Name: Imaging 3-D y Análisis de neuronas infectadas En Vivo Con Toxoplasma gondii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprende a visualizar neuronas infectadas con Toxoplasma gondii mediante microscopía confocal en secciones cerebrales de 160 µm. Este protocolo permite analizar la relación espacial entre el parásito y las neuronas hospedadoras en tres dimensiones.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Damos las gracias a todo el laboratorio Koshy útil para los debates. Damos las gracias a Patty Jansma y la Universidad de Arizona Departamento de Neurociencia de consejos y ayuda con las imágenes. También agradecemos el laboratorio Porreca para el uso de su Vibratome. Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH NS065116, AAK).

NOTA: Los ratones fueron criados y mantenidos en un ambiente controlado de temperatura y humedad con 12 hr invertido ciclos de luz / oscuridad con alimento y agua ad libitum en la Universidad de Arizona. Los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices y aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Arizona. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Los ratones Cre-reportero están en un C57BL / 6 de fondo 11 y están disponibles comercialmente. 1. Ratón Infección NOTA: El método de infección de ratón con Toxoplasma gondii se describe a continuación ha sido utilizado en los estudios previamente publicados 10 - 12. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Cultivar las cepas de Toxoplasma en fibroblastos de prepucio humano (HFFS) cultivadas en alta glucosa de Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) suplementado con 10% FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml streptomycin, y 2 mM L-glutamina (cDMEM) en un matraz T-25 dentro de una incubadora de CO2 al 5% hasta que los parásitos han formado grandes vacuolas parasitóforas. </li><li> Parásitos de liberación jeringa raspando las células de la parte inferior del matraz y pasar la solución resultante a través de una aguja de calibre 25 conectada a una jeringa de 3 ml 2 veces interior del matraz a continuación, transferir toda la solución a un caso de la jeringa de 5 ml conectada a una aguja de calibre 27 que se ha colocado boca abajo dentro de un tubo cónico de 15 ml. Conecte el émbolo a la jeringa y pasar la solución del parásito en el tubo cónico. </li><li> Centrifugar el tubo durante 10 min a 300 x g. Aspirar el sobrenadante a continuación, resuspender el precipitado en 4-6 grado USP ml estéril 1x tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4 (Solución Stock). </li><li> Cargar un hemocitómetro con 10 l de solución madre, esperar 5-10 minutos para que los parásitos se depositan entonces cuentan el número de parásitos en las cuatro esquinas y el centro de la gran plaza central. </li><li> Diluir párrsitios a tamaño del inóculo apropiado de 100K / 200 l 1x PBS luego se inyectan ratones por vía intraperitoneal (ip) con un volumen total de 200 l. NOTA: Para este procedimiento, los ratones fueron inoculados con 100K Tipo III (CEP) 13 taquizoítos en 200 l 1x PBS. Al infectar ratones con otras cepas de Toxoplasma, puede ser necesario ajustar para tener en cuenta el nivel de virulencia concentración de inóculo. </li></ol> 2. Perfusión Cerebral y Cosecha NOTA: Este protocolo se realizó a 21 días después de la infección (dpi), ya que esto representa el punto de tiempo en el que los números máximos de los quistes se encuentran en el cerebro de ratón, pero otros puntos de tiempo puede ser utilizado. Tamaño, el número, la ubicación, y la presencia o ausencia de quistes depende de muchos factores, incluyendo la cepa de ratón, parásito cepa de tipo, así como el tamaño del inóculo 7,14 - 17. Los investigadores deberán determinar individualmente el inóculo adecuado para el ratón y Toxoplascepa ma él / ella utiliza. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Configuración de todas las herramientas de cosecha quirúrgicos (Figura 1). </li><li> Para cada ratón, preparar y mantener en hielo: jeringa de 20 ml lleno con 0,9% de cloruro de sodio (NaCl) + 10 U / ml de heparina en 1x grado USP estéril PBS (heparina / solución salina); 20 ml jeringa llena con 4% de paraformaldehído (PFA); Vial de centelleo con 15 ml de PFA al 4%. Para múltiples ratones, preparar un vaso lleno de toda la cantidad de cada solución necesaria para todos los ratones luego elaborar una jeringa fresca llena de solución para cada perfusión. </li><li> Anestesiar al ratón ip con 200 l / 25 g de peso corporal de ketamina cóctel / xilazina (24 mg / ml y 4,8 mg / ml, respectivamente) en el día de su interés. Monitorear el ratón para el nivel de anestesia comprobando reflejo pizca dedo del pie. Continúe con el protocolo sólo una vez que el ratón no muestra respuesta a una pizca dedo del pie firme. NOTA: Otros métodos de anestesia se puede utilizar siempre y cuando se alcanza el nivel apropiado de anestesia antesde proceder con el protocolo. </li><li> Coloque el ratón en la posición supina sobre la plataforma de espuma cubierto. Pin las cuatro extremidades a cabo en los pies y luego rociar el pecho y el abdomen con un 70% de etanol (EtOH) (Figura 2). La adición de varias toallas de papel estéril bajo el ratón puede ser utilizado para ayudar a absorber el desbordamiento de los fluidos de perfusión. </li><li> Levante la piel justo debajo del esternón con pinzas a continuación, utilizar tijeras para hacer una incisión. Tire de la piel para exponer el pecho (Figura 2B). </li><li> Levante xifoides proceso y hacer una incisión abdominal justo debajo del diafragma, exponiendo el hígado que se disección roma de distancia desde el diafragma. Hacer dos incisiones, una a la izquierda y de la derecha a través del diafragma y la parte inferior de las costillas. Extender las incisiones izquierda y derecha aproximadamente 1 / 2-2 / 3 manera encima de la caja torácica, que se refleja a continuación, volver a abrir la cavidad torácica (Figura 2C). NOTA: Tenga cuidado de no cortar cualquier órgano o los vasos sanguíneos principales dusonar este procedimiento ya que al hacerlo se comprometer la calidad de la perfusión. </li><li> Perfundir transcardially con 10-20 ml de heparina / solución salina seguido de 10-20 ml 4% PFA. NOTA: Si la perfusión se realiza correctamente, el hígado cambia de rojo a bronceado (Figura 2D). Si no se hace correctamente, los vasos sanguíneos serán visibles (Figura 2E). </li><li> Ponga el ratón sobre su abdomen, pies re-pin luego rociar la cabeza y el cuello con EtOH al 70%. Levantar la piel de la base del cuello y hacer una incisión. Quite la piel para exponer el cráneo (Figura 2F). Decapitar a la cabeza al nivel de los hombros. Retire el cráneo, retire con cuidado el cerebro, y colocarlo en un vial de centelleo lleno de PFA al 4% (Figura 2G-H). NOTA: Si bien perfundido, aparecerá blanca sin vasos sanguíneos visibles (Figura 2I) del cerebro. Si el cerebro no está bien perfundido, los vasos sanguíneos serán visibles (Figura 2J). </li><li> Coloque el scintillación vial con el cerebro en el 4% PFA a 4 ° C durante la noche, cubierto de la luz. Enjuague el cerebro en USP no de grado 1 × PBS y traslado a un nuevo vial de centelleo lleno de frío 1x PBS. Guarde el cerebro en 1x PBS a 4 ° C, protegido de la luz. NOTA: claro éxito y la imagen se ha logrado con secciones almacenados en 1x PBS hasta por un mes, pero lo mejor es la sección es el cerebro en pocos días como el almacenamiento prolongado en PBS invertirá la fijación PFA y podría conducir a menos de imágenes óptimas . Autofluorescencia y el aumento de la falta de definición se han observado en algunas secciones fotografiados después de un almacenamiento en 1X PBS durante un mes o más. </li></ol> 3. Cerebro Seccionado <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retire el cerebro desde 1x PBS y colocarlo en una matriz de cerebro (Figura 3) para permitir más precisa e incluso cortes a través del cerebro. Se quita los bulbos olfatorios cerebelo y, si está presente, y luego se corta el cerebro coronal en 2 o 3 secciones. <br /&gt; NOTA: El recorte y corte del cerebro puede hacerse sin la ayuda de una matriz de cerebro. Número de secciones cortadas coronal dependerá de la distancia de corte de la Vibratome siendo utilizado. El cerebro puede ser seccionado en cualquier orientación, aunque secciones sagitales y coronales son los más utilizados para la identificación neuroanatómica. </li><li> Pegue cada sección del cerebro en un bloque de montaje espécimen con cianoacrilato. Colocar un pequeño bloque de 5% de gel de agarosa detrás de la sección del cerebro de apoyo (Figura 3B). NOTA: Otros mecanismos de apoyo pueden ser utilizados, pero sin el apoyo, la Vibratome pueden hacer presión en el cerebro que causa seccionamiento desigual. </li><li> Cortar tejido en 160 m (distancia de trabajo del objetivo utilizado para formación de imágenes) secciones gruesas con el Vibratome ajusta a una velocidad de 4 y la amplitud de 9. NOTA: Los ajustes para la velocidad y la amplitud pueden ajustarse dependiendo de la máquina particular que se usa con el fin de obtener incluso, las secciones lisas. Si los valores sonno es correcto, el resultado puede ser secciones desiguales, desgarro de marcas de tejidos o charla. </li><li> Recoger las secciones de tejido en un vial de centelleo lleno de frescos, refrigerados 1x PBS si van a ser limpiado en una semana. Si las secciones no van a ser limpiado en una semana, lugar secciones en 1,5 ml tubos de microcentrífuga llenas de solución crioconservante y almacenar a -20 ° C. </li></ol> 4. Compensación óptica de secciones de tejido cerebral NOTA: Este protocolo ha sido modificado a partir de un método publicado previamente 8. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Preparar 25%, 50%, 75% y 90% de glicerol vol / vol en 1X PBS + 2% de Tween-20 (Gl / PBST). </li><li> Retire secciones de 1x PBS o, si en crioconservante, enjuague en PBS 1x y transferir a un vial de centelleo que contiene 10 ml de 25% Gl / PBST. Colocar el vial en un agitador a 4 ° C, cubierta de la exposición a la luz, durante 12 h. </li><li> Confirme que todas las secciones se han hundido a la bottom del vial. Aspirar el 25% Gl / PBST, dejando sólo lo suficiente para cubrir las secciones a continuación, llenar el frasco con 10 ml de 50% Gl / PBST y se deposita en un agitador a 4 ° C, cubierto por la exposición a la luz, durante 12 horas. Repita este proceso para el 75% Gl / PBST entonces el 90% Gl / PBST. Deja secciones en el 90% Gl / PBST durante 24 horas para llegar a la compensación máxima. En el transcurso del proceso de compensación, observar compensación óptica gradual (Figura 4). NOTA: Este proceso puede acelerarse si las soluciones se cambian inmediatamente después de las secciones han hundido en el fondo del vial. En el 75% y 90% de soluciones, las secciones no se hundirán todo el camino hasta la parte inferior del vial, pero flotan en el medio. </li></ol> 5. Montaje de secciones de tejido cerebral <ol style="margin-left: 40px;"><li> Corte un No. 1.5 cubreobjetos en 5 piezas para crear un espaciador. Use un lápiz regla y con punta de diamante para anotar y romper el cubreobjetos lo largo de las líneas de trazo discontinuo en la figura 5A. Descartar tque centrar pieza, organizar las 4 piezas exteriores en un portaobjetos de vidrio claro para crear una ventana, y luego cepille esmalte transparente en las costuras para adherir las piezas del separador a la diapositiva en la configuración correcta (Figura 5B). NOTA: El separador se utiliza para crear el espacio necesario entre la corredera y el cubreobjetos para el montaje de las secciones despejadas. El cubreobjetos se puede cortar en diferentes formas de crear cualquier tamaño de ventana necesario. Espaciadores de espuma precortadas también están disponibles comercialmente. Para permitir que el esmalte de uñas se seque por completo, lo mejor es hacer diapositivas con espaciadores al menos un día antes de las secciones de montaje. </li><li> Secciones de traslado a una diapositiva utilizando una pipeta de plástico con la punta cortada. Asegúrese de llenar en los alrededores con un 90% Gl / PBST. Baje cuidadosamente un cubreobjetos sobre las secciones, asegurándose de no introducir burbujas. El exceso de Gl / PBST puede ser malo lejos con un sin pelusas limpie. </li><li> GFP Imagen + neuronas que contienen RFP + <em&gt; Quistes de Toxoplasma gondii con un microscopio confocal de inmediato (Figura 7A-B) y luego almacenar diapositivas plana y protegido de la luz a 4 ° C. NOTA: Como alternativa, el sello se desliza completamente alrededor de todos los bordes para almacenar y fotografiados en un momento posterior. El uso de esmalte de uñas transparente para sellar diapositiva es opcional y es posible que sea más difícil de quitar cubreobjetos si uno fuera a eliminar secciones de la diapositiva en una fecha posterior para su posterior procesamiento. </li></ol> 6. Imaging NOTA: Cualquier microscopio puede ser usado que tiene la capacidad de obtener de alta resolución z-pilas. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Después de encontrar inicialmente el plano focal en 10 veces, cambiar a un objetivo de 20X y escanear a través de la sección para identificar un quiste localizado en el interior de un GFP + células. Centre la región de interés (ROI) en el campo de visión. </li><li> Cambie a un objetivo de 40X. Enfoque arriba y hacia abajo a través de toda la ROI para asegurarse de que toda la célula y Cyst son visibles. NOTA: Las imágenes se obtuvieron usando un microscopio confocal con un objetivo de 40X / 1.30 Petróleo DIC M27. </li><li> Utilizando el software de imágenes instalado, obtener una pila z que incluye toda la celda con un quiste. Promedio de ajustes utilizados para obtener las imágenes se muestran en la Figura 6. NOTA: Los ajustes pueden necesitar ser ajustado en función de cada una las secciones de tejido investigadores y capacidades de microscopio. </li><li> Obtener una imagen de máxima proyección de la z-stack estableciendo el número de proyecciones a 1. Obtenga una vista rotación completa estableciendo el número de proyecciones a 64. NOTA: Otros paquetes de software están disponibles y pueden ser usados ​​para obtener la máxima proyección, de rotación, así como otros puntos de vista de imágenes z-pila. </li><li> Analizar imagen con el software de análisis de imágenes. </li></ol>

<ol><li>Luft, B., Remington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmic+encephalitis+in+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmic encephalitis in AIDS.</a> Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).</li>
<li>Hill, D., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+transmission%2C+diagnosis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention.</a> Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).</li>
<li>Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+infected+with+low-virulence+strains+of+Toxoplasma+gondii+lose+their+innate+aversion+to+cat+urine%2C+even+after+extensive+parasite+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance.</a> PloS one. 8 (9), 75246(2013).</li>
<li>Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -P., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+Toxoplasma+gondii+cyst+distribution+in+the+forebrain+associate+with+individual+variation+in+predator+odor+avoidance+and+anxiety-related+behavior+in+male+Long-Evans+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats.</a> Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).</li>
<li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-parasite+relationship+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+chronically+infected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch+A+Pathol+Anat+Histopathol%22%5BJournal%5D)">The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).</li>
<li>Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+changes+in+the+brains+of+mice+infected+with+Toxoplasma+gondii%3A+a+histological%2C+immunocytochemical+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study.</a> Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).</li>
<li>Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Cell+Preference+of+Toxoplasma+gondii+Cysts+in+Murine+Brain%3A+A+Confocal+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroparasitology%22%5BJournal%5D)">Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study.</a> J Neuroparasitology. , (2010).</li>
<li>Selever, J., Kong, J. -Q., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+approach+to+high-resolution+fluorescence+imaging+in+semi-thick+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
<li>Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+secreting+Cre+recombinase+for+analysis+of+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions.</a> Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).</li>
<li>Koshy, A. a, Dietrich, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+co-opts+host+cells+it+does+not+invade%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathog%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma co-opts host cells it does not invade.</a> PLoS pathog. 8 (7), (2012).</li>
<li>Madisen, L., Zwingman, T. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Caffaro, C. E., Koshy, A. s, Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nucleotide+sugar+transporter+involved+in+glycosylation+of+the+Toxoplasma+tissue+cyst+wall+is+required+for+efficient+persistence+of+bradyzoites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathog%22%5BJournal%5D)">A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites.</a> PLoS pathog. 9 (5), (2013).</li>
<li>Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+among+the+three+major+strains+of+Toxoplasma+gondii+and+their+specific+interactions+with+the+infected+host%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+parasitology%22%5BJournal%5D)">Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host.</a> Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).</li>
<li>Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Structures+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites%2C+bradyzoites%2C+and+sporozoites+and+biology+and+development+of+tissue+cysts%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 Forthcoming.</li>
<li>Prandota, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Link+Between+Toxoplasma+Gondii+and+the+Anosmia+Associated+With+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Alzheimers+Dis+Other+Demen%22%5BJournal%5D)">Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases.</a> Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).</li>
<li>Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+Toxoplasma+gondii+cysts+in+the+brain+of+a+mouse+with+latent+toxoplasmosis%3A+implications+for+the+behavioral+manipulation+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis.</a> PloS one. 6 (12), 28925(2011).</li>
<li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrastructural+study+of+the+early+development+and+tissue+cyst+formation+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice.</a> Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).</li>
<li>De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+agents+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Infectious agents and neurodegeneration.</a> Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).</li>
<li>Scott, C. a, Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+abnormalities+in+neurons+are+sufficient+to+explain+the+clinical+disease+and+fatal+outcome+of+experimental+rabies+in+yellow+fluorescent+protein-expressing+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice.</a> J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).</li>
<li>Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Dado que los cambios celulares en las células huésped infectadas han sido vinculados a resultados de la enfermedad en infecciones con otros organismos intracelulares tales como el VIH, la rabia, y Chlamydia 18,19, hemos desarrollado una técnica que nos permitirá estudiar las interacciones íntimas que se producen entre el SNC sede de célula y Toxoplasma. El método aquí descrito logra este objetivo al permitir imágenes eficiente de las neuronas infectadas crónicamente. Antes del desarrollo de este méto...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>. The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>.

Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

El objetivo general de este método es la obtención de alta resolución, las imágenes tridimensionales de las neuronas individuales que están infectadas por el parásito intracelular obligado Toxoplasma gondii. Toxoplasma se considera a menudo uno de los parásitos más exitosos debido a su gran rango de huésped intermediario, que incluye seres humanos y roedores. En los seres humanos y roedores, después de la infección aguda por ingestión de alimentos o agua contaminados, Toxoplasma es capaz de provocar una infección persistente del SNC mediante la conversión de su forma de replicación rápida (taquizoíto) a su lenta replicante y encysting forma (la bradyzoite ). En individuos inmunocompetentes, se cree que esta infección latente CNS a ser relativamente asintomática, pero en individuos inmunocomprometidos, como los pacientes con SIDA o receptores de trasplantes, el recrudecimiento del parásito puede provocar encefalitis por toxoplasma 1,2 fatal. Además, estudios recientes hahan demostrado que la infección latente por Toxoplasma puede conducir a cambios de comportamiento en roedores 3,4, aunque el mecanismo sigue siendo desconocido. Sorprendentemente, a pesar de estos datos destacan la importancia de la interacción CNS Toxoplasma, se sabe relativamente poco acerca de esta relación, sobre todo a nivel celular y molecular. La capacidad para estudiar los aspectos más simples de la interacción parásito-cerebro se ha visto obstaculizada en parte por las limitaciones tecnológicas. Por ejemplo, la mayoría del trabajo que demuestra que las neuronas son las células en las que los quistes persisten se ha hecho con la microscopía electrónica (EM) 5,6. Aunque EM da alta resolución, es mucho tiempo, mano de obra intensiva, y caro. Ensayos de inmunofluorescencia (IF) han sido recientemente utilizado en conjunción con la microscopía confocal para confirmar el trabajo realizado por EM 7. Si los análisis son técnicamente fácil de realizar y relativamente barato, pero el uso de estas técnicas para understand la relación espacial entre el quiste y la neurona infectado requiere la reconstrucción de serie, que es mucho tiempo, técnicamente difícil, y puede conducir a la pérdida de información valiosa. Por lo tanto, hemos desarrollado un método que se puede utilizar con el modelo de ratón de la toxoplasmosis CNS y nos permite la imagen de la totalidad de las neuronas infectadas sin EM o inmunohistoquímica (IHC). Mediante el desarrollo de esta técnica, podemos empezar a explorar la relación entre el celular de la célula infectada y el quiste de una manera relativamente rápida y económica. El método que hemos desarrollado combina nuevas técnicas para la compensación óptica y de imagen secciones de cerebro de espesor por microscopía confocal 8 con un sistema que marca en las células in vivo que han sido inyectados con proteínas del parásito 9,10. En este sistema, se infectan ratones Cre-reportero que expresan una proteína fluorescente verde (GFP) sólo después de la recombinación Cre-11 mediada con Toxoplasma </em&gt; Cepas que expresan una proteína fluorescente roja (RFP) y se inyectan la recombinasa Cre en las células huésped 9. Esta combinación nos permite cosechar el cerebro de ratón infectado después de establecida la infección del SNC, cortar secciones de cerebro de espesor, y rápidamente identificar las áreas pertinentes a la imagen mediante la búsqueda de la RFP + quistes. Es importante tener en cuenta que a medida que la expresión célula hospedadora de la GFP depende únicamente de la inyección de Cre por parásitos, y no en la infección, un número de las células GFP + no contienen parásitos 10. Como el objetivo de este protocolo es capaz de neuronas infectadas imagen enteros, la atención se centra sólo en las buenas prácticas agrarias + neuronas que contienen también un RFP + quiste, pero el protocolo también se puede usar para la imagen de la GFP + / RFP - neuronas. Una vez que el cerebro infectado se cosecha y se seccionó, las secciones se convierten transparente por compensación de glicerol. Regiones apropiadas de secciones se avistaron con microscopía confocal, almugido visualización sin precedentes de las células huésped infectadas y los parásitos enquistados en su totalidad. Aquí le ofrecemos un completo protocolo para la identificación, la compensación óptica y, a las neuronas de imágenes infectado.

<table><tbody><tr><td>Sistema de seccionamiento Vibratome Serie 1000 Productos</td><td>Técnicos International, Inc.</td><td></td><td>Otros vibrátomos son compatibles</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Premium Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Scriber</td><td>VWR</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&reg; Ketamina HCl Inj., USP 100 mg/ml</td><td>Western Medical Supply, Inc.</td><td>4165</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed&reg; Inyección Xilacina 20 mg/ml</td><td>Lloyd Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratones ZsGreen</td><td>Laboratorios Jackson</td><td>7906</td><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td> quirúrgico <td>Pinzas de pulgar; Tijeras finas inclinadas hacia los lados, afiladas y afiladas; Tijeras afiladas; Hemostáticos Kelly; Tijeras de mayonesa; Micro espátula.</td></tr><tr>Células <td></td><td></td><td>de fibroblastos del prepucio humano (HFF):</td><td>Estas son células primarias de los prepucios humanos. Los fabricamos internamente, pero se pueden comprar a proveedores externos.</td></tr><tr><td>Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>HyClone</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina Solución, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-alanil-L-glutamina</td><td>Corning</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 Matraz de cuello inclinado</td><td>Fisher Scientific</td><td>1012639</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato, 1x sin Calcio y magnesio</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, 10x, USP Estéril Grado ultra puro</td><td>amresco</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro Bright-Line</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de corte de cerebro de ratón</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sal sódica de la mucosa intestinal porcina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Viales de centelleo desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol, Etilo, 95%, 190 Prueba</td><td>In-house</td><td>17212945</td><td>Este producto se compra en un almacén interno. Otras empresas son compatibles.</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esmalte</td><td></td><td></td> de uñas transparente Otras <td>marcas son compatibles</td></tr><tr><td>Jeringa de 10 ml con Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td>Otras jeringas son compatibles</td></tr><tr><td>Llave</td><td></td><td></td> de paso de tres vías <td>Cualquier marca es compatible</td></tr><tr><td>Aguja</td><td></td><td></td> hipodérmica <td>Cualquier marca es compatible: se utiliza para sujetar el mouse.</td></tr><tr><td>Raspador</td><td></td><td></td> de células <td>Cualquier marca es compatible</td></tr><tr><td>Tubo de 25 G x 12", juego de extracción de sangre de seguridad, con adaptador Luer Greiner</td><td>Bio-One</td><td>450099</td><td>otras marcas son compatibles</td></tr></tbody></table>

imaging 3-d y análisis de neuronas infectadas en vivo con toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado con una amplia gama de huéspedes, incluidos los seres humanos y roedores. En los seres humanos y roedores, Toxoplasma establece una infección persistente de por vida en el cerebro. Mientras que esta infección cerebral es asintomática en la mayoría de las personas inmunocompetentes, en el desarrollo del feto o personas inmunodeprimidas, como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) pacientes, esta predilección por y persistencia en el cerebro puede conducir a la enfermedad neurológica devastadora. Por lo tanto, es evidente que la interacción de cerebros Toxoplasma es crítico para la enfermedad sintomática producida por Toxoplasma, sin embargo, tienen poco entendimiento de la interacción celular o molecular entre células del sistema nervioso central (CNS) y el parásito. En el modelo de ratón de la toxoplasmosis del SNC se ha conocido por más de 30 años que las neuronas son las células en las que el parásito persiste, pero hay poca información disponible sobre la queparte de la neurona es generalmente infecta (soma, dendritas, axón) y si esta relación celular cambia entre cepas. En parte, esta falta es secundaria a la dificultad de formación de imágenes y la visualización de las neuronas infectadas enteras de un animal. Estas imágenes se suelen requerir seccionamiento en serie y costuras de tejido fotografiado por microscopía electrónica o microscopía confocal después de inmunotinción. Mediante la combinación de varias técnicas, el método descrito aquí permite el uso de secciones gruesas (160 micras) para identificar y células de imagen completa que contienen quistes, lo que permite la visualización y el análisis de las neuronas individuales, crónicamente infectadas en tres dimensiones sin la necesidad de inmunotinción, microscopía electrónica o seccionamiento y la costura serie. Usando esta técnica, podemos comenzar a entender la relación celular entre el parásito y la neurona infectada.

La Figura 7 incluye imágenes representativas de dos GFP + neuronas a partir de dos secciones diferentes 160 m de espesor, así como una medición representativa de la distancia desde quiste a célula-cuerpo para la Figura 7B. Cifras que contiene quiste-7 A y B ilustran que este nuevo protocolo permite la visualización de la neurona infectada en su totalidad. La Figura 7C muestra que con esta técnica de imagen, ahora es posible c...

El uso de este protocolo, hemos sido capaces de imagen de 160 micras de espesor secciones de cerebro de ratones infectados con el parásito Toxoplasma gondii, que permite la visualización y el análisis de la relación espacial entre el parásito enquistamiento y la neurona infectada.

Imaging 3-D y Análisis de neuronas infectadas En Vivo Con Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar completamente las neuronas infectadas con quistes de Toxoplasma Gandhi. Esto se logra infectando primero por vía intraperitoneal a ratones reporteros Cree con parásitos que expresan cereza M y están diseñados para inyectar recombinasa CRE en las células huésped. Una vez establecida la infección del SNC, el segundo paso es realizar perfusión transcardial con solución salina heparina, seguida de paraldehído al 4%.A continuación, recoja el cerebro, retire y deseche los bulbos olfativos y el cerebelo, corte el cerebro restante en dos mitades, luego corte las mitades en secciones de 160 micras de grosor. El paso final es limpiar las secciones con soluciones de interpolación de glicerol PBS graduadas y montarlas en portaobjetos para obtener imágenes con microscopía confocal. En última instancia, las imágenes se pueden analizar con un software que permite el renderizado y el análisis en 3D, y este método se puede utilizar para mostrar la relación celular entre el quiste y las neuronas infectadas.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la sección en serie, la tinción y la reconstrucción de secciones gruesas, es que elimina los requisitos de tinción y reconstrucción, los cuales pueden ser técnicamente difíciles y llevar mucho tiempo. La comprobante de este procedimiento estará a cargo de Carla Cabral, especialista en investigación de mi laboratorio. Comience este procedimiento colocando el cerebro del ratón infectado con Toxoplasma Gandhi en una matriz cerebral para cortes precisos y uniformes, recorte el cerebelo y los bulbos olfativos.A continuación, corta el cerebro en dos secciones coronales. A Fije cada sección del cerebro en un bloque de montaje de muestras con Sano acrl. Posteriormente, coloque un pequeño bloque de gel 5%Aros detrás de la sección del cerebro para soporte.Cortar el tejido en secciones fijas de 160 micras con un vioma ajustado a una velocidad de cuatro y una amplitud de nueve. A continuación, transfiera las secciones de tejido en un vial de centelleo lleno de XPBS fresco y refrigerado si se van a eliminar en el plazo de una semana. Si las secciones no se van a limpiar en una semana, colóquelas en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros llenos de solución crioconservante y guárdelas a menos 20 grados centígrados.Ahora prepare 25%50%75%y 90%volumen por volumen de glicerol en un XPBS más 2%entre 20. A continuación, retire las secciones de un XPBS, o si están en crioconservante, enjuáguelas en un XPBS y transfiera a un vial de centelleo que contenga 10 mililitros de 25% de glicerol PBST. Coloque el vial tapado en una coctelera.Cubra el vial para evitar la exposición a la luz e incube a cuatro grados centígrados durante 12 horas. Después de 12 horas, confirme que todas las secciones se hayan hundido hasta el fondo del vial. Aspire el PBST al 25% de glicerol, dejando solo lo suficiente para cubrir las secciones.Luego construya un vial con 10 mililitros de 50% de glicerol PBST. Coloque el vial en un agitador y protéjalo de la luz, incube a cuatro grados centígrados durante otras 12 horas. Repita este proceso para el 75 % de glicerol PBST y el 90 % de glicerol PBST, en el que las secciones permanecerán flotando en el centro del vial.Deje las secciones en el PBST al 90% de glicerol durante 24 horas para alcanzar la aclaración máxima. Ahora crea un espaciador cortando un cubreobjetos con el número 1.5 en cinco pedazos con una regla y un lápiz con punta de diamante. Desecha la pieza central y coloca las cuatro piezas exteriores en un portaobjetos de vidrio liso para crear una ventana.A continuación, cepille el esmalte de uñas transparente sobre las costuras para adherir las piezas del espaciador a la corredera en la configuración correcta. A continuación, transfiera las secciones a un portaobjetos con una pipeta de plástico con la punta cortada. Asegúrese de rellenar el área circundante con 90% de glicerol PBST.A continuación, coloque con cuidado un cubreobjetos sobre las secciones y tenga cuidado de no introducir burbujas. El exceso de glicerol PBST puede eliminarse con una toallita sin pelusa. Después. Imagen de las neuronas GFP positivas que contienen quistes de Gandhi de Toxoplasma RFP positivos con un microscopio confocal Cuando termine, almacene los portaobjetos planos y cubiertos de la luz a cuatro grados centígrados.Aquí se muestran las imágenes de proyección máxima de las neuronas GFP positivas que contienen quistes RFP positivos. Se trata de una película rotacional en 3D de la célula. Esta imagen muestra la medición en línea directa generada por el iris de la distancia entre el borde del quiste y el borde del cuerpo celular.En este ejemplo, la distancia se mide como 149 micras, y aquí hay una película 3D generada por IMS que muestra la medición de medio a medio y de borde a borde entre el quiste y el cuerpo de la célula Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro o cinco días si se realiza correctamente siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar análisis adicionales, como el recuento del número de bastones entre las dendritas infectadas y las no infectadas, para responder a preguntas como si el quiste interrumpe o no la función neuronal normal.

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe un método para visualizar repetidamente microglia murina y los monocitos...

Una delgada del cráneo ventana Técnica para la crónica de dos fotones En vivo Imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación

Toxoplasma gondii se convierte en una forma de quiste en respuesta al estrés ambiental, que puede ser imitado en los modelos de cultivo de tejidos. Este video muestra las técnicas para examinar la formación de la pared del quiste mediante la activación de médula ósea procedentes de los macrófagos o el cambio de pH de crecimiento medio en las células de fibroblastos.

Quiste Toxoplasma gondii Muro de Formación en Activado médula ósea procedentes de los macrófagos y Condiciones bradizoíto

Utilizando luciferasa y los sistemas de formación de imágenes in vivo (IVIS) como un nuevo medio para identificar las variables de enfermedad antes de los desarrollos clínicos ocurrir. IVIS nos ha permitido visualizar en tiempo real la invasión de los virus de encefalitis durante varios días, ofreciendo un modelo de enfermedad más preciso para el estudio futuro. También ha permitido identificar las características potenciales de protección de antivirales y vacunas más rápido que los modelos...

En Vivo Imaging Systems (IVIS) La detección de un virus invasor Neuro-encefálico

Fuente: Zaeck, L., L. , et al. Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en tejido cerebral aclarado con solvente. J. Vis. Exp. (2019).  Este video muestra el proceso de preparación y obtención de imágenes de tejido cerebral de ratón infectado con el virus de la rabia (RABV) para evaluar la progresión de la infección. Describe los pasos clave, incluida la tinción de tejidos con marcadores fluorescentes, la deshidratación, el aclarado y el montaje para la...

Visualización tridimensional de una infección por el virus de la rabia en tejido cerebral de ratón

Se describe un método de microscopía correlativa que combina alta velocidad de microscopía de luz fluorescente de células vivas 3D y la crio-tomografía electrónica de alta resolución. Se demuestra la capacidad del método correlativo por imágenes dinámicas, pequeñas partículas de VIH-1 que interactúan con las células HeLa de acogida.

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

Para preservar los procesos neuronales para el análisis ultraestructural, se describe un protocolo para la siembra de las neuronas primarias en rejillas de microscopía electrónica, seguido de congelación instantánea, dando muestras en suspensión en una capa de hielo vítreo. Estas muestras pueden ser examinados con un crio-microscopio electrónico para visualizar estructuras a escala nanométrica.

Preparación de las neuronas primarias para la visualización de neuritas en un Estado Frozen-hidratado con Cryo-tomografía electrónica

Las nuevas técnicas de limpieza de tejidos compatibles con la inmunomancha, como la imagen 3D definitiva de órganos con disolventes, permiten la visualización 3D de la infección cerebral del virus de la rabia y su complejo entorno celular. Las rebanadas gruesas de tejido cerebral con etiqueta de anticuerpos se hacen ópticamente transparentes para aumentar la profundidad de la imagen y permitir el análisis 3D mediante microscopía de escaneo láser confocal.

Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en el tejido cerebral con disolventes

La tubería descrita está diseñada para la segmentación de conjuntos de datos de microscopía electrónica mayores que gigabytes, para extraer morfologías de células enteras. Una vez que las células se reconstruyen en 3D, el software personalizado diseñado en torno a las necesidades individuales se puede utilizar para realizar un análisis cualitativo y cuantitativo directamente en 3D, también utilizando la realidad virtual para superar la oclusión de la vista.

Un método para la reconstrucción 3D y el análisis de realidad virtual de células gliales y neuronales

El presente protocolo describe la microscopía fluorescente de lámina de luz y los métodos automatizados asistidos por software para visualizar y cuantificar con precisión los parásitos Trypanosoma cruzi proliferantes y latentes y las células T en órganos y tejidos intactos y despejados. Estas técnicas proporcionan una forma confiable de evaluar los resultados del tratamiento y ofrecen nuevos conocimientos sobre las interacciones parásito-huésped.

Imágenes cuantitativas en 3D de células infectadas por Trypanosoma cruzi, amastigotes latentes y células T en órganos aclarados intactos

En este artículo se detalla la metodología para el radiomarcaje de un anticuerpo monoclonal anti-CD19 específico para humanos y cómo utilizarlo para cuantificar las células B en el sistema nervioso central y los tejidos periféricos de un modelo murino de esclerosis múltiple mediante imágenes PET in vivo, recuento gamma ex vivo y enfoques de autorradiografía.

Obtención de imágenes de células B CD19+ en un modelo experimental de ratón con encefalomielitis autoinmune mediante tomografía por emisión de positrones

Aquí, describimos un procedimiento que permite la detección de bacterias patógenas en todo el órgano durante la infección y la cuantificación de las actividades de los reporteros fluorescentes.

Tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas

Aprende a visualizar neuronas infectadas con Toxoplasma gondii mediante microscopía confocal en secciones cerebrales de 160 µm. Este protocolo permite analizar la relación espacial entre el parásito y las neuronas hospedadoras en tres dimensiones.

Imaging 3-D y Análisis de neuronas infectadas En Vivo Con Toxoplasma gondii

Explorar más videos