Derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de Células Madre

El objetivo general de este procedimiento es derivar de forma reproducible el epitelio pigmentario de la retina de alta calidad, o EPR, a partir de células madre. Esto se logra cultivando primero células madre pluripotentes inducibles hasta la cofluidez. En el segundo paso, se cambia el medio para dirigir las células a los destinos del EPP.

A continuación, las células del EPR se aíslan de las otras células diferenciadas en la placa, y luego los cultivos se expanden hasta que se obtiene un número suficiente de células. En última instancia, la pigmentación oscura y las morfologías adoquinadas de los cultivos se pueden utilizar para confirmar que las células del EPR están alcanzando la diferenciación terminal. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la diferenciación espontánea, es que la adición de factores definidos acelera la diferenciación, el tiempo y aumenta el rendimiento del EPR.

Hasta la fecha, miles de roedores se han curado utilizando células EPR, derivadas de una variedad de enfermedades degenerativas de la retina IPSA. Sin embargo, si traducimos esto de manera eficiente y efectiva en el tratamiento de humanos en las clínicas con estas enfermedades, es absolutamente imperativo que desarrollemos protocolos reproducibles bien establecidos, que nos proporcionarán alta calidad, altos números de ventas de RPE e IPS. La presentación visual de este método es esencial, solo una persona puede trabajar en el microscopio bajo el capó en un momento dado. lo que dificulta la visualización del paso de aislamiento. Mitchell Prince, un técnico de investigación de mi laboratorio, demostrará ahora el protocolo asociado con los aspectos del cultivo digital del procedimiento: Para dirigir la diferenciación del cultivo de EPR derivado de células madre, la línea de células madre de interés en una capa de células alimentadoras embrionarias de ratón a dos veces 10 a las seis células por pocillo de una placa de seis pocillos, Permita que las colonias alcancen la fluidez de COF y luego cambie a la alimentación diaria con diferenciación.

Medio suplementado con nicotinamida. Después de tres semanas, comience a agregar activo en un o IDE a las alimentaciones para mejorar la diferenciación del EPR. Dos semanas más tarde, vuelva al medio de diferenciación y a la nicotinamida sola, interrumpiendo las tomas diarias.

Una vez que los indicadores de pH en el medio dejen de volverse amarillos el día después de la alimentación, regrese el cultivo a la incubadora hasta que aparezcan los ojales de las células pigmentadas que son lo suficientemente grandes como para ser cortados y eliminados. Para aislar los ojales pigmentados, a continuación, se aplican los pocillos de una placa de 24 pocillos con una matriz libre de xeno que imita el entorno celular natural. A continuación, llene tantos pocillos de la placa de 24 pocillos con medios de diferenciación como sea necesario.

Y en una campana de cultivo celular, use un telescopio de disección y un bisturí para cortar cada ojal pigmentado en la parte inferior de la placa original en dos a seis piezas y agarre las partes pigmentadas con pinzas afiladas y luego transfiera una a dos piezas pigmentadas a cada una.24. Incubar bien la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres a cinco días hasta que las células se adhieran. Luego comience a cambiar los medios tres veces por semana.

Expanda las células durante tres o cuatro semanas en el medio de diferenciación. Continuar alimentando las células tres veces por semana para pasar. El RPE añade 200 microlitros de solución de disociación celular precalentada sin tripsina a 37 grados Celsius para separar las células.

Después de cinco a ocho minutos, detenga la reacción con medios de diferenciación nuevos y luego vuelva a suspender los cultivos en suspensiones unicelulares con una pipeta de 200 microlitros, agrupando las colonias con pocas células. A continuación, transfiera las colonias disociadas a tubos de 15 mililitros y gire las células. Resus, suspendiendo los gránulos en tres mililitros de medio de diferenciación, cada uno transfiere las colonias a cada pocillo de una placa de seis pocillos codificada en matriz que contiene tres mililitros adicionales de medio de diferenciación por pocillo.

A continuación, expanda las células durante una o dos semanas hasta que las células tengan aproximadamente un 90% de confluentez y separe las células de nuevo en un mililitro de solución de disociación como se acaba de demostrar. A esta hora. Usando una pipeta de 1000 microlitros para resuspender las células, transfiera la solución de una sola célula a un tubo cónico de 50 mililitros.

Y luego, después de girar las celdas nuevamente res, suspenda la bolita. En 18 mililitros de diferenciación, los medios finalmente relaminan las células en un contenedor de cultivo codificado en matriz para obtener el número máximo de células deseadas en el número mínimo de pasos para un análisis posterior, las colonias pigmentadas comienzan a aparecer después de cinco a siete semanas de cultivo de la línea de células madre pluripotentes inducibles. Estas colonias pueden continuar creciendo durante semanas a medida que se mantienen los cultivos.

Una vez que alcanzan un tamaño suficiente, se pueden extirpar manualmente. La escisión cuidadosa para evitar la contaminación con células que no son EPR facilita en gran medida la generación de cultivos de EPR suficientemente puros. Una vez dominado, se puede derivar un gran número de células RPE en ocho a 12 semanas si la técnica se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que hay que tener cuidado de no contaminar los cultivos mientras se fabrican los medios y se alimentan las células. Después de ver este video, esperamos que muchos de ustedes puedan producir grandes cantidades de células RPE de alta calidad a partir de IPS. Con suerte, esto facilitará una traducción más rápida del laboratorio a la cabecera del paciente, y ofrecerá terapias basadas en células a los pacientes que padecen enfermedades neovasculares degenerativas de la retina actualmente intratables.