Fraccionamiento rápida y aislamiento de componentes de sangre total en las muestras obtenidas a partir de una configuración basada en la comunidad

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un protocolo simplificado que permita un rápido rendimiento ocular y el procesamiento simultáneo de muestras de sangre completa. En un entorno no clínico, el procesamiento de vacutainer se realiza de manera superpuesta para permitir el aislamiento eficiente de fracciones de alta calidad de células mononucleares de sangre periférica D-N-A-R-N-A o suero pbmc y fracciones residuales de plasma y glóbulos rojos. El procesamiento comienza con la centrifugación del vacutanier de suero, la extracción de una alícuota de un fial que contiene vacutainer para el aislamiento del ADN, la centrifugación de los tubos de fial.

Luego, se puede completar el aislamiento del ADN: después del aislamiento del ADN, puede ocurrir el aislamiento del ARN derivado de leucocitos del vacutainer K dos EDTA. La sangre de cada vacutainer pasa a través de un filtro respectivo y se lava con PBS, luego se trata con un agente estabilizador de ARN que regresa al vacutainer que la contiene. El plasma residual se extrae y la capa mononuclear se lava con PBS.

Mientras los tubos giran, se recogen los glóbulos rojos residuales y el suero separado es una alícuota. Finalmente, los pbmc se conservan en medio de congelación celular. En última instancia, se pueden producir fracciones de sangre fresca de alta calidad dentro de las dos horas posteriores a la recolección y todas las muestras listas para el ensayo pueden estar disponibles dentro de los dos días.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que los procedimientos se pueden realizar simultáneamente en un entorno no clínico, lo que produce material de partida en dos días para una multitud de aplicaciones posteriores, incluidos los análisis de microarrays, epigenéticos, R-T-P-C-R y citometría de flujo. Amy Weckl, mi gerente de laboratorio, demostrará el procedimiento para comenzar el procesamiento de muestras de sangre completa. Asegúrese de que los tampones, la centrífuga y el bloque de calor estén preparados.

Documente la hora de la entrega del vacutainer en la hoja de seguimiento de la muestra. Una vez recibidas las muestras, documentar el aislamiento del suero. Tiempo de inicio en el registro de muestras, comience inmediatamente el procesamiento centrifugando el vacutainer de suero de siete mililitros con el freno y la aceleración apagados.

Utilizando un rotor de cubo oscilante con tapones de aerosol durante 20 minutos a 1300 GS, cuatro grados centígrados, mientras se centrifuga el vacutainer de suero. Documente la hora de inicio del aislamiento del ADN en una campana de cultivo de dos células BSL. Invierta cinco veces los recipientes de vacío que contienen el gel fial y agregue 200 microlitros de sangre entera desde la parte superior de uno de los vacutainer en cada una de las dos alícuotas de 20 microlitros de proteasa.

Deje los tubos de microcentrífuga de proteasa y sangre en la campana y continúe con la centrifugación de los recipientes de llamada que contienen vacío. Antes de la centrifugación. Documente la hora de inicio del aislamiento de PBMC, que debe ser dentro de las dos horas posteriores a la extracción de sangre.

Invierta la llamada FI que contiene recipientes de vacío que ya están en los recipientes herméticos para aerosoles de ocho a 10 veces. A continuación, centrifugar el vacutainer con el freno y la aceleración apagados durante 30 minutos a 1600 Gs 22 grados centígrados. Regrese a las muestras de aislamiento de ADN en la campana y agregue 200 microlitros de tampón al a cada uno de los tubos de microcentrífuga de proteasa y sangre.

Tapa los tubos y retíralos del capó. A continuación, vórtalos durante 15 segundos. Después de parpadear el vórtice inmediatamente, gire las muestras.

Proceda con el aislamiento del ADN como se describe en el protocolo de texto adjunto hasta que el ADN sea aludido de la columna sobre Ellucian. Se agrupó el ADN de las dos columnas por participante para obtener un rendimiento total de 800 microlitros por participante. Documentar la hora de inicio del aislamiento del ARN leucocitario.

Perfore el tabique de goma del vacutainer K two EDTA con una púa de transferencia. Guarde la funda y el tapón de rosca para su uso posterior después del montaje del sistema de tubos K two EDTA. Use el extremo de una espátula de metal para desenganchar la aguja de manera segura e insertarla en un tubo vacío de extracción de sangre de 10 mililitros vacío.

Invierta el conjunto del tubo receptor del filtro vacutainer K dos EDTA para completar la configuración Después de la filtración y el lavado A PBS, extraiga tres mililitros del agente estabilizador de ARN con una nueva jeringa de 10 mililitros. Enjuague el filtro asegurándose de que el agente estabilizador de ARN permanezca adherido. A continuación, separe la jeringa del filtro sin retraer el émbolo.

Selle la entrada y salida del filtro con la vaina y el tapón de rosca retenidos de la espiga de transferencia y deje el filtro saturado con el agente estabilizador de ARN. Almacene el filtro a menos 80 grados centígrados durante al menos dos horas hasta que el tiempo lo permita para completar el aislamiento de AR. Una vez que el vacutainer se devuelve a la campana BSL two, retire el tapón y utilice una pipeta serológica para extraer 1,5 mililitros de la capa de plasma superior sin acercarse a la capa mononuclear.

Transfiera el plasma de los dos vacutainer a un vial criogénico de cinco mililitros. A continuación, registre el volumen recopilado. Transfiera el plasma restante y la capa mononuclear mediante una pipeta serológica a un tubo cónico de 15 mililitros.

A continuación, añada suficiente XPBS previamente preparado para que el volumen total del tubo cónico ascienda a 15 mililitros. Tapa el tubo e inviértelo cinco veces. A continuación, centrifugar el tubo con la rotura y la aceleración apagadas durante 15 minutos a 300 GS 22 grados centígrados.

Regrese a los recipientes de vacío que contienen fial en la campana y recoja los glóbulos rojos o glóbulos rojos. Use una pipeta pastosa de cinco y tres cuartos de pulgada para girar y aflojar el exterior de la capa de gel fial y retirarla. Utilice una pipeta serológica para recoger y transferir los glóbulos rojos a un vial criogénico de cinco mililitros.

A continuación, registre el volumen. A continuación, transfiera los viales criogénicos de plasma y glóbulos rojos a un recipiente de congelación de velocidad controlada y guárdelos a menos 80 grados centígrados durante al menos 24 horas. Después de 24 horas, transfiera las muestras a una caja criogénica y devuélvalas a menos 80 grados centígrados para su almacenamiento a largo plazo.

Cuando se complete la centrifugación, regrese el tubo cónico a la campana y aspire el líquido, dejando 500 microlitros de PBS sin alterar el pellet. Agregue un XPBS para llevar el volumen a 10 mililitros y vuelva a suspender el pellet. Tape suavemente el tubo e inviértalo cinco veces.

A continuación, centrifugar la muestra con el freno y la aceleración desactivados durante 10 minutos a 300 GS 22 grados centígrados. Después de la centrifugación, alícuota la capa superior de suero del vacutainer en dos viales criogénicos de mililitros y documente el volumen. Utilice cuatro viales criogénicos y alícuotas de 200 microlitros en un vial criogénico.

Un 1000 microlitros en un vial criogénico dos. A continuación, divida el volumen restante en los viales criogénicos tres y cuatro. Transfiera los viales criogénicos a una caja criogénica y manténgalos a menos 80 grados centígrados para almacenarlos a largo plazo.

Y documente la hora de inicio del congelador. Continúe con el aislamiento de PBMC. Al devolver las muestras a la campana después de la centrifugación, aspire la mayor cantidad posible de sobrenadante sin alterar el pellet.

Suspendemos el pellet en 2,5 mililitros de PBMC. Mediano. Agregue 2.5 mililitros de PBMC, medio de congelación dos que contiene DMSO y RPMI.

Lleve el medio a la solución celular previamente preparada y vórtice suavemente la muestra. A continuación, alícuota 10 microlitros de la solución celular en un tubo de microcentrífuga. Agregue 10 microlitros de tinte azul de bandeja al 0,4% en el tubo de microcentrífuga y mezcle la solución pipeteando varias veces.

A continuación, pipetee 10 microlitros de la mezcla en una cámara de recuento de células. Deslice y coloque el portaobjetos en el contador de celdas dentro de los tres minutos posteriores a la mezcla. Acérquese y concéntrese en las celdas.

A continuación, seleccione las celdas de recuento para obtener el recuento A-P-B-M-C. Si el número viable de PBMC es superior a 3 millones de células por mililitro, alícuota de la muestra en un máximo de cinco viales criogénicos a una concentración de al menos 3 millones de células por mililitro. Cada uno documenta el recuento de células por vial criogénico en el registro de muestras.

Consulte el protocolo de texto adjunto para saber cómo proceder si el número viable de PBMC está por debajo de 3 millones de células por mililitro. Finalmente, transfiera los viales criogénicos a un recipiente de congelación a velocidad controlada y colóquelos a menos 80 grados centígrados durante al menos 24 horas. Después de 24 horas, transfiera los viales criogénicos a una caja criogénica y coloque la caja en la fase de vapor de un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

Documente la hora de inicio del congelador en el registro de muestras. Los métodos de procesamiento de filtro y aislamiento de ARN leucocitario produjeron esta imagen en gel resultante de la electroforesis capilar. Se produjeron dos bandas distintas con una degradación mínima que representan el ARN ribosómico s de ATT y el ARN ribosómico de 28 s.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que mantener registros precisos es fundamental. Recomendamos desarrollar una base de datos para almacenar toda la información del vial criogénico, incluido el volumen, la concentración, la calidad, el código de barras y la ubicación de almacenamiento desde el principio. Y se pueden encontrar más recomendaciones sobre la organización de muestras en el protocolo de texto.