmalte de uñas. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. Adquisición de Imagen Digital <ol><li> Adquirir imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia convencional con DAPI, FITC, y los filtros de Texas Red (o equivalente). Utilice un objetivo mayor aumento (20X o 40X) para verificar que el etiquetado tuvo éxito y los núcleos (intactas o fragmentados) se marcaron. Un objetivo de 10X es suficiente para la cuantificación de puntos lagrimales TUNEL-positiva. </li><li> Recoger imágenes de la tinción de Hoechst, la tinción TUNEL, y la señal de autofluorescent como tres canales de color falso separadas combinadas en una sola imagen. Si la etiqueta fluoróforo TUNEL es verde, señal de imagen autofluorescent en el filtro rojo, y viceversa. <ol><li> Mantenga todos los ajustes de imagen equivalente entre diapositivas para su posterior umbral y cuantificación. Para cada filtro, tiempos preestablecidos y exposición récord, ganancia y hurgar en la basura (sin hurgar en la basura es el mejor); no utilice exposición o ganancia ajustes automáticos. </li><li> Utilice ensayo y error para encontrar la exposición y los ajustes de ganancia que mejor capturar el rango de intendades en todas las diapositivas manchadas. Asegúrese de que no hay píxeles saturados en las imágenes obtenidas, ya que esta cuantificación sesgo voluntad. </li></ol></li><li> Tome fotografías del grupo muscular entera de interés. Esto puede requerir varias imágenes que se &quot;cosido&quot; juntos. </li></ol> Análisis 6. Imagen <ol><li> Utilice los programas de análisis de imágenes disponibles en el mercado para analizar imágenes digitales de la tinción de TUNEL. Análisis utilizando software comercial se muestra aquí. Alternativamente, el software ImageJ libre de NIH se puede utilizar para analizar la tinción de TUNEL. </li><li> Teñir una sección adyacente a la sección de TUNEL-teñidas con hematoxilina y eosina (H &amp; E) y tomar una imagen digital de sección completa con un microscopio de campo claro convencional. Utilice esta imagen H &amp; E en combinación con un atlas de anatomía 5,18,19 trazar las estructuras anatómicas que ser cuantificados. </li><li> Con el canal TUNEL apagado, trazar manualmente el contorno de la zona a ser cuantificado, utilizandoHoechst y canales de autofluorescencia de orientación. Convertir el área de trazado en una máscara (un conjunto de coordenadas de píxel seleccionado para ser analizados). </li><li> Encienda el canal TUNEL. Uso de la función de umbral de intensidad en el programa de análisis de imagen, ajustar el umbral más bajo para excluir toda señal de autofluorescencia. </li><li> Aplicar la misma configuración de umbral para todas las imágenes de la unidad de estudios. Convertir selecciones de umbral en máscaras. </li><li> Para cada imagen, combinar la máscara área muscular y la máscara de TUNEL. La nueva máscara combinación representará señal de TUNEL en el área del músculo trazado solamente. </li><li> Realizar cuantificación máscara de la máscara combinación para determinar el número de objetos y el área de la señal de TUNEL en el área del músculo trazado objeto. Realice este utilizando la función de analizador de partículas en ImageJ. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Un método para detectar y analizar cuantitativamente la apoptosis asociada a daño del ADN en el músculo esquelético de ratón se describe. El procedimiento incluye la recolección del tejido, tinción TUNEL, la adquisición de imagen digital, y análisis de imagen. Se necesitan suministros y herramientas histológicos comunes, y un kit comercial especial TUNEL es necesario. Los grandes elementos esenciales de equipos necesarios son un criostato, microscopio de epifluorescencia con capacidad de imagen digital, y un sistema inf...

Terminal desoxinucleotidil transferasa (TdT) dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) es el proceso de utilización de la enzima TdT para adjuntar dUTP a extremos 3 &#39;de doble y de cadena sencilla de ADN rompe 12,23. El método TUNEL para la detección de la apoptosis y daño del ADN se informó por primera vez hace más de 20 años por Gavrieli et al. 1,12,24. Desde entonces se ha evaluado y optimizado en diferentes preparaciones de tejidos 7,23,27,40. TUNEL se ha utilizado para estudiar la isquemia inducida por la muerte celular de las neuronas 6,14,29 y 43,44 cardiomiocitos, la muerte celular neuronal excitotóxica 30,31, y como biomarcador en el tratamiento de la artritis 39. También se ha utilizado como un factor de pronóstico y marcador de células del tumor en varios cánceres humanos 2,3,15,32,37,38,42. Existen métodos alternativos para el daño del ADN y detección de muerte celular, pero tienen dificultades técnicas y advertencias. Transferencia de Southern se puede usar para quantifdaños en el ADN y en el tejido lisados ​​enteros 7,9-11, pero este método no proporciona resolución a nivel celular y es difícil de cuantificar. El ensayo cometa es un método basado en células alternativa que requiere la extracción de núcleos de células conservadas 4,20,28,36. Aunque el ensayo cometa funciona bien en células aisladas en cultivo, es mucho más difícil de preparar núcleos intactos a partir de tejido muscular esquelético 8,21. Al igual que con Southern blot, el ensayo cometa no proporciona información específica del tipo de célula de todo un homogeneizado de tejido muscular. Otra alternativa para el método TUNEL es inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra ADN monocatenario 25,33,41 o en contra de las proteínas que participan en la respuesta al daño del ADN y la muerte celular vías (por ejemplo, p53, H2AX, y caspasas) 13,17,22,40. Tales métodos basados ​​en anticuerpos requieren caracterización exhaustiva de anticuerpos y excelente especificidad del anticuerpo para producir una alta relación de señal a fondo. Incluso cuando specexisten anticuerpos IFIC, podrán exigir la desnaturalización de la proteína diana a través de los procedimientos de recuperación de antígeno 34,35. Mientras discutimos aquí, la recuperación de antígenos en los resultados de tejido muscular en inaceptablemente alta autofluorescencia. A diferencia de los métodos alternativos, TUNEL logra detectar el daño del ADN con una señal de alto y bajo fondo, excelente especificidad que se puede probar con simples controles positivos y negativos, buena penetración en los tejidos que no requiere la recuperación de antígenos, y la resolución a nivel celular. Además, el método TUNEL tarda unas 4 horas en completarse, mientras que los métodos alternativos suelen requerir incubaciones durante la noche. Estudiamos la muerte celular del músculo esquelético en un modelo de ratón de la atrofia muscular espinal (SMA) 10 que se ha generado por Hsieh-Li y sus colegas 16. Para cuantificar las células apoptóticas en el músculo, hemos desarrollado un método de preparación de tejido, tinción y cuantificación que funciona con firmeza a través de diferentes skeleTal grupos musculares en diferentes puntos de tiempo de desarrollo en ratones. Utilizamos un kit TUNEL etiquetado disponible en el mercado y el software de análisis de imágenes disponible en el mercado. También hemos usado con éxito el ensayo de TUNEL en combinación con la tinción de inmunofluorescencia en la médula espinal 10. Los métodos descritos aquí son útiles para los investigadores que desean evaluar la patología del tejido, mecanismos de la enfermedad, los mecanismos del envejecimiento y del desarrollo (pre y post-natal) la muerte celular en el músculo esquelético. La técnica de TUNEL es especialmente útil para los estudios de daño y reparación del ADN y la muerte celular en sistemas modelo en el que sólo un subconjunto de las células es de resolución a nivel celular afectada y es necesario. Este video describe la disección, el procesamiento de tejidos, seccionamiento, y TUNEL etiquetado basado en la fluorescencia del músculo esquelético del ratón. También se describe un método de semi-automatizado señal de cuantificación TUNEL.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>19202</td><td>Para los procedimientos descritos aquí, se preparó una solución al 4% fresca de polvo. Se puede utilizar paraformaldehído de cualquier proveedor. La solución de formaldehído preparada debe almacenarse a 4 & grados; C y no debe utilizarse después de su fecha de caducidad (hasta varios meses). El paraformaldehído es un carcinógeno y una toxina por inhalación y contacto con la piel. Siga las precauciones especificadas en la MSDS cuando manipule paraformaldehído.</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Se utiliza para crioproteger tejidos antes de la congelación. Se puede utilizar sacarosa de cualquier proveedor.</td></tr><tr><td>Compuesto O.C.T.</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Medio de inclusión para criosección.</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>Se utilizó un criostato Leica CM3050S para las preparaciones aquí descritas. Cualquier criostato capaz de cortar 10 &mu; Se pueden utilizar secciones M.</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Se pueden utilizar portaobjetos de cualquier proveedor.</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>La gelatina se utiliza para promover la adhesión de la sección de tejido a los portaobjetos de vidrio. Para recubrir portaobjetos de vidrio con gelatina, disuelva 2,75 g de gelatina y 0,275 g de alumbre de cromo en 500 ml de agua destilada, tibia a 60 °C; C, sumerja los portaobjetos durante varios segundos y déjelos secar. Se puede utilizar gelatina de cualquier proveedor. Alternativamente, se pueden comprar portaobjetos prerrecubiertos de gelatina.</td></tr><tr><td>Sulfato de potasio de cromo (III) dodecahidratado (alumbre de cromo)</td>El alumbre <td>de cromo 243361 Sigma</td><td></td><td>se agrega a la solución de gelatina para promover la adhesión de los tejidos en los portaobjetos de vidrio. Es un posible carcinógeno y una toxina por inhalación y contacto con la piel. Siga las precauciones especificadas en la MSDS cuando manipule alumbre cromado.</td></tr><tr><td>Reactivo de adhesión tisular Vectabond</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>Sustrato opcional para una mejor adhesión del tejido a los portaobjetos de vidrio; en su lugar, se pueden utilizar portaobjetos recubiertos de gelatina.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Un detergente utilizado para permeabilizar el tejido. Se puede utilizar Tween20 de cualquier proveedor.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Un detergente utilizado para permeabilizar el tejido. Se puede utilizar Triton X100 de cualquier proveedor.</td></tr><tr><td>Kit de detección de apoptosis con fluoresceína TACS 2 TdT in situ</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>Kit comercial para el marcaje TUNEL basado en fluorescencia.</td></tr><tr><td>DNasa/nucleasa</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td> <td>(incluido con el kit)</td></tr><tr><td>Tampón de DNasa/nucleasa</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td> <td>(incluido con el kit)</td></tr><tr><td>10x solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>Make 1x PBS para lavados y diluciones. Se puede utilizar PBS de cualquier proveedor.</td></tr><tr><td>Agua libre de DNasa</td><td>Calidad Biológicos</td><td>351-029-131</td><td>Se puede utilizar agua de cualquier proveedor.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>Tinte nuclear. Se puede utilizar cualquier tinte nuclear fluorescente azul. Como tinte que se une al ADN, se sospecha que el Hoechst es un carcinógeno y debe manipularse con equipo de protección para minimizar el contacto con la piel.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>multiple</td><td>807</td><td>Se puede utilizar cualquier otra película hidrofóbica o cubreobjetos. Disponible en múltiples proveedores.</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente con cámara digital</td><td>&nbsp;--</td>&<td>nbsp;--</td>Se <td>puede utilizar cualquier microscopio fluorescente capaz de capturar digitalmente la fluorescencia roja, verde y azul en canales separados.</td></tr><tr><td>Medios antidecoloración Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td> Se <td>pueden utilizar medios antidecoloración de cualquier proveedor.</td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio, espesor No.1</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>Se pueden utilizar cubreobjetos de cualquier proveedor. El tamaño más pequeño de 22 x 22 mm es suficiente para las secciones de patas de ratón neonatales.</td></tr><tr><td>Esmalte de uñas</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>Se utiliza para sellar cubreobjetos. Se puede utilizar esmalte de uñas de cualquier proveedor (incluidos los minoristas habituales). Evite usar esmalte de uñas con color o aditivos que puedan reflejar la luz durante las imágenes fluorescentes.</td></tr></tbody></table>

detección y análisis de daño del adn en el ratón músculo esquelético in situ con el método tunel

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal desoxinucleotidil transferasa (TdT) trifosfato de desoxiuridina (dUTP) nick end labeling (TUNEL) es el método de utilizar la enzima TdT para unir covalentemente una forma marcada de dUTP a los extremos 3' de las roturas de ADN bicatenario y monocatenario en las células. Es un método fiable y útil para detectar el daño en el ADN y la muerte celular in situ. Este video describe la disección, el procesamiento de tejidos, el seccionamiento y el marcaje TUNEL basado en fluorescencia del músculo esquelético de ratón. También se describe un método de cuantificación semiautomática de la señal TUNEL. Las características normales inherentes del tejido y las condiciones de procesamiento del tejido afectan la capacidad de la enzima TdT para etiquetar el ADN de manera eficiente. El procesamiento de tejidos también puede agregar autofluorescencia indeseable que interferirá con la detección de la señal TUNEL. Por lo tanto, es importante determinar empíricamente el procesamiento de tejidos y los métodos de etiquetado TUNEL que producirán la relación señal-ruido óptima para la cuantificación posterior. El ensayo basado en fluorescencia descrito aquí proporciona una forma de excluir la señal autofluorescente mediante la sustracción del canal digital. El ensayo TUNEL, utilizado con las técnicas y controles de procesamiento de tejidos adecuados, es un método cuantitativo, reproducible y relativamente rápido para detectar la apoptosis en los tejidos. Se puede utilizar para confirmar el daño en el ADN y la apoptosis como mecanismos patológicos, para identificar los tipos de células afectadas y para evaluar la eficacia de los tratamientos terapéuticos in vivo.

Con la tinción de éxito, señal de TUNEL-positivas debe ser lo suficientemente brillante como para aislarlo de autofluorescencia estableciendo umbrales de intensidad. Objetos TUNEL-positivas a bajo aumento pueden aparecer fragmentos irregulares brillantes en el músculo esquelético (Figura 1A). Sin embargo, a mayor aumento, se deben observar algunos objetos TUNEL-positivas con la morfología apoptótica clásico, si el tipo de muerte celular en cuestión es la apoptosis (Figura 1B). El contro...

Este video describe la disección, el procesamiento de tejidos, el seccionamiento y el marcaje TUNEL basado en fluorescencia del músculo esquelético del ratón. También describe un método para el análisis semiautomatizado del etiquetado TUNEL.

Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético In Situ Con el método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar roturas de ADN y muerte celular en C dos. Esto se logra mediante secciones de tejido de primera permea para permitir que los reactivos de túnel ingresen al núcleo celular. A continuación, la enzima TDT se utiliza para unir covalentemente las DTP a tres extremos principales de las roturas de ADN en estas células.A continuación, el DUTP se marca con una sonda fluorescente. En última instancia, la señal positiva del túnel se cuantifica en secciones de tejido que reflejan la frecuencia relativa de las roturas del ADN en las células. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la transferencia de sur o la inmunohistoquímica, es que es relativamente rápida, específica y proporciona una forma de eliminar el ruido y la autofluorescencia.Comience fijando las extremidades traseras aisladas en 4%Para formaldehído en PBS en un tubo de 15 mililitros, permita que la fijación dure de cuatro a un máximo de 24 horas a cuatro grados centígrados. Solo se necesitan dos horas si el tejido es embrionario. Sin embargo, después de la fijación, reemplace la solución con sacarosa al 10% para crioproteger el tejido e incubarlo durante la noche a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, cambie la solución a sacarosa filtrada estéril al 30% y continúe la incubación durante la noche o hasta que las extremidades traseras se hundan hasta el fondo del tubo. Al incrustar, es importante que las extremidades traseras estén completamente sumergidas en el medio de incrustación. Los moldes de inclusión se pueden colocar directamente sobre hielo seco o en pentano isop sobre hielo seco para congelar el medio.Al crioseccionar. Los bloques cortan secciones de transferencia de 10 micras de espesor o más delgadas, las secciones más gruesas no serán penetradas por los reactivos de etiquetado del túnel. Recoja estas secciones delgadas en portaobjetos de gelatina o vidrio recubierto de unión vectorial a temperatura ambiente.Muy rápidamente, transfiera los portaobjetos a hielo seco para su almacenamiento. Primero descongele una tira de una sección de tejido congelado a temperatura ambiente y déjela secar durante 16 a 64 horas. Una vez que el portaobjetos esté a temperatura ambiente, rehidrate la sección en un frasco de acoplamiento lleno de PBS durante 10 minutos.Repita este paso de rehidratación una vez, luego seque cuidadosamente el portaobjetos con una toallita de laboratorio sin alterar la sección de tejido para que penetre en la sección, coloque el portaobjetos en una cámara de humedad y pipetee 50 microlitros de reactivos comerciales a base de saponina no proteolítica en la sección. No pipetee directamente sobre las secciones, ya que puede desprenderse o dañarse. A continuación, coloque un pequeño trozo de película paradistinta sobre la sección para distribuir el reactivo.Si se forman burbujas, vuelva a aplicar la película para. Deje que el portaobjetos se incube durante una hora después de una hora. Retire los reactivos mediante dos lavados de cinco minutos en PBS y séquelo con cuidado.Junto a las roturas de ADN etiquetadas por TDT, utilice un kit disponible en el mercado. Primero, haga el tampón XTDT y pipetee la sección. A continuación, incubar el portaobjetos durante cinco minutos en la cámara de humidificación.En segundo lugar, haga una mezcla de etiquetado TDT de acuerdo con las instrucciones del kit o una corredera de control positivo. Agregue ADN a la mezcla de etiquetado TDT. Para un portaobjetos de control negativo, omita la enzima TDT de la mezcla.Ahora, con una toallita, retire la mayor cantidad posible de tampón del portaobjetos y plételo en la mezcla de etiquetado. 50 microlitros deberían ser suficientes. Nuevamente, extienda la solución con paraform sin hacer burbujas.Deje que el portaobjetos se incube en la cámara durante una hora ahora a 37 grados centígrados. En tercer lugar, haga el tampón de un x tope de acuerdo con las instrucciones del kit. Después de retirar la mezcla de etiquetado con la toallita de laboratorio, agregue entre dos y 300 microlitros de la mezcla de parada para cubrir completamente la sección.A continuación, incube el portaobjetos durante cinco minutos en la cámara. En este paso no se utiliza ninguna película para. Para eliminar el tampón de parada, use dos lavados de dos minutos en PBS.Ahora pipetee 50 microlitros de solución de marcado de fluoresceína recién preparada. En el portaobjetos, aplique el perfil e incube durante 20 minutos en la cámara, pero ahora a oscuras. Retire la solución de etiquetado con un solo lavado de dos minutos en PBS mientras lava y diluye algunos ganchos.3, 3, 2, 5, 8 a un microgramo por mililitro en PBS. Después de los lavados, cubra las secciones con uno a 200 microlitros de la solución de ganchos diluidos. Luego incubar el portaobjetos durante cinco minutos, protegido de la luz para eliminar los ganchos para manchar, usar tres lavados de cinco minutos en PBS.A continuación, seque cuidadosamente el portaobjetos con una toallita de laboratorio y aplique un cubreobjetos para la obtención de imágenes. Visualice la sección utilizando filtros dpi, fitzy y rojo de Texas para separar las señales de tinción de ganchos, tinción de túnel y autofluorescencia en tres canales de color falsos en una sola imagen. Estandarice y mantenga la misma configuración de imagen entre todas las diapositivas para que se puedan comparar fácilmente.No utilice ningún ajuste automático de exposición o ganancia como referencia anatómica. Utilice una imagen brillante de campo claro de una sección adyacente de la extremidad trasera teñida con h y e en el software de análisis de imágenes. Apague el canal del túnel.A continuación, trace manualmente el contorno de la zona muscular que se va a cuantificar utilizando los otros canales. Convierta el área trazada en una máscara. A continuación, vuelva a encender el canal del túnel y ajuste el umbral de intensidad mínima para excluir la señal autofluorescente.Utilice el mismo límite de umbral en todas las secciones analizadas en el estudio. A continuación, convierta los píxeles del umbral en una máscara. En cada imagen, combine la máscara de área muscular y la máscara de túnel de umbral.Esto hace una representación de la señal del túnel dentro del área muscular trazada. Ahora cuantifique la máscara combinada para determinar el número de objetos positivos del túnel y el área total de píxeles de la señal del túnel dentro del músculo. Utilice estos valores para el análisis estadístico.Los objetos positivos de túnel de bajo aumento pueden aparecer como fragmentos brillantes e irregulares en el músculo esquelético. Sin embargo, a mayor aumento, se deben observar algunos objetos tunnel positivos con la morfología apoptótica clásica si el tipo de muerte celular involucró esta apoptosis. El control positivo con ADNs D añadidos debe exhibir una abundante señal positiva de túnel distribuida uniformemente a través de todos los tejidos.En la sección. El control negativo sin enzima TDT debe tener un fondo de baja intensidad y mostrar solo autofluorescencia. Con el protocolo descrito, se encontró que las células óseas y endoteliales de los glóbulos rojos contribuyeron a la señal autofluorescente en las secciones de extremidades superiores preparadas.La verdadera señal positiva del túnel fue mucho más intensa. Podría aislarse de la señal autofluorescente utilizando un umbral de intensidad de píxeles. Otra opción para aislar la señal del túnel fue restar digitalmente el canal rojo de autofluorescencia del canal del túnel.Con esta técnica, se produce la muerte de las células del músculo esquelético. En un modelo de ratón de AME, el marcaje en túnel reveló más células apoptóticas en ratones con AME de cinco días de edad que en los controles. Al cuantificar la tinción del túnel, se demostró que esta observación era estadísticamente significativa para múltiples grupos musculares dentro de la extremidad posterior.Una vez dominada, la técnica del túnel se puede realizar en unas cuatro horas para generar resultados cuantitativos fiables.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí descritos son protocolos que se utilizan para visualizar el proceso dinámico de la MG53 mediada por reparación de la membrana celular en todo el animal y en el nivel celular. Estos métodos se pueden aplicar para investigar la biología celular de volver a sellar la membrana plasmática y la medicina regenerativa.

Visualización de MG53 mediada por reparación de la membrana celular mediante In vivo Y In vitro Sistemas de

En este vídeo, se realiza el ensayo TUNEL para detectar la presencia de células apoptóticas en una muestra. El estudio consiste en el uso de una ADN polimerasa especial, la desoxinucleotidil transferasa terminal, que cataliza la adición de dUTP marcadas al extremo 3' del ADN fragmentado, que puede observarse e identificarse bajo un microscopio de fluorescencia.

Marcaje final de dUTP nick mediado por transferasa terminal: ensayo TUNEL: un método in situ para detectar la fragmentación del ADN en células apoptóticas

Las imágenes espectroscópicas electrónicas pueden obtener imágenes y distinguir el ácido nucleico de la proteína con una resolución nanométrica. Se puede combinar con el sistema miniSOG, que es capaz de etiquetar específicamente proteínas marcadas en muestras de microscopía electrónica de transmisión. Ilustramos el uso de estas tecnologías utilizando como ejemplo los focos de reparación de roturas de doble cadena.

Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

Consecutivos crio-secciones se recogen para permitir que las aplicaciones histológicas y enriquecimiento de ARN para mediciones de la expresión de genes usando las regiones adyacentes de un músculo esquelético solo ratón. ARN de alta calidad se obtiene a partir de 20 - 30 mg de cryosections y mediciones agrupadas están directamente comparación entre aplicaciones.

Cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos

Aquí presentamos un protocolo detallado para detectar ambos senescentes y células madre pluripotentes en el músculo esquelético por lesión mientras que inducen reprogramación en vivo . Este método es adecuado para evaluar el papel de la senescencia celular durante la regeneración del tejido y la reprogramación en vivo.

Evaluación de la senescencia inducida por la lesión y en Vivo de reprogramación en el músculo esquelético

Aquí se describe un protocolo para el inmunoetiquetado directo de miofibers necróticas en criosecciones musculares. Las células necróticas son permeables a las proteínas séricas, incluyendo la inmunoglobulina G (IgG). Revelar la aceptación de IgG por miofibers permite la identificación y cuantificación de miofibers que sufren necrosis independientemente de la condición muscular.

Inmunoetiquetado Desgeneración de miofibra en biopsias musculares

Aquí, proponemos un método para obtener eficientemente fibras musculares individuales en etapas de desarrollo postnatal tempranas a partir del modelo de ratón lamin 8-11 mutante homocigoto, un modelo muy severo para la distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD).

Aislamiento de miofiber único y cultura de un modelo murino de distrofia muscular de Emery-Dreifuss en el desarrollo post-Natal temprano

La electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético es un método viable para modular la expresión génica sin comprometer la contractilidad muscular en ratones.

Electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético del ratón

Mantener la integridad del genoma del ovocito es necesario para asegurar la fidelidad genética en el embrión resultante. Aquí, presentamos un protocolo preciso para detectar roturas de doble cadena de ADN en células germinales femeninas de mamíferos.

Detección de roturas de ADN bicatenario en ovocitos de ratón

El protocolo aquí presentado permite la identificación y el análisis de alta dimensión de células madre y progenitoras musculares mediante citometría de masas unicelulares y su purificación por FACS para estudios en profundidad de su función. Este enfoque se puede aplicar para estudiar la dinámica de regeneración en modelos de enfermedad y probar la eficacia de las intervenciones farmacológicas.

Identificación y análisis de progenitores miogénicos in vivo durante la lesión aguda del músculo esquelético mediante citometría de masa unicelular de alta dimensión

Inyecciones locales de un marcador mitocondrial con marcador mitocondrial terminal de células de Schwann en vivo para microscopía confocal. Este método utiliza pruebas de concepto demostradas en tejido muscular esquelético de ratones con músculo sano o enfermo para proporcionar una visualización mitocondrial de alta resolución.

Métodos para la cuantificación in situ de la morfología mitocondrial en células musculares y terminales de Schwann de ratones

Aprende a detectar daño en el ADN y muerte celular en músculo esquelético de ratón mediante el método TUNEL in situ. Esta técnica ofrece una alternativa rápida y específica para cuantificar roturas de ADN en secciones tisulares.

Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético In Situ Con el método TUNEL

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