Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados en células Esferas ensayos
3 de enero de 2015
Los ensayos de esferas in vitro se utilizan comúnmente para identificar células madre cancerosas. Aquí comparamos ensayos de esferas individuales con ensayos basados en múltiples células. Los ensayos más laboriosos basados en células individuales o la suplementación con metilcelulosa dan resultados más precisos, mientras que los ensayos basados en células múltiples realizados en medio líquido pueden verse muy influenciados por la densidad celular.
El objetivo general de este procedimiento es evaluar las propiedades de las células madre de las células de carcinoma de ovario humano mediante ensayos de esferas basadas en células múltiples y únicas. Esto se logra seleccionando primero las células transducidas de lentivirus RFP reporteros SOX por el tratamiento con Pur Mycin en el segundo paso, las células positivas y negativas para RFP se aíslan y se siembran como colonias de células individuales o múltiples por pozo. A continuación, la formación de la esfera primaria se analiza microscópicamente y luego los cultivos de la esfera primaria se disocian y se replatean para el análisis de la formación de la esfera secundaria.
En última instancia, estos ensayos esféricos se utilizan para calcular la proporción de células madre putativas de cáncer de ovario que muestran capacidad de formación de esferas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre cancerosas, como cuáles son algunas poblaciones potenciales de células madre cancerosas y cuál es la frecuencia en toda la bolsa tumoral. Aunque este método puede proporcionar información sobre la identificación de células madre de cáncer de ovario, también se puede aplicar para aislar las células madre cancerosas de otras entidades tumorales sólidas, como el carcinoma de mama.
24 horas después de transducir células de carcinoma de ovario humano con partículas lentivirales, extraer el sobrenadante viral y lavar las células en cultivo de PBS. Las células en medio completo durante 48 horas. Luego cambie el medio y agregue 10 microgramos por mililitro de piromicina después de cinco días.
Trate los cultivos con shield uno en uno por 1000 diluciones al día siguiente. Lave las celdas en PBS y luego sepárelas con 0.05% de trips en EDTA. Después de tres minutos, detenga la reacción con medio completo.
Cuente las células y centrifuérrelas durante cinco minutos a 300 veces G y temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células cuidadosamente en 0,5 a un mililitro de PBS estéril y luego cuele la suspensión celular resultante a través de un filtro de 40 micrómetros. Ajuste las celdas a una dilución de cinco por 10 a seis celdas por mililitro y, a continuación, agregue 100 microlitros de medio de esferas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja a continuación para un ensayo de esfera basado en una sola célula.
Utilice el modo de celda única para clasificar una celda en cada pocillo de la placa. A continuación, marque microscópicamente las células para evaluar la eficiencia del recubrimiento. Incubar las células en esferas frescas, a 37 grados centígrados, y 5% de CO2 con suplementación diaria con factor de crecimiento básico de fibroblastos y factor de crecimiento epidérmico.
Después de una semana, determine el número de esferas tumorales emergentes mediante microscopía óptica y la presencia de la señal fluorescente del sistema reportero integrado mediante microscopía fluorescente. Cuente las esferas con un diámetro superior a 100 micrómetros como esferas grandes y las esferas con un diámetro de 50 a 100 micrómetros como esferas pequeñas. Teniendo cuidado de contar esferas reales y no grupos de células.
A continuación, calcule la proporción de celdas positivas o negativas RFP que forman esferas de acuerdo con la fórmula para pasar. Las esferas comienzan transfiriendo el contenido de cada pocillo a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, enjuague cada pocillo de tres a cinco veces con PBS para asegurarse de recoger todas las esferas y centrifugar las células durante 10 minutos a 300 veces G y a temperatura ambiente.
Después de la centrifugación, retire el snat y vuelva a suspender los pellets en 200 microlitros de 0,05% tripsin EDTA a 37 grados centígrados en un agitador suave durante cinco minutos. Si no hay esferas grandes visibles después de cinco minutos, tritrate suavemente la solución celular con una punta de pipeta de 100 microlitros y agregue 500 microlitros de medio completo para inactivar la tripsina. Gire las celdas, vuelva a suspender los gránulos cuidadosamente en esferas de medio y drene la suspensión celular resultante a través de un filtro de 40 micrómetros como se acaba de clasificar.
Finalmente, para el replateado en serie de las células individuales, siembre células individuales de una esfera primaria en 100 microlitros de esferas, medio por pocillo en una nueva placa de 96 pocillos de fijación ultra baja. A continuación, utilice la misma fórmula que para el ensayo de esferas primarias para evaluar la proporción de células formadoras de esferas en las esferas secundarias. Los ensayos en esferas multicelulares determinaron casi el 40% de las células de carcinoma de ovario humano positivas para RFP, en comparación con solo el 20% de las células negativas para RFP, lo que dio lugar a una esfera tumoral individual en el ensayo de esferas primarias.
Sorprendentemente, se cuentan números más altos de esferas a partir de números más bajos de células plateadas en medios basados en MGEM y D-M-E-M-F 12, lo que demuestra que las modalidades de recubrimiento sesgaron en gran medida los resultados de este ensayo. Por el contrario, cuando las células se inmovilizan mediante la adición de 1% de metilcelulosa, la eficiencia de la formación de esferas es en su mayoría independiente de la densidad celular en cultivos de esferas basadas en múltiples células. Aproximadamente el 35% de las células de las esferas positivas para RFP pierden su señal fluorescente roja después de siete días de cultivo, lo que sugiere que estas células han experimentado diferenciación, mientras que más del 65% de las células conservan una señal RFP que sugiere una capacidad de autorrenovación.
Por el contrario, las células de esferas generadas a partir de células inicialmente negativas a RFP siguen siendo RFP negativas, lo que indica que no pueden restablecer el potencial de las células madre en estas condiciones. La microscopía de fluorescencia realizada en esferas generadas a partir de células individuales confirma estos datos, demostrando que las esferas individuales derivadas de células positivas para RFP contienen células positivas para RFP y negativas para RFP. Mientras que las esferas derivadas de las celdas negativas RFP conservan su falta de señal roja siguiendo este procedimiento.
Otros métodos, como los anticuerpos, la tinción o el análisis de la expresión génica mediante PCR cuantitativa, se pueden realizar para caracterizar aún más las células con una gran capacidad de formación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que es necesario realizar ensayos de trasplante in vivo en ratones inmunodeprimidos para validar las propiedades de las células madre tumorales de las células iniciadoras de la esfera.
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Descripción general
Este estudio evalúa las propiedades de células madre de células de carcinoma ovárico humano utilizando ensayos de esferas basados en una sola célula y en múltiples células. Los resultados sugieren que los ensayos basados en una sola célula producen resultados más precisos en comparación con los ensayos basados en múltiples células, que pueden verse influenciados por la densidad celular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Células madre cancerosas
- Carcinoma de ovario
- Técnicas de cultivo celular
Antecedentes
- Los ensayos de esferas in vitro son esenciales para identificar las células madre cancerosas.
- Los ensayos basados en células individuales son más laboriosos, pero ofrecen una mayor precisión.
- Los ensayos basados en múltiples células pueden verse afectados por la densidad de las células en cultivo.
- Esta investigación puede extenderse a otros tumores sólidos, como el carcinoma de mama.
Objetivo del estudio
- Evaluar las características de células madre en las células de cáncer de ovario.
- Comparar la eficacia de los ensayos de esferas basados en una sola célula frente a los basados en múltiples células.
- Identificar poblaciones potenciales de células madre cancerosas dentro de los tumores.
Métodos Utilizados
- Selección de células transducidas con lentivirus reportero de SOX2-RFP.
- Aislamiento de células positivas y negativas para RFP para su siembra.
- Análisis microscópico de la formación de esferas primarias.
- Disociación y resiembra de cultivos de esferas primarias para análisis secundario.
Resultados principales
- Los ensayos basados en células individuales proporcionaron resultados más confiables.
- Los ensayos basados en múltiples células mostraron variabilidad según la densidad celular.
- Se identificó la proporción de células madre del cáncer de ovario con capacidad de formar esferoides.
- La metodología es aplicable a otros tipos de cáncer.
Conclusiones
- Se recomiendan ensayos basados en células individuales para la identificación precisa de células madre cancerosas.
- Los ensayos con múltiples células pueden ser útiles, pero requieren una consideración cuidadosa de la densidad celular.
- Este enfoque puede mejorar la comprensión de la dinámica de las células madre cancerosas en tumores.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación precisa de poblaciones de células madre cancerosas es fundamental para reducir los riesgos en la validación de dianas en oncología y mejorar la confianza predictiva en modelos preclínicos. Los ensayos de esferoides basados en células individuales proporcionan una lectura funcional más confiable de la pluripotencialidad al minimizar los artefactos derivados de la densidad celular y la agregación, lo que favorece una comprensión mecanicista en las fases iniciales del descubrimiento. Este enfoque permite a los equipos de biofármacos priorizar dianas con una validación biológica más sólida y reducir la deserción en fases avanzadas debido a una comprensión incompleta de la diana.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento y análisis de la capacidad de formación de esferas en subpoblaciones putativas de células madre cancerosas.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas mediante la medición cuantitativa de la eficiencia de formación de esferas en células positivas para RFP frente a células negativas para RFP.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en la selección de dianas al distinguir células verdaderamente similares a células madre de sus progenias diferenciadas, basándose en marcadores de autorrenovación y diferenciación.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para el ensayo: La siembra de células individuales en medio para esferoides con adherencia ultrabaja permite la cuantificación estandarizada y reproducible de unidades formadoras de esferoides.
- Resultado cuantitativo: Permite la evaluación de la formación de esferoides primarios y secundarios para analizar la capacidad de autorrenovación a lo largo de pases seriados.
- Consideración de escalabilidad: La suplementación con metilcelulosa en ensayos con múltiples células reduce los artefactos mecánicos y la variabilidad dependiente de la densidad, mejorando la robustez del ensayo para aplicaciones de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Los ensayos de esferoides conectan el descubrimiento con la validación preclínica al proporcionar un correlato funcional de la frecuencia de células iniciadoras de tumores.
- Alineación de Biomarcadores: La retención de la señal de RFP en esferoides derivados de células positivas para el reportero SOX2 respalda el uso de reporteros fluorescentes como biomarcadores traslacionales de la condición de célula madre.
- Avance Ajustado al Riesgo: La formación diferencial de esferoides entre poblaciones positivas y negativas para RFP permite la estratificación de subpoblaciones celulares para estudios mecanicistas o terapéuticos posteriores.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, donde los ensayos funcionales con células madre aportan confianza al blanco y orientan el cribado de compuestos en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre marcadores de células madre y actividad de vías al vincular la expresión de SOX2-RFP con la formación funcional de esferas.
- Tamizaje: Permite la estandarización de ensayos mediante siembra de célula única o condiciones de múltiples células suplementadas con metilcelulosa para garantizar una cuantificación reproducible de esferas.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas como la frecuencia de formación de esferas y la capacidad de reimplante secundario, apoyando el análisis comparativo entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Apoya la continuidad preclínica mediante la identificación de células con capacidad de autorrenovación que podrían correlacionarse con la iniciación tumoral in vivo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de ensayo funcional reutilizable, aplicable en modelos de tumores sólidos para el enriquecimiento y validación de células madre.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la identificación de células madre cancerosas al proporcionar una lectura funcional directa de las propiedades de pluripotencialidad.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante condiciones estandarizadas de siembra y el uso opcional de metilcelulosa para mitigar artefactos dependientes de la densidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción al aumentar la confianza en la biología del blanco y reducir el riesgo de perseguir poblaciones no madre.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en la frecuencia validada de células madre cancerosas y su capacidad de autorrenovación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en clasificación celular, técnicas de cultivo estéril de esferoides y microscopía de fluorescencia para el seguimiento del reportero.
- Depende del acceso a citometría de flujo o FACS para el aislamiento de células individuales y a infraestructura para transducción con lentivirus.
- Necesita la optimización de la densidad de siembra y de la formulación del medio, incluyendo suplementación con factores de crecimiento (bFGF, EGF).
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a otros tipos de tumores o sistemas de reportero distintos de SOX2-RFP.
- Se ve limitado por la necesidad de resembrados seriados y cultivos a largo plazo para evaluar la autorrenovación, lo que aumenta el tiempo y la demanda de recursos.
