Name: Derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de Células Madre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprenda a derivar células del epitelio pigmentario retiniano de células madre pluripotentes mediante diferenciación dirigida con factores definidos. Este protocolo eficiente acelera la producción de RPE de alta calidad para terapias celulares y estudios de degeneración retinal.

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Deseamos agradecer a las siguientes personas: Dres. Tim Krohne y Eyal Banin (junto con la Dra. Mandy Lehmann y David Friedlander) por su generosa ayuda en el desarrollo de los protocolos de diferenciación. La Dra. Felicitas Bucher brindó asistencia para diferenciar las células EPR utilizadas en este estudio. También agradecemos al Instituto Nacional del Ojo (subvenciones del NEI EY11254 y EY021416), al Instituto de Medicina Regenerativa de California (subvención CIRM TR1-01219) y al Instituto de Investigación Médica Lowy (LMRI) por su generosa financiación para este proyecto.

1. diferenciación dirigida de Stem Cell-RPE derivados NOTA: Todos los pasos de la incubación se realizó a 37 ° C en el 5% de CO 2 <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mantener el SUH o ​​caderas líneas (alimentar diariamente) en medio de mantenimiento (MM, Tabla 1). Una vez que las líneas han llegado a las normas suficientes de control de calidad, mantenerlos en una capa de células alimentadoras de ratón embrionario (MEFs) sembradas a una densidad de 250.000 / pocillo de una placa de seis pocillos. Culturas-Xeno libre también pueden ser generados siguiendo el protocolo establecido por Tucker et al. 40. </li><li> Permita que las colonias de células madre para llegar a la confluencia. </li><li> Cambie a medio de diferenciación con nicotinamida (DM / NIC, Tabla 1); alimentar a diario. </li><li> Después de tres semanas en cultivo, cambiar a medio de diferenciación con nicotinamida y, o bien activina-A o IDE-1 (DM / NIC / AA o DM / NIC / IDE1, Tabla 1) para mejorar la diferenciación RPE. </li&gt; <li> Después de cinco semanas en cultivo, volver a DM / NIC. Alimentación diaria ya no son necesarios una vez que los indicadores de pH en la parada de los medios de comunicación se tornan amarillas el día después de la alimentación. </li><li> Espere a islotes de células pigmentadas en aparecer que son lo suficientemente grandes como para ser corta y se retira (Ver Figuras 2D-F y 3A). </li></ol> 2. Aislamiento pigmentadas Islotes <ol style="margin-left: 40px;"><li> Cubra los pocillos de una placa de 24 pocillos con una matriz que imita el entorno natural de la célula (es preferible-xeno gratis). NOTA: cuchillas de córnea y afilados, pinzas de punta fina son muy útiles para el picking. Toda la hoja de células diferenciadas puede separar al recoger. Evitar esto trabajando cuidadosamente y recogiendo inicialmente colonias en el centro del plato. </li><li> Rellene tantos pocillos de la placa de 24 pocillos con medio de diferenciación (DM; Tabla 1), según sea necesario. Esta decisión dependerá de la cantidad de colonias pigmentadasrecogido. </li><li> En una campana de cultivo de células con un microscopio de disección, corte manualmente islotes pigmentadas. Picar cada islote en la parte inferior de la placa original utilizando un bisturí en unos 2-6 piezas y agarrar las partes pigmentadas con pinzas cortantes. </li><li> Transferencia 1-2 piezas pigmentadas en cada uno de 24 pocillos. </li><li> No cambie los medios de comunicación durante 3-5 días hasta que las células se adhieran, a continuación, empezar a cambiar los medios de comunicación, tres veces por semana. (Si no se adhieren después de este tiempo, la probabilidad es bueno que ellos nunca lo hará). </li><li> Expandir las células durante 3-4 semanas en medio de diferenciación (DM; Tabla 1) - Una imagen de un cultivo típico se muestra en la Figura 3B. Las células todavía no pueden llenar todo el bien pero espera más largo no parece ayudar. Alimentar a las células tres veces por semana. </li><li> Después de 3 semanas, retire manualmente grupos de células blancas en grupos si es necesario con pinzas cortantes. No hacer este paso a menos que sea necesario - es fácil de introducir contaminantes. Es ideal paratratar de obtener poblaciones puras de RPE de las colonias pigmentadas originales en el paso 1.6. </li></ol> 3. pases de células madre derivadas de RPE <ol style="margin-left: 40px;"><li> Separar las células con 200 l con una solución de disociación celular (preferiblemente no tripsina-un reactivo que puede ser inactivado mediante dilución es preferible) durante 5-8 min a 37 ° C, e inactivar por dilución con DM. Usar una pipeta de 200 l para lavar todas las células y resuspender ellos (Si el pozo seleccionado contiene sólo unas pocas células, considere la agrupación de las células a partir de dos 24-pozos). </li><li> Se centrifuga (800 xg durante 5 min), desechar el sobrenadante y resuspender en 3 ml de medio DM. </li><li> Células Re-placa de uno (o dos) 24-pozos en una sola matriz recubierta de 6 pocillos en 3 ml de DM por pocillo (1: 5 de expansión). </li><li> Expandir durante 1-2 semanas hasta que las células son ~ 90% de confluencia; una imagen de cultivo puro totalmente diferenciada se muestra en la Figura 3C. </li><li> Separe las células con 1 ml de células dissociation solución durante aproximadamente 5-8 min a 37 ° C, inactivar por dilución con DM, utilice 1.000 l pipeta para lavar todas las células, y resuspender ellos. </li><li> Centrifugar (800 xg durante 5 min), desechar el sobrenadante y resuspender en 18 ml de medio DM. </li><li> Re células de placa de un 6 pocillos cada uno en seis matriz recubierta 6 pocillos en 3 ml de DM por pocillo (1: 6 de expansión) o uno-recubierto 75cm 2 matraz (1: 7,5 de expansión). </li><li> Repita los pasos 3.4 a 3.8, según sea necesario hasta que se obtengan suficientes células. NOTA: Trata de recoger la mayor cantidad de colonias como sea posible para la expansión en lugar de planificar para amplificar las culturas a través de pases ya que cada paso induce RPE desdiferenciación. </li></ol>

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Ninguno de los autores tiene divulgaciones comerciales que declarar.

En este manuscrito resumimos los pasos para generar eficientemente un gran número de culturas iPS-EPR puros. Hemos demostrado anteriormente utilizando este protocolo diferenciación dirigida con activina A que podemos generar iPS-EPR que se asemejan fuertemente hRPE basado en la transcriptómica, proteómica, metabolómica y funcionalidad, y que retardar la degeneración de la retina cuando se implanta en ratas RCS 12,31,32 . El proceso de generación de iPS-RPE es mucho tiempo, pero no laboriosa (Figura 1)...

Los diversos tipos de células que ocupan la retina están organizados en una arquitectura funcional. Los fotorreceptores en la parte posterior de la retina se encargan de convertir la luz en impulsos eléctricos a través de la fototransducción. Sin embargo, la fototransducción no puede ocurrir sin los esfuerzos coordinados de otros tipos de células vecinas, incluidas las células de la glía de Mueller y el epitelio pigmentario de la retina (EPR). Una monocapa de células EPR separa la retina sensorial de la coriocapilar, el principal suministro de sangre para los fotorreceptores, y están idealmente situadas para controlar múltiples funciones importantes para la homeostasis de los fotorreceptores. De hecho, el EPR y los fotorreceptores son tan codependientes que se considera ampliamente como una sola unidad funcional. (Para una revisión de todas las diversas funciones del EPR, véase Strauss, 2005:1). La muerte o disfunción de las células del epitelio pigmentario de la retina puede inducir degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de pérdida permanente de la visión en los países industrializados2-4. 
AMD es una enfermedad multifactorial del EPR, los fotorreceptores y la vasculatura coroidea; los factores de riesgo son diversos e incluyen combinaciones de influencias ambientales y genéticas5,6. Los tratamientos para la DMAE son muy limitados, pero una terapia potencial prometedora es el reemplazo de células EPR7,8. Si bien los resultados han sido mixtos, el trasplante de células EPR en pacientes con DMAE (y en otros pacientes con degeneración de la retina) y también en modelos de degeneración de la retina en roedores, tiene el potencial de prevenir transitoriamente la atrofia significativa de los fotorreceptores9-23. (El modelo animal comúnmente utilizado para estos estudios son ratas del Royal College of Surgeons (RCS), que albergan una mutación en el gen MerTK. Esta mutación hace que las células EPR sean incapaces de fagocitar los segmentos externos de los fotorreceptores y promueve ladegeneración de la retina. Si bien las tasas de supervivencia reportadas del EPR implantado en el espacio subretiniano de ratas y ratones RCS varían enormemente, existe la posibilidad de que sobrevivan durante varios meses o años9,10,12,20. 
Las células RPE pueden obtenerse en cantidades suficientes para el trasplante derivarlas de células madre pluripotentes9-14,25-28. Varios grupos independientes han demostrado que estas células funcionan de manera similar a sus contrapartes somáticas, y los estudios a largo plazo sugieren que son seguras tras su implantación en modelos de enfermedad de ratas y ratones9,10,12,14,19,20,25,29-32. El uso de células madre pluripotentes inducidas en lugar de células madre embrionarias puede ser ventajoso, ya que se pueden obviar las cuestiones éticas y los desafíos inmunológicos asociados con el EPR alogénico33,34. Otra aplicación interesante de la tecnología iPS es el modelado de enfermedades35. La capacidad de interrogar a un gran número de células EPR derivadas de pacientes con enfermedades EPR podría ser invaluable para comprender sus bases moleculares. Este tipo de estudio se ha realizado recientemente con el paciente con la enfermedad Best RPE y podría allanar el camino para estudios similares de maculopatías hereditarias36. 
La derivación de EPR a partir de células madre es un proceso relativamente simple y se puede realizar completamente en condiciones libres de xeno. La estrategia más simple es derivar monocapas de células EPR de forma espontánea, sin embargo, el rendimiento se puede mejorar significativamente utilizando técnicas de diferenciación dirigida. Pero estas técnicas implican el uso de factores proteicos exógenos que pueden ser costosos y a menudo generados en bacterias u otras fuentes no humanas10,12,37. En nuestros estudios seguimos un protocolo establecido10 que utiliza nicotinamida y Activina A, un factor de señalización que ha demostrado ser suficiente para la especificación del EPR38. Aquí demostraremos que la pequeña molécula IDE-1 puede reemplazar adecuadamente a la Activina A, reduciendo así los costos y aliviando las preocupaciones asociadas con el uso de proteínas recombinantes39. Además, utilizamos el reemplazo de suero libre de xeno y cultivamos las células RPE diferenciadoras en un sustrato sintético libre de xeno. Se ha demostrado previamente que las células EPR se diferencian de manera muy efectiva utilizando este enfoque40.
Cuando se diferencian como una monocapa, visualizamos colonias pigmentadas que contienen células EPR después de tan solo cinco semanas12. Una vez que alcanzan el tamaño suficiente, se pueden extirpar manualmente y transferir a otro plato para su expansión. Las células EPR son conocidas por desdiferenciarse con cada pasaje, y se debe evitar el uso de cualquier cosa que tenga más de cinco pasajes (encontramos que se puede generar fácilmente un número suficiente de células para la caracterización y el trasplante en modelos animales después de dos o tres pasajes). Una vez completamente diferenciadas, empleamos múltiples técnicas para caracterizar las células anatómica y funcionalmente para asegurarnos de que servirán como reemplazos adecuados para el EPR enfermo. La descripción de estas técnicas y el protocolo para implantar el iPS-RPE en el espacio subretiniano de roedores, están fuera del alcance de este trabajo de métodos y han sido publicados previamente12,32,41. 
Si bien el desarrollo de protocolos estandarizados para la derivación efectiva de iPS-RPE es claramente importante para las clínicas, también queda mucho trabajo preclínico por hacer en modelos animales. Existen preocupaciones con respecto a la inmunogenicidad de las células derivadas de iPS, y se están explorando múltiples técnicas de implantación diferentes, incluida la implantación de células en sustratos artificiales42,43. Por estas razones, creemos que la publicación de protocolos estandarizados es beneficiosa para facilitar los estudios tanto clínicos como preclínicos. Especialmente si se van a hacer comparaciones directas de células iPS-RPE derivadas en diferentes laboratorios por diferentes grupos de investigación.

<table><tbody><tr><td>Cuchillo de córnea&nbsp;</td><td>Cuchillo Surgipro</td><td>SPOI-070</td><td>x</td></tr><tr><td>1 DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml x 4&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 1X sin Ca o mg</td><td>VWR</td><td>45000-434</td><td>500 ml x 6</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, regular (inactivado por calor)</td><td>VWR</td><td>45000-736</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 10-155) Proteína humana recombinante</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td>100 y micro; g x 1</td></tr><tr><td>IDE-1</td><td>Vástago</td><td>04-0026</td><td>2 mg x 1</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales 100X&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>100 g x 1</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td>20 ml x 1</td></tr><tr><td>Activina Recombinante Humana/Murina/Rata A&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>120-14E</td><td>10 y micro; g x 2</td></tr><tr><td>Synthemax-T Superficie 6 Placas de Pocillos</td><td>Corning</td><td>3877</td><td>Caja(12) x 1</td></tr><tr><td>Enzima TrypLE-Express (1X), sin rojo fenol&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12604-021</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro de vacío/sistema de botella de almacenamiento, 0.1&micro; m poro, 500ml&nbsp;</td><td>Estuche</td><td>de 431475</td><td>Corning(12) x 1&nbsp;</td></tr></tbody></table>

derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de células madre

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No se ha descubierto una cura para la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de pérdida de visión en personas mayores de 55 años. La DMAE es una enfermedad multifactorial compleja de etiología desconocida, aunque se cree que se produce en gran medida debido a la muerte o disfunción del epitelio pigmentario de la retina (EPR), una monocapa de células que subyace a la retina y proporciona un apoyo fundamental a los fotorreceptores. Las estrategias de reemplazo de células EPR pueden ser muy prometedoras para proporcionar alivio terapéutico a un gran subconjunto de pacientes con DMAE, y las células EPR que se parecen mucho a las células humanas primarias (eRPE) se han generado en varios laboratorios independientes, incluido el nuestro. Además, los usos de iPS-RPE no se limitan a las terapias basadas en células, sino que también se han utilizado para modelar enfermedades de RPE. Este tipo de estudios no solo pueden dilucidar las bases moleculares de las enfermedades, sino que también pueden servir como herramientas invaluables para desarrollar y probar nuevos medicamentos. Presentamos aquí un protocolo optimizado para la diferenciación dirigida de EPR a partir de células madre. La adición de nicotinamida y activina A o IDE-1, una pequeña molécula que imita sus efectos, en puntos de tiempo específicos, mejora en gran medida el rendimiento de las células EPR. Con esta técnica podemos derivar un gran número de EPR de paso bajo en tan solo tres meses.

Los pasos descritos en este manuscrito, como se representa en la Figura 1, pueden ser utilizados para generar fácilmente RPE partir de células madre como se informó anteriormente 10,12. Después de mantener las líneas iPS para varias semanas, las colonias pigmentadas comienzan a aparecer en las colonias después de 5-7 semanas (7 semanas viejas culturas se muestran en la Figura 2A-C). Estas colonias pueden continuar creciendo durante semanas mientras se mantienen las culturas. ...

Las células de epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivadas de células madre pueden utilizarse para múltiples aplicaciones, incluidas las terapias basadas en células para la degeneración de la retina, el modelado de enfermedades y los estudios de fármacos. Aquí presentamos un protocolo simple para derivar de manera reproducible EPR a partir de células madre.

Derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de Células Madre

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

El objetivo general de este procedimiento es derivar de forma reproducible el epitelio pigmentario de la retina de alta calidad, o EPR, a partir de células madre. Esto se logra cultivando primero células madre pluripotentes inducibles hasta la cofluidez. En el segundo paso, se cambia el medio para dirigir las células a los destinos del EPP.A continuación, las células del EPR se aíslan de las otras células diferenciadas en la placa, y luego los cultivos se expanden hasta que se obtiene un número suficiente de células. En última instancia, la pigmentación oscura y las morfologías adoquinadas de los cultivos se pueden utilizar para confirmar que las células del EPR están alcanzando la diferenciación terminal. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la diferenciación espontánea, es que la adición de factores definidos acelera la diferenciación, el tiempo y aumenta el rendimiento del EPR.Hasta la fecha, miles de roedores se han curado utilizando células EPR, derivadas de una variedad de enfermedades degenerativas de la retina IPSA. Sin embargo, si traducimos esto de manera eficiente y efectiva en el tratamiento de humanos en las clínicas con estas enferme

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este video, vamos a demostrar cómo aislar las células madre de la retina del epitelio ciliar del ojo del ratón y hacer crecer en cultivo de forma clonal esferas de retina. Las esferas que se encuentran aisladas poseen las propiedades cardinales de las células madre: la auto-renovación y multipotencialidad.

Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

El perfil de madre humanas pluripotentes inducidas (iPS), el epitelio pigmentario de la retina (RPE) derivadas de células (iPS) (iPS-RPE) inducido por el hombre-madre pluripotentes, y RPE fetal microRNA (miRNA), fueron comparados.

Perfiles de expresión de microARN de las células iPS humanas, de la retina del epitelio pigmentario Derivado de Ips y Fetal epitelio pigmentario de la retina

Aquí presentamos un protocolo aceptado por la comunidad en formato multimedia para inyectar subretinialmente un bolo de células EPR en ratas y ratones. Este enfoque se puede utilizar para determinar los potenciales de rescate, los perfiles de seguridad y las capacidades de supervivencia de las células EPR injertadas tras la implantación en modelos animales de degeneración de la retina.

Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

El objetivo de este informe es describir los protocolos para derivar el epitelio pigmentario de la retina (EPR) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPS) utilizando diferentes tamaños de cuerpos embrionarios.

Derivadas del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de madre pluripotentes inducidas (iPS) células de diferentes tamaños de cuerpos embrionarios

Este protocolo describe cómo producir células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) de células madre pluripotentes. El método utiliza una combinación de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para dirigir la diferenciación de células madre en RPE inmaduro en catorce días y RPE madura y funcional después de tres meses.

Diferenciación rápida y dirigida de las células epiteliales del pigmento retiniano de humanos embrionarios o inducidas pluripotenciales células

Aquí presentamos un protocolo para diferenciar células del pigmento retiniano epitelio (RPE) de las células de vástago pluripotent humana teniendo mutaciones derivados del paciente. Las líneas celulares mutantes pueden utilizarse para el análisis funcionales como immunoblotting, inmunofluorescencia, abrazadera del remiendo. Este enfoque de la enfermedad en plato evita la dificultad de obtención de células de EPR humanas nativas.

Diferenciación, mantenimiento y análisis de células del epitelio pigmentario de la retina humana: un modelo de enfermedad en un plato para las mutaciones BEST1

Se describe un método para diseñar un retineano tejido compuesto de células epiteliales del pigmento retiniano derivadas de las células de vástago pluripotent humanas cultivadas sobre las membranas amnióticas humanas y su preparación para injerto en modelos animales.

Ingeniería del tejido epitelio pigmentario de la retina trasplante adecuado derivado de células madre embrionarias humanas

Aquí describimos un sistema optimizado de inducción organoide retiniana, que es adecuado para varias líneas de células madre pluripotentes humanas para generar tejidos retinianas con alta reproducibilidad y eficiencia.

Sistema de inducción organoide retiniana para la derivación de tejidos retinianas 3D a partir de células madre pluripotentes humanas

El primate no humano (NHP) es un modelo ideal para estudiar la terapéutica celular de la retina humana debido a las similitudes anatómicas y genéticas. Este manuscrito describe un método para el trasplante submacular de células epiteliales pigmentarias de la retina en el ojo NHP y estrategias para prevenir las complicaciones intraoperatorias asociadas con la manipulación macular.

Trasplante de epitelio pigmentario retiniano en un modelo de primate no humano para enfermedades degenerativas de la retina

Este estudio proporciona un protocolo detallado para la criopreservación eficiente de células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de células madre humanas.

Criopreservación de células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de células madre embrionarias humanas en la etapa óptima

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) actúa como una barrera crucial entre la coroides y la retina, promoviendo la salud y la función de los tipos de células de la retina, como los fotorreceptores. En este trabajo se describe un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento y cultivo de EPR murino adulto.

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Aprenda a derivar células del epitelio pigmentario retiniano de células madre pluripotentes mediante diferenciación dirigida con factores definidos. Este protocolo eficiente acelera la producción de RPE de alta calidad para terapias celulares y estudios de degeneración retinal.

Derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de Células Madre

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