Name: Limb remoto Preacondicionamiento Isquémico: una técnica neuroprotector en roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Aprende el preacondicionamiento isquémico remoto en ratas para proteger la retina contra daño por luz. Este método mínimamente invasivo mejora la función retiniana y reduce la apoptosis de fotorreceptores.

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El autor agradece la ayuda de la Sra. Sharon Spana (Universidad de Sydney) en el monitoreo, manejo y experimentación de roedores. El autor desea agradecer al Prof. Jonathan Stone y al Dr. Dan Johnstone por la asistencia en la preparación de este manuscrito. La financiación del doctorado ha sido proporcionada por la Universidad de Sydney y el Centro Australiano para la Excelencia en la Visión.

Declaración de Ética: El protocolo sigue las directrices de cuidado de animales de la Universidad de Sydney, AEC # 5657. La anestesia fue aprobado por el comité de ética animal (Universidad de Sydney, AEC # 5657). 1. Preparación del equipo <ol><li> Utilice el seguimiento de la temperatura de la piel en tiempo real. Encienda el ordenador, y el hardware de adquisición de datos. </li><li> Software de registro de la temperatura Abrir y ajustar el ajuste de temperatura de entre 30 a 35 ° C y la frecuencia de muestreo de cada 100 ms. </li><li> Opcional: Inserte el termómetro rectal para garantizar la temperatura central se mantiene estable en 37,5 ° C. </li></ol> 2. La calibración del esfigmomanómetro manual <ol><li> Conecte brazalete neonatal a sphygmomanometer.Use un manguito de tamaño 2 de 250 a 550 g de rata. Un adaptador puede ser necesario conectar el tubo del manguito de esfigmomanómetro. </li><li> Desinflar el manguito por cualquiera de aflojar la válvula de escape de aire o desconectar el tubo del manguito de la adaptacióno. Asegurar ninguna presión permanece en el tubo y la aguja del manómetro se apoya en cero dentro del óvalo / rectángulo. </li><li> Compruebe la presión entre la tubería, manómetro y brazalete. Inflar el manguito con bombas suaves de la bombilla de la inflación hasta que lea 100 mmHg en el manómetro. Asegúrese de que la presión se mantiene constante. Desinflar el manguito abriendo lentamente el valor de liberación de aire. </li></ol> 3. Preparación Animal Nota: Los animales que han de someterse a una lesión luz requerir adaptación oscura la noche antes de la isquemia a distancia. Animales sometidos a daño de la luz requieren cría (12 h de luz: oscuridad ciclo (5 lux)) oscuro <ol><li> Realizar isquemia a distancia, ya sea en roedores despiertos o anestesiados. Asegúrese de que los animales tienen un tono muscular saludable. Asegurar esta pellizcando la extremidad posterior superior para confirmar que no es adecuada presente muscular. Protección RIP inducida por la luz contra la lesión ha sido probado en ratas sedentarias hasta 6 meses de edad. </li><li> Preparación anestesiado para RIP <ol><li> Inyectar las ratas con una inyección intraperitoneal de 60 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina. Comprobar la profundidad de la anestesia mediante la extensión de la pierna y pellizcando la piel en la parte inferior del pie. El animal no tiene reflejo si está profundamente anestesiado. Aplicar las lágrimas artificiales para evitar la sequedad de la córnea mientras bajo anestesia. </li><li> Coloque ratas en cualquiera de una almohadilla de calor o circulación tubo calentador de agua para mantener una temperatura corporal constante de 37,5 ° C. Coloque la rata en la posición prona con almohadillas de las patas de las extremidades inferiores &quot;hacia arriba. O bien la derecha o la izquierda extremidad pueden sufrir isquemia a distancia. </li></ol></li><li> Preparación Awake para RIP Nota: Despierta la experimentación animal requiere de dos personas. A una persona le restringe el animal y la segunda persona opera el esfigmomanómetro manual. Los experimentadores deben estar seguros para llevar a cabo el procedimiento como restricción aumenta el riesgo de lesiones a los manipuladores. Las ratas sometidas a isquemia a distancia deben estar condicionadas to la restricción manual. En función de las directrices intuitivas moderación manual debe ser el progreso de 30 segundos a un máximo de 5 minutos durante un número de semanas. Animales tímidos que no logran aclimatarse a la moderación manual tienen que ser excluidos de la experimentación despierto. Por último, la moderación manual es probable que cause estrés (y potencialmente introducir confunde con el estudio) a los animales y una cohorte simulada (colocación de manguito sin inflamación) debe ser utilizado para interpretar con precisión los resultados del estudio de RIP. <ol><li> Cortar una toalla en un 15 cm x 30-50 cm pieza y colocar el borde corto perpendicular a la espina dorsal de la rata, que cubre la cabeza de la parte superior de las extremidades posteriores. </li><li> Meta el borde corto bajo el torso de la rata con fuerza y ​​empezar a envolver la rata con el borde largo restante de toalla. Asegurar el animal envuelto bajo el brazo en una posición supina. Si la rata se lleva a cabo bajo el brazo izquierdo, liberar la extremidad derecha de la rata de la toalla. </li></ol></li></ol> O 4. Aplicaciónf Temperatura de la piel de la sonda <ol><li> Extender la pata de la rata que ha de someterse a la isquemia y colocar la sonda de piel en la almohadilla de la pata. Coloque la sonda de la piel para maximizar el contacto entre la sonda de temperatura y la piel. Empuje firmemente la sonda en la almohadilla plantar y colocar la sonda con cinta de papel. </li><li> Compruebe la colocación de la sonda de la piel mediante el seguimiento de la temperatura en el software de registro de la temperatura. Asegúrese de que la temperatura de la piel es de entre 30 a 34 ° C y se mantiene estable. Seguimiento de la temperatura de la piel durante 1-2 minutos. Ajustar la sonda de la piel si la temperatura es inestable o por debajo de 30 ° C. </li></ol> 5. La isquemia a distancia <ol><li> Desinflar el manguito y asegurar la válvula de presión de aire se cierra. Extienda la pierna y sin apretar rodear el brazalete en la extremidad posterior superior. Utilice el dedo índice y el pulgar para extender la pierna y los dígitos más bajos para mantener el brazalete suelta en su posición. </li><li> Elevar la presión del manguito del animal anestesiado a 160 mmHg, y en animales despiertos INCREase la presión del manguito a 180 mmHg. Nota: La presión arterial anestesiado de ratas oscila 120-140 mmHg y se eleva a 160 mmHg cuando consciente. Comenzar las grabaciones con temporizador y la temperatura del pie una vez que se alcanza la presión correcta. Nota: La temperatura del pie debe caer por 2 ° C después de 5 minutos de presión constante. </li><li> Mantener la posición del manguito por encima &quot;rodilla&quot; del animal durante toda la isquemia. Presión del manguito comenzará a bajar después de unos minutos, o si la extremidad de la rata está en movimiento. </li><li> Repetidamente bombear la pera de inflado en ráfagas cortas para mantener la presión del manguito deseada corta ráfaga repetitivo de bombeo </li><li> Isquemia remoto se puede enviar de forma continua durante entre 5 y 15 min. El protocolo de isquemia reperfusión incluye 2 periodos de 5 min de isquemia con una intervenir 5 min de reperfusión. </li><li> Desinflar la presión del manguito aflojando la válvula de presión de aire. Compruebe el cambio de temperatura en el transcurso de la pro isquemiaProtocolo. Suelte el puño. </li><li> Continuar con la experimentación lesión. Animales bajo el efecto de la anestesia tendrán que ser colocado sobre una almohadilla de calor. Continuar monitoreando animales hasta ambulatoria. Los animales no pueden ser devueltos a la vivienda hasta caminando. </li></ol> 6. Lesiones Luz - Retina Degeneración Modelo <ol><li> Oscuro adaptarse a los animales durante la noche (15.12 h). Inmediatamente después de la isquemia acondicionado remoto o isquemia a distancia simulada (contención de los animales) lugar animales en la vivienda de plexiglás con los alimentos y el agua. </li><li> Encienda la iluminación fluorescente (1000 lux) situado por encima de plexiglás vivienda a las 9 am durante 24 horas. A raíz de exposición a la luz, devolver los animales a la luz tenue cíclica durante 7 días. </li></ol> Procedimientos Isquemia 7. Post-remotas <ol><li> Evaluación Vision con Electrorretinograma (ERG): Nota: El ERG configuración y el protocolo de flash siguieron Brandli y la piedra 26. <ol><li> Oscuro se adaptan los animales durante la noche (12.15 h). Bajotenue iluminación roja anestesiar a los animales mediante inyección intraperitoneal de ketamina y xilazina (60 mg / kg y 5 mg / kg, respectivamente). Midriática (sulfato de atropina 1,0%), anestesia corneal (proximetacaína 0,5%). </li><li> Aplicar la hidratación corneal (Carbomer polímero) gotas para los ojos inmediatamente a la córnea. Aplique el gel del ojo en intervalos de 20 minutos para mantener la hidratación de la córnea. </li><li> Dibuja un hilo suelto atada alrededor del globo ocular para ayudar grabaciones ERG estables. Monitorear la temperatura usando una sonda rectal y mantener la temperatura corporal del animal en 37 a 37,5 ° C. </li><li> Coloque la cabeza dentro de una esfera de integración Ganzfeld. Nota: El Ganzfeld es un estímulo luminoso totalmente programable que ofrece la pizca parpadea uniformes de los LED en el ojo. </li><li> Registre el electrorretinograma usando un 4 mm de platino electrodo positivo a medida tocando ligeramente la córnea y un diámetro de 2 mm Ag / AgCl electrodo pellet insertado en la boca. Referencia ambos electrodos a una aguja de acero inoxidableinsertado por vía subcutánea en la grupa. </li><li> Señales de registro con ajuste de paso de banda de 0.3-1,000 Hz (-3 dB), con una velocidad de adquisición de 2 kHz (Instrumentos AD). Después de que se estableció una grabación estable ERG sujeto al animal a un adaptación a la oscuridad 10 min antes de iniciar las grabaciones. </li><li> Siga el protocolo de flash como se describe anteriormente por Brandli y la piedra 26. <ol><li> Programar la duración del flash (se utilizó flashes 2.1 ms de duración), y establecer su intensidad de -4,4 a 2,0 log scot cd.sm -2. Utilice destellos brillantes (log 2,0 scot cd.sm -2, 1 ms) para medir la función de la retina. En este estudio es la comparación entre el control, lesiones leves y lesiones de luz con RIP. </li></ol></li></ol></li></ol> 8. TUNEL ensayo <ol><li> La eutanasia a los animales mediante inyección intraperitoneal de sobredosis de fenobarbital (100 mg / kg). Enuclear los ojos y fijar en paraformaldehído al 4%. </li><li> Lave los ojos en PBS antes cyroprotectingojos durante la noche en sacarosa al 30% (w / v). Insertar los ojos en compuesto OCT y cortar en 20 micras secciones sagital utilizando un criostato. </li><li> Realizar el ensayo TUNEL en secciones de la retina con tinción DAPI siguiendo el protocolo de Maslim et al. 27 </li><li> Utilice microscopía de fluorescencia para el recuento de TUNEL de la retina. Células TUNEL se registraron a partir de la capa nuclear externa (ONL); la capa más externa de la retina que contiene núcleos fotorreceptoras. En este estudio, los recuentos de TUNEL se realizaron por triplicado para cada ojo, con 5 ojos para cada grupo de tratamiento. </li><li> Utilice un modelo lineal al grupo estadístico comparar medios de control, lesiones leves y lesiones + RIP luz ratas. </li></ol>

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El autor no tiene nada que revelar.

Roedor extremidad posterior isquemia se indujo con éxito con un esfigmomanómetro manual de la entrega de la neuroprotección y el manguito de los fotorreceptores de la retina. Un hallazgo consistente con isquemia inducida acondicionado protección de los fotorreceptores de una lesión ligera 9,28. En esencia, la isquemia a distancia hace que la privación breve de oxígeno a los tejidos. Por lo tanto, el precondicionamiento isquémico remoto tiene muchas similitudes con acondicionado is...

La supervivencia de la mayoría, tal vez todos, los tejidos de la cara de estrés metabólico puede ser mejorada por el condicionamiento previo con un período de isquemia subletal 1,2. El precondicionamiento isquémico (IP) en términos prácticos es la exposición del tejido a la isquemia subletal, antes de las experiencias de tejido factores estresantes más graves, tales como un insulto isquémico posterior. En modelos animales, IP proporciona protección sorprendente con el cerebro, la retina, el corazón y los pulmones 3-6. En consecuencia, las observaciones en pacientes con accidente cerebrovascular mostraron un vínculo entre los ataques isquémicos transitorios anteriores y mejores resultados clínicos 7,8. IP también protege los fotorreceptores de la retina de lesiones no isquémicas 9. La eficacia de la PI en diversos tejidos y lesiones sugiere que está activando un mecanismo innato de la supervivencia celular presente en todos los tejidos. El precondicionamiento isquémico de miocardio se ha sugerido que tiene efectos protectores a través de la regulación al alzadel factor inducible por hipoxia (HIF), conocido para regular las diferentes vías metabólicas a través de la liberación de adenosina o mediante la apertura de canales de potasio ATP mitocondrial 10,11. Canales de liberación de adenosina y el ATP de potasio están implicados en la isquemia cerebral, pero, las investigaciones sobre los mecanismos neuroprotectores de condicionamiento isquémico hasta la fecha se han centrado en las modificaciones de anti-excitotoxicidad, vías anti-apoptóticos y anti-inflamatorios 12,13. En general, la comprensión del proceso molecular de acondicionamiento isquémico para la protección de las neuronas es limitado. Intentos precondicionamiento isquémico remoto para acondicionar distantes órganos críticamente importantes (corazón, cerebro, pulmón) por generar isquemia en los tejidos menos críticas. Precondicionamiento isquémico remoto (RIP) usando la extremidad posterior ha demostrado ser neuroprotector en modelos de roedores de accidente cerebrovascular 14-17. El método descrito por nosotros proporciona un prot simple, fiable y no invasivoocol para inducir RIP. La gran mayoría de protocolos RIP implica la extremidad posterior, presumiblemente debido a la arteria femoral situada en la extremidad posterior superior se puede identificar fácilmente y se accede para la sujeción quirúrgica y la aplicación del torniquete. En las extremidades isquémicas invasiva estudios para el estudio de cerebro y protección de la piel, la isquemia se indujo mediante la separación de la arteria femoral de la ingle y los ligamentos pinzamiento de la arteria femoral 2,15,18. La isquemia resultante de cualquiera extremidad manguitos de sujeción o femoral de la arteria ha sido confirmado por los cambios en la extremidad incluyendo una pérdida de pulso, disminución en la oxigenación y una caída en la temperatura de la piel. Isquemia a distancia puede ser confirmado por la pérdida de pulso utilizando Doppler láser o ultrasonido Doppler 17-19. Temperatura de la piel se puede utilizar como alternativa a Doppler aunque la relación no es lineal 20,21. Grabaciones precisas de temperatura son comunes en los laboratorios y lataser fácilmente incorporados en los estudios isquémicas remotas. Una alternativa a la cirugía de fijación femoral es la inducción de isquemia usando un torniquete. Aplicación del torniquete produce isquemia comparable al conseguido con sujeción buque; Kutchner et al. comparación de la arteria femoral invasiva de sujeción para un torniquete no invasivo y encontraron ambos métodos detuvieron el flujo sanguíneo a la extremidad y daño de la piel reducido en un modelo de cirugía plástica de la isquemia colgajo de piel 18. Manguitos ya sea la pierna o el brazo y el aumento de la presión del manguito a encima de la presión arterial sistólica se ha encontrado para ser protector contra el daño isquémico en cerdos y seres humanos 17,19,22. Different torniquete se acerca a inducir remoto incluye isquémica el uso de un manguito de presión arterial o un 17,22,23 banda elástica. Sin embargo, el uso de una banda elástica para inducir isquemia es un método inseguro, potencialmente dando lugar a una cantidad no regulada de presión en elextremidad, con aumentos de presión por encima de 500 mmHg siendo grabado en los seres humanos 24. Además, isquemia de las extremidades usando una banda elástica conduce a daño muscular en ratas después de la eliminación de la banda 23, según la evaluación de colorante azul de Evans, un marcador in vivo de la permeabilidad de miofibras 25. En contraste, la entrega de una presión controlada para el torniquete se puede lograr utilizando un manguito de presión arterial conectado a un 17,19,22,26 esfigmomanómetro. En este estudio, se utilizó un modelo de lesión de luz de degeneración de los fotorreceptores para demostrar la eficacia neuroprotectora de precondicionamiento isquémico remoto. Isquemia a distancia se indujo inmediatamente antes de la lesión luz, evitando la posterior degeneración de los fotorreceptores según lo confirmado por las pruebas de la función retiniana. El video que acompaña demostrará la aplicación de isquemia a distancia no invasiva.

<table><tbody><tr><td>Esfigmomanómetro aneroide de mano DuraShock de la serie</td><td>Gold Welch Allyn</td><td>DS56</td><td>Esfigmomanómetro manual</td></tr><tr><td>Neonato [tamaño 2] 1 tubo, paquete de 10</td><td>Welch Allyn</td><td>5082-102-1</td><td>Manguito de presión arterial para extremidades</td></tr><tr><td>Adaptador de bloqueo Luer</td><td>Welch Allyn</td><td>5082-178</td><td>Adaptador para manguito neonatal</td></tr><tr><td>Cápsula de termistor</td><td>AD Instruments</td><td>Unidad de temperatura cutánea</td> <td>ML 309</td></tr><tr><td>Sonda de temperatura cutánea</td><td>AD Instruments</td><td>MLT 422/A</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab, herrajes de adquisición de 4 canales</td><td>AD Instruments</td><td>PL 35044</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de mantas homeotérmicas con sonda flexible</td><td>Harvard Appartus</td><td>507222F</td><td></td></tr><tr><td>Toalla</td><td></td><td></td><td>opcional: isquemia remota despierta</td></tr><tr><td>Isoflo - 100% Isoflurano (250 ml)</td><td>Abbot Animal Health</td><td>05260-05</td><td>opcional: anestésico inhalatorio isquemia a distancia</td></tr><tr><td>Ketamil - ketamina 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>opcional: anestésico inyectable isquemia a distancia</td></tr><tr><td>Xilio - xilacina 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>opcional: anestésico inyectable isquemia a distancia</td></tr></tbody></table>

limb remoto preacondicionamiento isquémico: una técnica neuroprotector en roedores

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Isquemia subletal protege los tejidos contra la posterior isquemia, más severa a través de la regulación positiva de mecanismos endógenos en el tejido afectado. Isquemia subletal también se ha demostrado que upregulate mecanismos de protección en los tejidos remotos. Un breve período de isquemia (5-10 min) en la extremidad posterior de mamíferos induce respuestas de autoprotección en el cerebro, los pulmones, el corazón y la retina. El efecto es conocido como el precondicionamiento isquémico remoto (RIP). Es una manera terapéuticamente prometedor de proteger órganos vitales, y ya está en ensayos clínicos para lesiones del corazón y el cerebro. Esta publicación muestra un método controlado, mínimamente invasivo de hacer una extremidad - específicamente la extremidad posterior de una rata - isquémica. Un manguito de presión arterial desarrollado para su uso en neonatos humanos está conectada a un esfigmomanómetro manual y utiliza para aplicar presión 160 mmHg alrededor de la parte superior de la extremidad posterior. Una sonda diseñada para detectar la temperatura de la piel se utiliza para verificar la ischemiuna, mediante el registro de la caída de la temperatura de la piel causado por la oclusión inducida por la presión de las arterias de las piernas, y el aumento de temperatura que sigue a la liberación del manguito. Este método de RIP protege a la retina de ratas contra el daño inducido por la luz brillante y la degeneración.

Un manguito de presión arterial elevada por encima de 160 mmHg detiene el flujo sanguíneo a la extremidad posterior como se ve claramente en la figura 1B. La falta de oxigenación de los tejidos resultó en una reducción de la temperatura del pie del animal para un protocolo de isquemia-reperfusión (Figura 2). La temperatura del pie (33 ° C) fue menor que la temperatura central y la reducción de forma fiable durante la elevación de presión del manguito (31 ° C) aumentando cuando el brazal...

Precondicionamiento isquémico remoto (RIP) es un método de acondicionamiento de tejidos contra el estrés perjudicial. Hemos establecido un método de isquemia a distancia hacia la extremidad posterior, inflando un manguito del esfigmomanómetro durante 5-10 minutos. Las capacidades neuroprotectoras de RIP se han demostrado en un modelo de degeneración de la retina en los roedores.

Limb remoto Preacondicionamiento Isquémico: una técnica neuroprotector en roedores

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

El objetivo general de este procedimiento es administrar isquemia en la extremidad posterior que condiciona los tejidos remotos contra el estrés posterior. Por ejemplo, la retina contra las lesiones leves. Esto se logra calibrando primero el manómetro manual Ingle mom.A continuación, se anestesia al animal y se le coloca una almohadilla térmica. A continuación, se extiende la pata trasera del animal y se coloca el manguito en su posición. Finalmente, la isquemia remota se realiza inflando el manguito con la bomba, desinflando el manguito y repitiendo el proceso por segunda vez.En última instancia, cuando se aplica antes de la lesión por luz, la isquemia remota se utiliza para mostrar una mejora en la función de la retina y en el número de fotorreceptores que sufren apoptosis. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la neurociencia, como por ejemplo cómo se induce la autoprotección con el preacondicionamiento isquémico a distancia para llevar a cabo el seguimiento de la temperatura de la piel en tiempo real. Abra el software de registro de temperatura, ajuste la temperatura a entre 30 y 35 grados centígrados y la frecuencia de muestreo a cada 100 milisegundos usando un brazalete neonatal de tamaño dos para una rata de 250 a 550 gramos, conecte el manguito al manómetro fome usando un adaptador si es necesario.A continuación, desinfle el manguito aflojando la válvula de liberación de aire o desconectando el tubo del manguito del adaptador. Asegúrese de que no quede presión en el tubo y que la aguja del manómetro descanse en cero dentro del rectángulo ovalado. Luego, para verificar la presión entre el tubo, el manómetro y la tos.Use bombeos suaves de la bombilla de inflado para inflar el brazalete hasta que el manómetro marque 100 miligramos de mercurio. Después de asegurarse de que la presión se mantenga constante, desinfle el manguito abriendo lentamente la válvula de liberación de aire después del anochecer, adaptando al animal de acuerdo con el protocolo de texto. Confirme que tiene un buen tono muscular pellizcando la extremidad trasera superior para confirmar que hay suficiente músculo presente.Después de sedar al animal de acuerdo con el protocolo de texto, verifique la profundidad de la anestesia extendiendo la pata y pellizcando la piel en la parte inferior del pie. A continuación, aplica lágrimas artificiales. Coloque a la rata en una almohadilla térmica o en un tubo de calentador de agua circulante en posición prona con las almohadillas de los pies de las extremidades inferiores hacia arriba.Para aplicar la sonda de temperatura de la piel, extienda la pata de la rata que sufrirá isquemia y coloque firmemente la sonda de piel en la almohadilla del pie, colocándola para maximizar el contacto entre la sonda de temperatura y la piel. A continuación, utilice cinta de papel para fijar la sonda. Verifique la ubicación de la sonda cutánea rastreando la temperatura en el software de registro de temperatura durante uno o dos minutos.Asegúrese de que la temperatura de la piel esté entre 30 y 34 grados centígrados y se mantenga estable. De lo contrario, ajuste la sonda para realizar la isquemia a distancia. Comience con un manguito desinflado y asegúrese de que la válvula de presión de aire esté cerrada.Extienda la pierna y rodee sin apretar el manguito en la extremidad trasera superior. Use el dedo índice y el pulgar para extender la pierna y los dedos inferiores para mantener el brazalete aflojado en su posición. Ahora, aumente la presión del manguito a 160 milímetros de mercurio.Una vez que se alcance la presión correcta, inicie el temporizador y los registros de la temperatura del pie. La temperatura del pie debe descender dos grados centígrados después de cinco minutos de presión constante, bombear repetidamente la bombilla de inflado en ráfagas cortas para mantener la presión deseada en el manguito y mantener la posición del manguito por encima de la rodilla del animal durante toda la isquemia. Administre isquemia remota de forma continua durante cinco minutos.A continuación, suelte la válvula de presión de aire para una reperfusión de cinco minutos antes de repetir la isquemia a distancia. Una vez finalizado el procedimiento, desinfle la presión del manguito aflojando la válvula de presión de aire. Comprobar el cambio de temperatura a lo largo del protocolo de isquemia.A continuación, suelte el brazalete. Coloque al animal sobre una almohadilla térmica y continúe monitoreando hasta que esté ambulatorio. Cuando el animal esté caminando, devuélvalo a su alojamiento.Por último, realice una lesión leve y realice el ensayo de túnel. De acuerdo con el protocolo de texto, como se ve claramente aquí, un manguito de presión arterial colocado por encima de la rodilla elevado a más de 160 milímetros de mercurio detiene el flujo sanguíneo a la extremidad trasera. La falta de flujo sanguíneo resultó en una reducción en la temperatura del pie que era más baja que la temperatura central del animal, y que aumentó después de que el manguito se desinfló, lo que concuerda con la condición necesaria para la RIP.En esta figura, el electrorretinograma adaptado a la oscuridad o ERG de una rata normal y tenue mostró un gran fotorreceptor y una respuesta retiniana interna a un destello brillante una semana después de la lesión por luz. Los registros de ERG mostraron una reducción severa en la amplitud en relación con los controles, lo que refleja la pérdida de fotorreceptores, sin embargo, el precondicionamiento de la extremidad posterior con isquemia utilizando un protocolo de reperfusión de dos por cinco minutos inmediatamente antes de la isquemia protegió a los fotorreceptores de lesiones leves. Este panel muestra que las amplitudes R-I-P-E-R-G fueron mayores que las lesiones leves solas, con una ligera reducción de la onda A.Por último, un brazalete colocado por debajo de la rodilla no protege a los fotorreceptores de las lesiones leves, como se refleja en las amplitudes ERG reducidas que se ven aquí. Se pueden realizar métodos como el preacondicionamiento isquémico a distancia para responder a preguntas adicionales, como cuáles son los mecanismos de neuroprotección endógena y cómo se puede aplicar la isquemia a distancia para mejorar la función de la lesión y la degeneración del SNC.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

El procedimiento quirúrgico para la inducción de isquemia miembro posterior unilateral se demuestra, con la confirmación de la isquemia por imágenes de perfusión Doppler láser.

Modelo murino de isquemia Miembro Posterior

Hay evidencia acumulada, que el precondicionamiento isquémico (PC) - un reto isquémico no perjudicial para el cerebro - confiere una protección transitoria a una posterior lesión isquémica perjudicial. Hemos establecido oclusión de la arteria carótida común bilateral (BCCAO) como un estímulo para inducir la tolerancia de preacondicionamiento isquémico temprano (IT) de la isquemia cerebral focal transitoria (inducida por la oclusión de la arteria cerebral media, OACM) en ratones C57BL6 / J.

Bilateral Común oclusión de la arteria carótida como un estímulo de preacondicionamiento adecuado para inducir la tolerancia isquémica precoz de isquemia cerebral focal

Fuente: Zheng, Y., et al. Modelos experimentales para estudiar la neuroprotección del postcondicionamiento ácido contra la isquemia cerebral. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la aplicación del postacondicionamiento ácido (APC) para evaluar sus efectos neuroprotectores contra la lesión isquémica en un modelo de ratón de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO). Describe los pasos involucrados en la reperfusión en el modelo MCAO y la aplicación de APC durante la reperfusión para...

 Evaluación de los efectos neuroprotectores del postacondicionamiento ácido en un modelo de ratón de isquemia cerebral

Fuente: Poinsatte, K., et al., Cuantificación de la protección neurovascular después del preacondicionamiento hipóxico repetitivo y la oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el método de preacondicionamiento hipóxico repetitivo (RHP) al exponer a un ratón a ciclos de hipoxia controlados antes de inducir un accidente cerebrovascular isquémico. El experimento evalúa sus efectos sobre la estabilidad de la barrera hematoencefálica, la...

Adaptación neuronal al preacondicionamiento hipóxico repetitivo en ratones

Fuente: Brandli, A. Preacondicionamiento isquémico de extremidades remotas: una técnica neuroprotectora en roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra un protocolo de preacondicionamiento isquémico no invasivo de extremidades en ratas para inducir neuroprotección sistémica. El procedimiento implica la oclusión arterial controlada y la reperfusión, lo que desencadena vías de estrés celular que liberan factores protectores. Estos factores aumentan la resistencia a las lesiones isquémicas y...

Preacondicionamiento isquémico no invasivo de extremidades en un modelo de rata para neuroprotección

El electrorretinograma (ERG) es un potencial eléctrico generado por la retina en respuesta a la luz. En este trabajo se describe cómo utilizar el ERG para evaluar la función de la retina, en ratas adaptadas a la oscuridad, y cómo se puede utilizar para evaluar una intervención neuroprotectora, en el presente caso el precondicionamiento isquémico a distancia.

Utilizando el Electrorretinograma para evaluar la función en el Roedor Retina y los efectos protectores de distancia Limb Preacondicionamiento Isquémico

Este protocolo describe el precondicionamiento hipóxico repetitivo, o exposiciones breves a la hipoxia sistémica que reducen los volúmenes de infarto y la interrupción de la barrera hematoencefálica después de una oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones. También detalla la cuantificación dual del volumen del infarto y la alteración de la barrera hematoencefálica después de un accidente cerebrovascular para evaluar la eficacia de la protección neurovascular.

Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

El corazón de rata aislado es un modelo duradero para la lesión por isquemia y reperfusión. Aquí, describimos el proceso de recolección del corazón latiendo de una rata a través de la canulación aórtica in situ, la perfusión de Langendorff del corazón, la lesión simulada por isquemia-reperfusión y la tinción del infarto para confirmar la extensión de la agresión isquémica.

Inducción y Evaluación de la isquemia-reperfusión en perfundidos Langendorff corazones de ratas

La inducción quirúrgica de la isquemia de las extremidades posteriores en el ratón es útil para examinar la angiogénesis, sin embargo, esto se ve comprometido en ciertas cepas endogámicas de ratón que muestran una marcada necrosis tisular inducida por la isquemia. Se describen métodos para inducir isquemia subaguda de las extremidades utilizando constrictores ameroides, para eludir este problema mediante la inducción de una oclusión arterial gradual.

Los métodos para aguda y subaguda murino de isquemia del miembro posterior

El postcondicionamiento ácido protege contra la isquemia cerebral. Aquí presentamos dos modelos para ejecutar APC. Se consiguen respectivamente transfiriendo rebanadas corticostriatales a un tampón ácido después de la privación de oxígeno-glucosa in vitro e inhalando 20% de CO 2 después de la oclusión de la arteria cerebral media in vivo .

Modelos Experimentales para Estudiar la Neuroprotección del Acondicionamiento Acido Contra la Isquemia Cerebral

Este protocolo demuestra cómo realizar una amputación por debajo de la rodilla en ratas y realizar inmediatamente la inervación muscular dirigida (iTMR) para investigar estrategias que traten y previenen el dolor relacionado con la amputación y para comprender mejor los mecanismos del dolor asociados a la amputación.

Modelo de amputación de la extremidad posterior de rata por debajo de la rodilla y reinervación muscular dirigida inmediata

Aprende el preacondicionamiento isquémico remoto en ratas para proteger la retina contra daño por luz. Este método mínimamente invasivo mejora la función retiniana y reduce la apoptosis de fotorreceptores.

Limb remoto Preacondicionamiento Isquémico: una técnica neuroprotector en roedores

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