Genoma toda la Proteína-proteína interacción Screening por Complementación de ensayo de proteínas-fragmento (PCA) en las células vivas

Las proteínas interactúan entre sí y estas interacciones determinan en gran medida sus funciones. Los socios de interacción de proteínas se pueden identificar a alto rendimiento in vivo utilizando un ensayo de aptitud de levadura basado en el ensayo de complementación de fragmentos de proteínas de dihidrofolato reductasa (DHFR-PCA).

El objetivo general de este procedimiento es identificar los socios de interacción proteica de una proteína de interés utilizando el ensayo de COMPLEMENTACIÓN de fragmentos de proteína DI hidrofolato reductasa, o D-H-F-R-P-C-A. Esto se logra condensando primero la colección DH FFR F three o praise en matrices de colonias de alta densidad. A continuación, la cepa de cebo se hace con la variedad de elogios en un medio rico.

En el paso final, se seleccionan los diploides resultantes de estos apareamientos. En última instancia, la reconstitución del DHFR se cuantifica midiendo el tamaño de las colonias en medio PCA selectivo, lo que proporciona una señal proporcional a la cantidad de complejo de presas de cebo reconstituido en las celdas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades como el cáncer, ya que es mediante el recableado de las redes de interacción de proteínas.

Que las mutaciones pueden conducir a este tipo de enfermedades. En la mañana del procedimiento, esterilice la plataforma robótica remojando primero las herramientas PIN cinco veces durante 10 segundos en la estación de baño de agua para eliminar los grumos de células residuales. A continuación, remoje la herramienta PIN dos veces hacia adelante y hacia atrás en la estación de cepillado y dos veces en la estación de soporte durante 20 segundos cada remojo para eliminar cualquiera de las celdas restantes mientras se limpian las herramientas de PIN.

Encienda la lámpara UV durante cinco minutos para esterilizar un robot. A continuación, después del último lavado, seque las herramientas PIN en la estación de secado de aire durante 25 segundos. Condensa la colección A-D-H-F-R en 16 matrices de 384 cepas aquí.

Una matriz 384 se puede subdividir en cuatro cuadrantes espaciados por igual interés, cada uno de los cuales consta de 96 posiciones en un diseño de matriz de dos por dos para un total de cuatro cuadrantes. Para hacer esto, para cada matriz 384, imprima cuatro placas de glicerol en los cuatro cuadrantes de una bandeja omnidireccional que contenga YPD más 250 microgramos por mililitro. La higromicina B, utilizando la herramienta de 96 pines para hacer esto, inserte 4 placas de 96 pocillos que contienen el control negativo LDH FFR F tres entre las 60 placas de glicerol de la colección DHFR 3 para tener un conjunto final de 64 placas que llenan exactamente cuatro matrices de 1, 536.

A continuación, inserte 4 placas de 96 pocillos que contengan el LDH FFR F tres controles negativos entre las otras 60 placas para tener un conjunto final de 64 placas que llenen exactamente 4 15 36 matrices antes de añadir células a las placas fuente, humedecer los pines esterilizados en 35 mililitros de agua estéril en una bandeja omni en la estación húmeda. Incubar los conjuntos a 37 grados centígrados durante dos días, y luego condensar la colección en cuatro conjuntos de 1.536 cepas. Imprima cuatro matrices de 384 cepas en cada una de las cuatro placas de destino.

Usando la herramienta de 384 pines. Esterilización de la herramienta PIN entre cada ciclo de replicación, como se acaba de demostrar después de otros dos días de incubación. Estandarice el tamaño de la colonia replicando las cuatro matrices en el medio YPD seleccionado con una herramienta de 1.536 pines e incube las placas durante 48 horas más.

Para un alto rendimiento. D-H-F-R-P-C-A primero inocular un cultivo de la cepa de cebo en 20 mililitros de YPD líquido más ricina CIO en un tubo de 50 mililitros e incubar las células durante dos días a 30 grados Celsius con agitación a 250 RPM. Cuando la cultura ha llegado a la saturación.

Coloque cinco mililitros de la suspensión celular en una bandeja omnidireccional YPD plus gnat y deje que las células se absorban en la superficie después de cinco a 10 minutos, retire el exceso de líquido e incube el cultivo a 30 grados centígrados después de dos días. Utilice la herramienta de 1.536 pines para imprimir la cepa de cebo en placas de 12 YPD utilizando cada césped de celda no más de cuatro veces. A continuación, utilizando la herramienta de 1.536 pines, de nuevo, imprima la matriz adecuada para la colección DHFR F tres en la parte superior de las celdas de cebo.

Deje que las cepas se apareen durante otros dos días de incubación y luego seleccione las células diploides imprimiendo las colonias en bandejas omnidireccionales que contienen YPD más hidromicina B y nortina. Incubar los diploides durante dos días más a 30 grados centígrados, y luego repetir la selección como se acaba de demostrar un día después de la incubación. Vierta los platos con medios que contengan metotrexato al día siguiente.

Utilice la herramienta de 1.536 pines para imprimir células diploides en el medio de metotrexato e incube las placas durante cuatro días más en bolsas de plástico para evitar que los cultivos se sequen. Al tercer día de incubación. Vierta un segundo lote de bandejas omnidireccionales que contengan medio MTX como se acaba de demostrar al día siguiente, encienda la luz del robot y use una plataforma robótica para obtener imágenes de las placas para disminuir el crecimiento de fondo de las cepas de PCA y aumentar la resolución cuantitativa, replique las celdas en el segundo lote de medios MTX para realizar una segunda ronda de selección de MTX como se acaba de demostrar.

Finalmente, después de adquirir imágenes del segundo conjunto de placas, analice las matrices de colonias con el software adecuado, recopilando la información del tamaño de la colonia para cada posición de cada matriz. El umbral definido con los tres controles LDH FFR F se puede utilizar como umbral empírico para determinar los aciertos de alta confianza. Los interactores físicos conocidos del cebo se pueden recuperar de bases de datos como Biogrid y superponerse a los datos.

Por ejemplo, en este caso, cinco de los ocho resultados de alta confianza se informaron previamente como interactores de NUP 82, entre los cuales se determinó que NUP one 16 y NUP 1 59 formaban parte del subcomplejo NUP 82. Los datos también indican que la proteína de membrana aproximada PEX 30 puede representar una nueva interacción física de Nup 82, como se confirma utilizando D-H-F-R-P-C-A a un bajo rendimiento detectados dos de los otros socios de interacción. Se determinó que el nuevo 20 y el nuevo 85 no formaban parte del nuevo subcomplejo 82, lo que ilustra la capacidad de D-H-F-R-P-C-A para detectar las interacciones dentro y entre subcomplejos de complejos más grandes.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe utilizar los soportes de Freshly Report para evitar cualquier solución de problemas con los pasos de impresión e incluir los controles necesarios para asegurarse de que el material PCA final permita el crecimiento solo de células que demuestren complementación DHFR.