Name: Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados en células Esferas ensayos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende a evaluar propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano mediante ensayos de esferas individuales y multicelulares. Este método permite identificar poblaciones de células madre cancerosas con mayor precisión.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudio fue financiado por una subvención de la Baden-Württemberg Stiftung (Programa de Células Madre Adultas II) otorgada a C.L. Agradecemos a la Dra. Martina Konantz por su aporte crítico y revisión del manuscrito. Agradecemos a Emmanuel Traunecker y Toni Krebs del DBM FACS Facility (Hospital Universitario de Basilea) por su ayuda en la clasificación de FACS.

1. Generación de células humanas de carcinoma de ovario OVCAR-3 estable transduced con lentivirus que contiene el reportero construir Sox2 Región Reguladora <ol><li> Generar partículas lentiviral por transfección de la línea celular 293T-embalaje HEK con un reportero construir el reconocimiento de una región reguladora Sox2 descrita 10,21. NOTA: La construcción informadora contiene además un dominio de desestabilización del sistema de protección ProteoTuner por delante de la proteína de fluorescencia tdTomato. Shield1 se une al dominio de desestabilización evitando así que el proteasoma para degradar la proteína de fluorescencia 22. </li><li> Transducir OVCAR-3 células con partículas lentivirales más de un período de tiempo de 24 hr. Después, eliminar el sobrenadante viral y lavar las células con tampón fosfato salino (PBS) y se cultivaron en medio completo (RPMI suplementado con 10% FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina). </li><li> 48 horas más tarde, 10 mg / ml puromicina se añadieron a las culturas y se mantuvo durante 5 días para permitir la selección de células transducidas correctamente. </li></ol> 2. Preparación de la clasificación celular y Chapado <ol><li> Añadir Shield1 a escala 1: 1000 dilución 24 horas antes de la clasificación de células. Utilice células transducidas de forma estable OVCAR-3 sin tratamiento Shield1 como controles negativos (Figura 1). Aspirar los medios de frasco, lavar las células con PBS 1x y trypsinize células con 0,05% de tripsina-EDTA durante 3 min. </li><li> Detener la tripsina mediante el uso de medio completo (véase más arriba), contar el número de células, centrifugar las células a 300 xg a temperatura ambiente (15 - 25 ° C) durante 5 min. </li><li> Decantar el sobrenadante y volver a suspender las células cuidadosamente en 0,5 a 1 ml de PBS estéril. </li><li> Utilice 40 micras filtro tapa filtro de células para obtener la suspensión de una sola célula. </li><li> Ajuste el recuento de células a 5 millones de células por ml. </li><li> Preparar bajo de fijación placas de ultra 96 ​​pocillos con 100 l esferas medio (MEGM suplementado con factores de crecimiento, citoquinas, y suplementos,B-27, heparina-sodio; o DMEM / F12 suplementado con factores de crecimiento, citoquinas, y suplementos, B-27, heparina-sodio con o sin adición de 1% de metilcelulosa, ver también la Tabla 1). Opcionalmente añadir antibióticos al medio a una concentración de 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina para reducir al mínimo el riesgo de posible contaminación. </li><li> Ordenar células RFP- en placas de 96 pocillos preparados desde arriba + RFP y, 1 célula por pocillo (esferas ensayo basado en células individuales) y 100 células por pocillo (multi ensayo esferas basadas en células), respectivamente. Realizar clasificador de células tipo de venta en comercios (ver Materiales) usando el modo de célula única, Sort configuración: 100 μ boquilla, presión de funda 20 psi, y el rendimiento de la máscara 0, la máscara de pureza 32, máscara de fase 16. </li><li> Evaluar la eficiencia chapado al anotar microscópicamente los pocillos que contenían células (para el ensayo basado en células individuales) y contando el número de células en pocillos individuales (para el ensayo basado en células múltiples; Figura 2 </strong&gt;). </li><li> Se incuban las células en condiciones estándar en esferas medianas (para la composición véase el paso 2.6) a 37 ° C y 5% de CO 2. Suplemento diario bFGF (20 ng / ml) y EGF (20 ng / ml). </li><li> Después de una semana, contar números de emergente esferas tumorales utilizando un microscopio estándar con 4X o un aumento de 10X y un microscopio de fluorescencia para detectar la señal de fluorescencia del sistema reportero integrado. Cuente esferas con un diámetro superior a 100 micras como esferas &quot;grandes&quot;, y esferas de diámetro 50 - 100 micras como esferas &quot;pequeños&quot; (Figura 3). Asegúrese de que usted cuenta esferas reales y no teléfonos clusters. NOTA: En los ensayos basados ​​en células individuales formación esfera es más fácil de marcar microscópicamente después de 10 (frente a 7) días de cultivo. </li><li> Calcular la proporción de células de formación de esferas en RFP + y células, respectivamente RFP- en ensayos basados ​​en células individuales (una placa de 96 pocillos para cada experimento individual) o múltiples de células-baensayos sed esferas (uno así para cada experimento individual) expuestos por Shaw et al. 16 NOTA: Proporción de formar esfera células (%) = (número de esferas) / (número de células sembradas) x 100 </li></ol> 3. pasada en serie de esferas <ol><li> Coloque el contenido de cada pocillo en un tubo estéril apropiado y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA. Por esferas ensayos basados ​​en células múltiples, recoger juntos las esferas de un pozo. Lavar el bien de 3 - 5 veces con PBS y centrifugar 2 min más. Por esferas ensayos basados ​​en células individuales, recoger esferas individuales. Debido al bajo número de celdas, utilice tubos de 1,5 ml para las etapas de centrifugación y lavado. </li><li> Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 200 l de 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> Con el fin de conseguir la separación óptima de la célula, se incuba la suspensión celular a 37 ° C durante 5 min en un agitador suave. Optimizar tripsinación hora de su línea celular a una menor tasa de muerte celular: si no hay grandesesferas es triturado visible suavemente con una punta de pipeta 100 l. En el caso de las grandes esferas todavía están presentes, se incuban con tripsina otros 3 min y luego proceder a la etapa de trituración. En caso de una sola ensayos basados ​​en células que asegúrese de optimizar el tiempo para el rendimiento óptimo de las células de las células vivas durante la etapa de tratamiento con tripsina. </li><li> Para inactivar la tripsina, añadir 500 l de medio completo y se centrifuga a 300 xg durante 10 min, en el caso de ensayos de células individuales, se centrifuga durante 2 min adicionales. </li><li> Eliminar las células sobrenadante y resuspender cuidadosamente en medio esferas. </li><li> Utilice un filtro de tapón del filtro celular 40 micras para obtener una suspensión de una sola célula. </li><li> En el caso de utilizar células RFP- en ensayos de células-bassed múltiples RFP + y, evaluar el porcentaje de células fluorescentes en cada pocillo después de la resuspensión citómetro de flujo a través de análisis. </li><li> Para los ensayos de resiembra de serie de células individuales, semillas de 1 célula por pocillo en un nuevo bajo de fijación placa de 96 pocillos de ultra preparados como se detalla anteriormente. De una esfera individual, sembrar aproximadamente 20 pozos individuales. Para los ensayos de resiembra de múltiples esferas primarias basados ​​en células, las células de semillas obtienen a partir de un pocillo de esferas primarias en una nueva placa de 96 pocillos y contar el número de células por microscopía día siguiente. </li><li> Evaluar la proporción de células de formación de esferas en ensayos de esferas secundarias utilizando la fórmula descrita en el paso 2,11. </li></ol> Análisis 4. Resultado <ol><li> Analizar los resultados de los experimentos realizados por triplicado independientes y utilizar la prueba t de Student bilateral para analizar los valores normalmente distribuidos y de otro tipo de Mann-Whitney-Tests para el análisis estadístico. </li></ol>

<ol><li>Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+the+principles+of+stem-cell+biology+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Applying the principles of stem-cell biology to cancer.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).</li>
<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+Molecular+concepts+and+relevance+as+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets.</a> Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).</li>
<li>Silva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).</li>
<li>Kryczek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+aldehyde+dehydrogenase+and+CD133+defines+ovarian+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells.</a> Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).</li>
<li>Stewart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+and+instability+of+human+ovarian+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).</li>
<li>Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+expression+correlates+with+favorable+prognosis+in+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers.</a> Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).</li>
<li>Cannistra, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+variant+expression+is+a+common+feature+of+epithelial+ovarian+cancer%3A+lack+of+association+with+standard+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors.</a> J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).</li>
<li>Bareiss, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+expression+associates+with+stem+cell+state+in+human+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma.</a> Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).</li>
<li>Pham, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+expression+and+prognostic+significance+in+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Pathol%22%5BJournal%5D)">SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma.</a> Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).</li>
<li>Lengerke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+embryonic+stem+cell+marker+SOX2+in+early-stage+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma.</a> BMC Cancer. 11, 42(2011).</li>
<li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Higgins, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cell+multipotency+correlates+with+nanog+expression+and+extent+of+passaging+in+human+glioblastoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts.</a> Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).</li>
<li>Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphere-forming+assays+for+assessment+of+benign+and+malignant+pancreatic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).</li>
<li>Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+identification+of+colon+cancer+stem+cell-derived+spheres+from+the+Colo205+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line.</a> Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+novel+phenotypically+distinct+breast+cancer+cell+subsets+based+on+Sox2+transcription+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity.</a> Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+reversible%2C+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).</li>
<li>Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+skin%3A+transforming+growth+factor-beta+%28TGF-beta%29+facilitates+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth.</a> Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).</li>
<li>Walia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+breast+epithelial+marker+hCLCA2+promotes+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+indicates+higher+risk+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis.</a> Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).</li>
<li>Leung, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-small+cell+lung+cancer+cells+expressing+CD44+are+enriched+for+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties.</a> PLoS One. 5 (11), e14062(2010).</li>
<li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133%2B+cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).</li>
<li>Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem-like+cells+can+be+isolated+with+drug+selection+in+human+ovarian+cancer+cell+line+SKOV3%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).</li>
<li>Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+and+breast+cancer+spheres+are+similar+in+transcriptomic+features+and+sensitive+to+fenretinide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide).</a> Biomed Res Int. 2013, 510905(2013).</li>
<li>Du, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+and+mechanisms+of+anti-CD44+monoclonal+antibody+A3D8+on+proliferation+and+apoptosis+of+sphere-forming+cells+with+stemness+from+human+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer.</a> Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).</li>
<li>Xiang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17+produced+by+tumor+microenvironment+promotes+self-renewal+of+CD133+cancer+stem-like+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer.</a> Oncogene. , (2013).</li>
<li>Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+ovarian+cancer+cells+in+different+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems.</a> Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).</li>
<li>Soritau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+chemoresistance+and+tumor+sphere+formation+as+a+laboratory+model+for+peritoneal+micrometastasis+in+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Rom+J+Morphol+Embryol%22%5BJournal%5D)">Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer.</a> Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).</li>
<li>Shi, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cancer+stem+cell-like+cells+from+human+epithelial+ovarian+carcinoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+ovarian+cancer-initiating+cells+from+primary+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors.</a> Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).</li>
<li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypoxic+microenvironment+upgrades+stem-like+properties+of+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 201(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Culturas esferas son un método ampliamente utilizado para ensayar el potencial de células madre de cáncer y enriquecer para las células-madre como en una amplia gama de células tumorales humanas 15,25,26. Bajo estas condiciones de cultivo, se espera que las células cancerosas que carecen de la capacidad de auto-renovación de diferenciar y eventualmente someterse a la muerte celular. Aunque pueden formar inicialmente grupos de células o incluso esferas tumorales especialmente en ensayos primarios, no son capac...

Cada vez hay más evidencia de que los carcinomas de ovario están formados por mezclas heterogéneas de células y albergan las llamadas "células madre cancerosas" (CSCs) responsables del inicio, mantenimiento y recaída de la enfermedad después de las terapias citotóxicas convencionales1-3. Por lo tanto, el desarrollo de estrategias moleculares dirigidas a las CSC de ovario es un objetivo importante y promete mejorar la terapia de las pacientes con cáncer de ovario.
Un requisito previo para la comprensión de las características moleculares de las CSCs es su aislamiento fiable de las no CSCs. Sin embargo, la identificación de las CSC ováricas parece ser un desafío. Si bien se ha reportado que la expresión de CD133 y la actividad de la aldehído deshidrogenasa (ALDH)4,5 marcan las CSC ováricas, algunos datos indican que estos marcadores son inestables6. Consistentemente, en el cáncer de ovario, excepto, por ejemplo, en el carcinoma de mama7, la expresión de ALDH1 se asocia con un resultado favorable8 y la expresión de la variante propuesta del marcador de células madre CD44 no tiene valor pronóstico9. Más recientemente, hemos demostrado que la expresión de la proteína de células madre embrionarias SOX2 confiere tallo a las células de carcinoma de ovario10 y la alta expresión de SOX2 se asocia con carcinomas de ovario y mama clínicamente agresivos11,12. Por lo tanto, en este informe utilizamos una construcción reportera lentiviral que contiene una proteína de fluorescencia roja (RFP) cuya expresión está controlada por una región reguladora de SOX2, como método para aislar CSC ováricas putativas.
Por definición, las CSC pueden autorenovarse y diferenciarse, dando lugar a todos los tipos de células tumorales. Las poblaciones putativas de CSC necesitan ser analizadas en ensayos funcionales realizados in vivo. Por razones obvias, en las células humanas estas pruebas funcionales se limitan a ensayos de xenoinjertos, que comprenden principalmente el trasplante de células tumorales humanas en ratones inmunocomprometidos10,13.
Un método alternativo in vitro fue ofrecido por Brent Reynolds y Sam Weiss, quienes informaron por primera vez del llamado ensayo de la neurosfera como un ensayo sustituto que evalúa el potencial madre en las células neuronales14. Dontu y colaboradores confirmaron posteriormente el uso de este ensayo para evaluar el potencial de las células madre en las células mamarias15,16. Aquí, las células mamarias humanas se sembraron en diferentes cantidades en un medio libre de suero suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), B-27 y heparina y se cultivaron en condiciones no adherentes durante siete a diez días antes de que la formación de esferas se determinara mediante microscopía. Siguiendo este protocolo con algunos ajustes en el número de células, el medio de crecimiento y los suplementos, varios grupos han explorado el potencial de las células madre in vitro de varios tipos de cáncer como los tumores de mama17, cerebro18, páncreas19 y colon20. En el carcinoma de ovario, recientemente hemos reportado la factibilidad del ensayo de esferas y comparado sus resultados con los recolectados en modelos de xenoinjerto murino in vivo 10. Encontramos que la sobreexpresión de la proteína de células madre SOX2 mejoró tanto la formación de esfera in vitro como la tumorigénesis in vivo de las células de carcinoma de ovario humano10. Sin embargo, la frecuencia de células iniciadoras de esferas fue mayor que la frecuencia de células iniciadoras de tumores medida in vivo10, lo que sugiere que el ensayo de esfera puede dar lugar a resultados falsos positivos debido a razones técnicas o, alternativamente, el ensayo in vivo puede ser ineficiente y dar lugar a resultados falsos negativos.
En este informe, analizamos con más detalle los ensayos de esferas ováricas basados en múltiples células, revisamos los diferentes protocolos disponibles en la literatura y los comparamos con un ensayo basado en una sola célula. Demostramos que el ensayo basado en una sola célula proporciona resultados más precisos y reproducibles que los ensayos basados en múltiples células, que pueden estar muy influenciados por la densidad de las células en placa, a menos que se agregue metilcelulosa a los cultivos para inmovilizar las células. Sin embargo, también en los ensayos basados en células individuales, el potencial de iniciación de la esfera in vitro se observa con mayor frecuencia que el potencial de iniciación tumoral in vivo.

<table><tbody><tr><td>Placa de baja fijación</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>MEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>concentración final: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>concentración final: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen/ Gibco</td><td>17504-044</td><td>concentración final: 1X</td></tr><tr><td>Heparina-Natrium-25000 IE</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.02</td><td>dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Pluma/Estreptococo</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Shield1</td><td>Clontech</td><td>632189</td><td>dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (polvo)</td><td>Gibco</td><td>42400-010</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de puromicina</td><td>Applichem</td><td>A2856</td><td></td></tr><tr><td>Cell clasificador</td><td>BD</td><td></td><td>Aria III clasificador de células</td></tr><tr><td>FACS analizador</td><td>BD</td><td></td><td>Accuri c6 citómetro de flujo</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX50 Osiris</td></tr></tbody></table>

evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células esferas ensayos

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Años de investigación indican que los cánceres de ovario albergan una mezcla heterogénea de células, incluyendo una subpoblación de las llamadas "células madre cancerosas" (CSCs) responsables de la iniciación, mantenimiento y recaída del tumor después de las quimioterapias convencionales. Por lo tanto, la identificación de las CSC ováricas es un objetivo importante. Un método comúnmente utilizado para evaluar el potencial de CSC in vitro es el ensayo de esferas, en el que las células se siembran en condiciones de cultivo no adherentes en un medio libre de suero suplementado con factores de crecimiento y la formación de esferas se puntúa después de unos días. Aquí, revisamos los protocolos actualmente disponibles para los ensayos de esferas de cáncer de ovario humano y realizamos un análisis lado a lado entre los ensayos basados en múltiples células de uso común y un sistema más preciso basado en la siembra de una sola célula. Nuestros resultados indican que tanto los ensayos de esferas multicelulares como los basados en células individuales se pueden utilizar para investigar la formación de esferas in vitro. Los ensayos basados en células individuales, más laboriosos y costosos, son más adecuados para la evaluación funcional de células individuales y conducen a resultados generales más precisos, mientras que los ensayos basados en células múltiples pueden verse fuertemente influenciados por la densidad de las células en placa y requieren experimentos de valoración por adelantado. La suplementación con metilcelulosa en ensayos basados en múltiples células se puede utilizar eficazmente para reducir los artefactos mecánicos.

En los ensayos de esferas convencionales, casi el 40% de RFP + OVCAR-3 células vs. 20% de las células RFP- dio lugar a una esfera tumor individual en el ensayo de esferas primaria (Figura 4A). Por otra parte, esferas formadas por las células RFP + eran más grandes en tamaño que los formados por células RFP-. Cuando chapada en ensayos basados ​​en células individuales, células RFP + también formaron más esferas que las células RFP-, lo que confirma los resultados anteriores. ...

Los ensayos de esferas in vitro se utilizan comúnmente para identificar células madre cancerosas. Aquí comparamos ensayos de esferas individuales con ensayos basados en múltiples células. Los ensayos más laboriosos basados en células individuales o la suplementación con metilcelulosa dan resultados más precisos, mientras que los ensayos basados en células múltiples realizados en medio líquido pueden verse muy influenciados por la densidad celular.

Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células Esferas ensayos

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar las propiedades de las células madre de las células de carcinoma de ovario humano mediante ensayos de esferas basadas en células múltiples y únicas. Esto se logra seleccionando primero las células transducidas de lentivirus RFP reporteros SOX por el tratamiento con Pur Mycin en el segundo paso, las células positivas y negativas para RFP se aíslan y se siembran como colonias de células individuales o múltiples por pozo. A continuación, la formación de la esfera primaria se analiza microscópicamente y luego los cultivos de la esfera primaria se disocian y se replatean para el análisis de la formación de la esfera secundaria.En última instancia, estos ensayos esféricos se utilizan para calcular la proporción de células madre putativas de cáncer de ovario que muestran capacidad de formación de esferas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre cancerosas, como cuáles son algunas poblaciones potenciales de células madre cancerosas y cuál es la frecuencia en toda la bolsa tumoral. Aunque este método puede proporcionar información sobre la identificación de células madre de cáncer de ovario, también se puede aplicar para aislar las células madre cancerosas de otras entidades tumorales sólidas, como el carcinoma de mama.24 horas después de transducir células de carcinoma de ovario humano con partículas lentivirales, extraer el sobrenadante viral y lavar las células en cultivo de PBS. Las células en medio completo durante 48 horas. Luego cambie el medio y agregue 10 microgramos por mililitro de piromicina después de cinco días.Trate los cultivos con shield uno en uno por 1000 diluciones al día siguiente. Lave las celdas en PBS y luego sepárelas con 0.05% de trips en EDTA. Después de tres minutos, detenga la reacción con medio completo.Cuente las células y centrifuérrelas durante cinco minutos a 300 veces G y temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células cuidadosamente en 0,5 a un mililitro de PBS estéril y luego cuele la suspensión celular resultante a través de un filtro de 40 micrómetros. Ajuste las celdas a una dilución de cinco por 10 a seis celdas por mililitro y, a continuación, agregue 100 microlitros de medio de esferas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja a continuación para un ensayo de esfera basado en una sola célula.Utilice el modo de celda única para clasificar una celda en cada pocillo de la placa. A continuación, marque microscópicamente las células para evaluar la eficiencia del recubrimiento. Incubar las células en esferas frescas, a 37 grados centígrados, y 5% de CO2 con suplementación diaria con factor de crecimiento básico de fibroblastos y factor de crecimiento epidérmico.Después de una semana, determine el número de esferas tumorales emergentes mediante microscopía óptica y la presencia de la señal fluorescente del sistema reportero integrado mediante microscopía fluorescente. Cuente las esferas con un diámetro superior a 100 micrómetros como esferas grandes y las esferas con un diámetro de 50 a 100 micrómetros como esferas pequeñas. Teniendo cuidado de contar esferas reales y no grupos de células.A continuación, calcule la proporción de celdas positivas o negativas RFP que forman esferas de acuerdo con la fórmula para pasar. Las esferas comienzan transfiriendo el contenido de cada pocillo a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, enjuague cada pocillo de tres a cinco veces con PBS para asegurarse de recoger todas las esferas y centrifugar las células durante 10 minutos a 300 veces G y a temperatura ambiente.Después de la centrifugación, retire el snat y vuelva a suspender los pellets en 200 microlitros de 0,05% tripsin EDTA a 37 grados centígrados en un agitador suave durante cinco minutos. Si no hay esferas grandes visibles después de cinco minutos, tritrate suavemente la solución celular con una punta de pipeta de 100 microlitros y agregue 500 microlitros de medio completo para inactivar la tripsina. Gire las celdas, vuelva a suspender los gránulos cuidadosamente en esferas de medio y drene la suspensión celular resultante a través de un filtro de 40 micrómetros como se acaba de clasificar.Finalmente, para el replateado en serie de las células individuales, siembre células individuales de una esfera primaria en 100 microlitros de esferas, medio por pocillo en una nueva placa de 96 pocillos de fijación ultra baja. A continuación, utilice la misma fórmula que para el ensayo de esferas primarias para evaluar la proporción de células formadoras de esferas en las esferas secundarias. Los ensayos en esferas multicelulares determinaron casi el 40% de las células de carcinoma de ovario humano positivas para RFP, en comparación con solo el 20% de las células negativas para RFP, lo que dio lugar a una esfera tumoral individual en el ensayo de esferas primarias.Sorprendentemente, se cuentan números más altos de esferas a partir de números más bajos de células plateadas en medios basados en MGEM y D-M-E-M-F 12, lo que demuestra que las modalidades de recubrimiento sesgaron en gran medida los resultados de este ensayo. Por el contrario, cuando las células se inmovilizan mediante la adición de 1% de metilcelulosa, la eficiencia de la formación de esferas es en su mayoría independiente de la densidad celular en cultivos de esferas basadas en múltiples células. Aproximadamente el 35% de las células de las esferas positivas para RFP pierden su señal fluorescente roja después de siete días de cultivo, lo que sugiere que estas células han experimentado diferenciación, mientras que más del 65% de las células conservan una señal RFP que sugiere una capacidad de autorrenovación.Por el contrario, las células de esferas generadas a partir de células inicialmente negativas a RFP siguen siendo RFP negativas, lo que indica que no pueden restablecer el potencial de las células madre en estas condiciones. La microscopía de fluorescencia realizada en esferas generadas a partir de células individuales confirma estos datos, demostrando que las esferas individuales derivadas de células positivas para RFP contienen células positivas para RFP y negativas para RFP. Mientras que las esferas derivadas de las celdas negativas RFP conservan su falta de señal roja siguiendo este procedimiento.Otros métodos, como los anticuerpos, la tinción o el análisis de la expresión génica mediante PCR cuantitativa, se pueden realizar para caracterizar aún más las células con una gran capacidad de formación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que es necesario realizar ensayos de trasplante in vivo en ratones inmunodeprimidos para validar las propiedades de las células madre tumorales de las células iniciadoras de la esfera.

evaluation-stem-cell-properties-human-ovarian-carcinoma-cells-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este protocolo de vídeo se muestra el aislamiento y la expansión de las células madre como de mutliforme resecado quirúrgicamente de glioblastoma humano (GBM) del tejido tumoral usando el método de ensayo de cultivo neuroesfera.

El aislamiento y la expansión de las células de glioblastoma humano multiforme tumor mediante el ensayo de neuroesfera

Se describen las metodologías para el establecimiento...

Heterotípicos tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelado de estromal-epitelial interacciones durante la iniciación y progresión del cáncer de ovario

La invasión de células de cáncer de ovario en el revestimiento mesotelial del peritoneo es un proceso dinámico en el tiempo. Utilizando un analizador de tiempo real, la capacidad invasiva de las células de cáncer de ovario en un modelo de esferoide mesotelial co-cultivo de células puede ser cuantificado durante períodos de tiempo prolongados, y proporciona información sobre los factores que regulan el proceso metastásico.

Evaluación de Cáncer de Ovario esferoide El apego y la invasión de células mesoteliales en Tiempo real

Las células madre del cáncer (CSC) están implicados en la recidiva del tumor debido a la quimio-resistencia. Hemos optimizado un protocolo para la selección y expansión de células madre cancerosas de líneas celulares de cáncer de ovario. Mediante el tratamiento de las células con el cisplatino quimioterapia y cultivar en una célula madre promoción de los medios de comunicación que enriquecen las culturas CSC no adherentes.

El enriquecimiento de las células madre quimiorresistente cáncer ovárico de líneas celulares humanas

Los ensayos de mama flotante pueden investigar el subconjunto de células de cáncer de mama similares a las células madre que sobreviven en condiciones de suspensión y muestran una tumorigénesis mejorada cuando se implantan en ratones.  Este protocolo proporciona una medida in vitro conveniente de la capacidad de formación de esferas, un indicador de la tumorigénesis in vivo, al tiempo que facilita el análisis del panorama transcripcional asociado al tallo.

Mammosphere Ensayo Formación de cáncer de mama humano tejidos y líneas celulares

Las células madre de cáncer de páncreas (CSC) pueden expandirse in vitro utilizando la técnica de cultivo de esfera independiente del anclaje, que representa una poderosa herramienta para estudiar la biología de las CSC y puede servir como primer paso para desarrollar nuevas terapias dirigidas a las CSC. Aquí se proporciona la metodología para expandir, analizar y dirigirse a las CSC pancreáticas.

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

La presencia de células madre del cáncer (CSC) en sarcomas óseos se ha vinculado recientemente a su patogénesis. En este artículo, presentamos el aislamiento de células madre cancerosas a partir de cultivos celulares primarios obtenidos de biopsias humanas de osteosarcoma convencional (OS) utilizando la capacidad de las células madre cancerosas de crecer bajo condiciones no adherentes.

Establecimiento de Cultivos Celulares del Cáncer Humano de osteosarcoma convencional Tallo

Este protocolo describe la generación de esferoides derivados del paciente, y el análisis posterior, incluyendo la cuantificación de la proliferación, las pruebas de citotoxicidad, la citometría de flujo, la tinción de inmunofluorescencia y la toma de imágenes confocales, con el fin de evaluar la droga potencial de los candidatos como terapias antineoplásicas. Este protocolo apoya la medicina de precisión con la identificación de medicamentos específicos para cada paciente y etapa de la...

Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

El objetivo de esta metodología es identificar células madre cancerosas (CSC) en líneas celulares cancerosas y muestras de tumores humanos primarios con el protocolo de formación de esferas, de manera robusta, utilizando ensayos funcionales y caracterización fenotípica con citometría de flujo y occidental Blot.

Obtención de esferas de células madre de cáncer de cáncer de tumores ginecológicos y de cáncer de mama

Las células madre del cáncer de ovario (OCSC) son responsables de la iniciación, recurrencia, resistencia terapéutica y metástasis del cáncer. Se considera que el nicho vascular OCSC promueve la autorrenovación de las OCSC, lo que lleva a la quimiorresistencia. Este protocolo proporciona la base para establecer un modelo de nicho vascular OCSC reproducible in vitro.

Evaluación de las propiedades angiogenéticas de las células madre similares al cáncer de ovario utilizando el sistema de cocultivo tridimensional, NICO-1

Este protocolo presenta un sistema nuevo, robusto, y reproducible de la cultura para generar y para crecer esferoides tridimensionales de las células de la adenocarcinoma de los dos puntos Caco2. Los resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque para estudiar la biología de las células madre cancerosas, incluida la respuesta a la quimioterapia.

Un modelo tridimensional de esferoides para estudiar las células madre del cáncer de colon

Aprende a evaluar propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano mediante ensayos de esferas individuales y multicelulares. Este método permite identificar poblaciones de células madre cancerosas con mayor precisión.

Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células Esferas ensayos (Video) | JoVE Journal

Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células Esferas ensayos

Explorar más videos

Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados en células Esferas ensayos