Name: La intubación mediada intratraqueal (IMIT) instilación: A, Sistema de Entrega de pulmón-específica no invasiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende la técnica IMIT para la entrega no invasiva de bacterias directamente a los pulmones de ratones. Este método permite estudios reproducibles de enfermedades respiratorias con alta eficiencia de recuperación del inóculo.

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Los autores están agradecidos por el apoyo de las instalaciones centrales del Centro de Modelos Animales de Medicina Predicativa (Carol Vanover, Ashley Biller y Jennifer Kraenzle) y Microbiology (Daniel Cramer y Julie Sotsky). Este trabajo fue apoyado por fondos de los NIH (HHSN272201000033I a M.B.L y J.M.W.).

NOTA: Todos los procedimientos descritos aquí fueron revisados ​​y aprobados por la Universidad de Louisville Comité Institucional de Bioseguridad (protocolo # 13-056) e Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (protocolo # 13-064). 1. Preparación del Tinte <ol><li> Diluir 0,1% (w / v) azul brillante de Coomassie en PBS y esterilizar filtro utilizando un filtro de jeringa de 0,45 mM. </li></ol> 2. Preparación de Pseudomonas aeruginosa Cultura <ol><li> 15 horas antes de la instilación, se inoculan 3 ml de caldo de cultivo con una sola colonia bacteriana. </li><li> Crece la cultura hr 15 a 37 ° C en un agitador (200 rpm). </li><li> Centrifugar 1 ml de cultivo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml 12.000 xg durante 30 seg. </li><li> Retire el medio y volver a suspender el sedimento en 1 ml de PBS. </li><li> Diluir una alícuota de la suspensión bacteriana Stock 1:10 en PBS y medir el OD 600 de la suspensión bacteriana diluida para determinar elconcentración bacteriana. </li><li> Diluir la suspensión bacteriana de valores en PBS a la concentración deseada de inóculo bacteriano, utilizando un volumen de entrega de 50 l para la inoculación IMIT. </li></ol> 3. IMIT instilación <ol><li> Colocar un grupo de ratones en la cámara de inducción de anestesia con isoflurano y anestesiar utilizando un 2 - mezcla de isoflurano / oxígeno del 3%. </li><li> En el inicio de la sedación inicial, pescuezo del ratón, sostiene el ratón en posición vertical, y administrar 10 l de una solución de lidocaína al 2% en aguja de sonda a la parte posterior de la garganta y permitir que la solución fluya hacia abajo para la epiglotis. Devuelva el ratón a la cámara de la anestesia. <ol><li> Deje un mínimo de 5 minutos para permitir la lidocaína a surtir efecto completo como anestésico local. </li></ol></li><li> Cuando los ratones han alcanzado el nivel deseado de sedación (tasa de ~ 60 bpm de respiración), reducir el isoflurano al 2% para mantener la sedación. </li><li> Precarga tinte o inóculo bacteriano en un 250 l hermética a los gasesen forma de jeringa de precisión con una aguja roma largo 22 G. <ol><li> En primer lugar la elaboración de 150 l de aire, medida por el émbolo de teflón de la jeringa. A continuación, la elaboración de 50 l de inóculo haciendo avanzar el émbolo de teflón de la marca de 150 l hasta la marca de 200 l en el cuerpo de la jeringa. NOTA: Cuando la muestra es expulsada en un ratón intubado, la suspensión 50 l será entregado primero, seguido por un cojín de aire 150 l que distribuirá el inóculo en todo el pulmón. </li></ol></li><li> Retire un ratón desde la cámara de inducción y poner en posición supina sobre una plataforma de intubación. Asegure el ratón a la plataforma enganchando sus incisivos con una junta tórica adjunta a la tira de velcro, y asegurar el velcro a la plataforma. Levante el ratón a una inclinación de 45 °. </li><li> El uso de un aplicador de micro algodón, retraer la lengua con un movimiento de balanceo, utilizando la mano dominante. </li><li> Con la mano no dominante, utilice un ajuste otoscopio operando con un espéculos intubación tanto maintain retracción de la lengua y visualizar la glotis. </li><li> Con la mano dominante, utilice un alambre de guía roscada a través de un catéter de 20 G de intubar el ratón, asentar el catéter a una profundidad de 10 mm en la tráquea de ratón (catéter está en forma de un manguito de silicio con 10 mm de catéter expuesto). Retire el otoscopio / espéculos. </li><li> Confirmar que el ratón ha sido intubado correctamente por asegurar el catéter con la mano no dominante mientras se coloca brevemente una longitud conectado Luer de 1/16 &quot;tubo transparente que contiene un colorante de color. NOTA: El tinte migrar rápidamente hacia atrás y adelante en respuesta a la respiración. </li><li> No continúe con los pasos siguientes, si la confirmación de la intubación no se ha establecido en este punto. Si la intubación intentado realizar falló, restablecer el alambre y catéter guía para un intento adicional en la intubación. NOTA: Es aconsejable intentar más de dos intubaciones de un ratón en una sesión sin causar traumatismo en el ratón. </li><li> Continuarasegurar el catéter con la mano no dominante, mientras que la inserción de la / aguja roma jeringa de precisión que contiene el amortiguador de suspensión líquido / aire. </li><li> Dispensar el líquido / aire directamente en el pulmón en un solo movimiento fluido y retire inmediatamente la aguja / catéter del ratón. </li><li> Devuelva el ratón a una jaula y permitir la recuperación de la anestesia. </li></ol> 4. Caracterización de las IMT Entrega <ol><li> Después de la instilación IMIT, la eutanasia el ratón por asfixia de CO 2 en un momento apropiado después de la inoculación. </li><li> Asegure el ratón sacrificados en un tablero de disección y tomar el pecho y el abdomen con EtOH al 70% utilizando una jeringa. </li><li> Si la evaluación de la distribución de un agente de imagen en todo el pulmón, eliminar los pulmones de los animales utilizando una técnica estéril y mostrar los pulmones en su caso para la imagen. NOTA:. Los pulmones pueden ser preparados por técnicas de tinción histológicas adicionales a través de la fijación o la criopreservación apropiado &lt;/ Li&gt; <li> Si la evaluación de la carga bacteriana del tejido pulmonar infectado, eliminar los pulmones del animal utilizando una técnica estéril. Coloque los pulmones en un estéril, previamente pesado 1 oz bolsa de muestra. Pesar y registrar el peso de la bolsa de muestra + pulmones. <ol><li> Añadir 1 ml de PBS 1x estéril a cada bolsa de tejidos + muestra. Vuelva a sellar la bolsa de muestra. </li><li> Homogeneizar los tejidos por una suave rodando 25 ml pipeta serológica sobre la bolsa de muestra + tejido. </li><li> Generar diluciones seriadas del homogeneizado de pulmón en PBS estéril y placa en placa de agar (LB, o en su caso de las especies de bacterias en estudio): <ol><li> Llevar a cabo una dilución en serie de seis veces en una placa de fondo en U 96 por pipeta multicanal a continuación, la placa muestras por triplicado por multicanal en la placa de agar. </li></ol></li><li> Incubar las placas de agar durante la noche a 37 ° C y enumerar unidades formadoras de colonias al día siguiente. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La instilación IMIT ofrece mejoras clave a los modelos de enfermedades respiratorias existentes en la capacidad de instilar reactivos de manera reproducible directamente en el pulmón. Es un enfoque rápido que está idealmente situado para un equipo de dos investigadores, uno de los cuales gestiona la logística de la anestesia y el enjaulamiento, y el otro que realiza la técnica IMIT. Se pueden realizar estudios grandes utilizando IMIT con un compromiso de tiempo promedio de 2 a 3 minutos por ratón. Debido a que el enfoque utiliza isoflurano como anestésico, los ratones se recuperan rápidamente de la anestesia, lo que reduce el tiempo de cría de los animales durante la recuperación.
El aspecto técnicamente más desafiante del método IMIT es el paso inicial de intubar ratones. Las personas que aprenden a realizar IMIT pueden concentrarse en este primer paso de colocación del catéter y asegurarse de que la intubación se haya logrado a través de la confirmación visual del movimiento del tinte. El beneficio del enfoque es que la instilación específica del pulmón está garantizada mediante el uso de la confirmación de la intubación, lo que aumenta la confianza tanto del nuevo investigador como del experto que intenta intubar a un animal difícil. Los elementos clave para optimizar la probabilidad de una intubación exitosa son: i) lograr una sedación profunda para permitir un tiempo de trabajo suficiente, ii) colocación correcta de los espéculos en la boca para permitir una buena visualización de la epiglotis, iii) buena colocación profunda de los espéculos para que la lengua permanezca retraída durante todo el procedimiento, y iv) uso de la plataforma basculante para apoyar las manos del investigador para que el procedimiento se realice relajado y con un enfoque constante.
Una de las limitaciones del procedimiento IMIT está relacionada con la frecuencia de los eventos de instilación IMIT. Debido al posible trauma asociado con una intubación perdida, no se recomienda que se realicen más de dos intentos de intubación en una sola sesión (hasta dos fallas). La IMIT tiene un excelente potencial en su capacidad para ser utilizada para administrar terapias en el pulmón murino, sin embargo, los regímenes terapéuticos que utilizan la administración muy frecuente de reactivos en el pulmón pueden no ser adecuados para la IMIT. Es posible que IMIT se pueda usar diariamente para administrar reactivos en un pulmón murino sin causar un trauma significativo, pero solo cuando lo realiza un investigador altamente calificado, ya que se cree que la mayoría de los traumatismos asociados con la intubación se asocian con un evento de intubación perdido. Este IMIT de alta frecuencia debe discutirse con veterinarios locales e IACUC.
Una limitación potencial adicional de IMIT es el tamaño del ratón que se está intubando. El procedimiento IMIT descrito anteriormente se desarrolló utilizando ratones de aproximadamente 17 a 22 g, donde se encontró que un catéter de 20 G era de un tamaño adecuado para la tráquea de ratones en este rango de tamaño. Los catéteres más grandes se han utilizado con éxito en ratones más viejos; el desarrollo inicial de IMIT hizo uso de un catéter de 18 G en ratones BALB/c que son >20 g. Es importante destacar que, si se utilizan tamaños de catéter alternativos, se deben obtener agujas romas que se ajusten a la luz del catéter y se recorten a una longitud que se extienda solo 1 mm más allá de la punta del catéter. La intubación de ratones de menos de 17 g puede ser posible, pero no se recomienda debido a la experiencia requerida, y requeriría el uso de catéteres y espéculos más pequeños que los descritos anteriormente.
Hemos utilizado IMIT para la administración de varios patógenos respiratorios además de P. aeruginosa, incluidos B. pseudomallei9 y Klebsiella pneumoniae10. El modelo IMIT ha logrado avances importantes en nuestros estudios de la enfermedad respiratoria de B. pseudomallei , habiendo identificado que la inoculación intranasal causa una morbilidad temprana relacionada con la URT en ratones en lugar del criterio de valoración de la enfermedad sistémica observado en la enfermedad humana9. B. pseudomallei es un agente selecto de nivel 1 de impacto de biodefensa y, como tal, se están desarrollando modelos de enfermedades respiratorias para la exposición a aerosoles que modelan una posible ruta de entrada relacionada con la biodefensa para patógenos armados. Debido a que los modelos de aerosol actuales dan como resultado la infección tanto de la URT como de la LRT, los mismos fenotipos de morbilidad temprana potencial que hemos identificado para el modelo intranasal de la enfermedad respiratoria de B. pseudomallei pueden aplicarse al modelo de aerosol. Una adaptación futura del modelo IMIT podría ser una administración de aerosol mediada por intubación (IMAD), en la que los ratones son intubados para la administración de aerosol objetivo solo en el pulmón. Actualmente hay ventiladores mecánicos disponibles para mantener la anestesia con isoflurano, que podría adaptarse para administrar un desafío patógeno en aerosol, en lugar de líquido.
IMIT se desarrolló inicialmente como un enfoque para optimizar la administración de bacterias al pulmón, pero también tiene aplicación para la administración de otros reactivos en el pulmón del ratón. Como se discutió anteriormente, la administración intranasal de compuestos en ratones da como resultado una administración de reactivos altamente variable y de baja eficiencia en el órgano diana del pulmón. La administración intranasal de reactivos de imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET) al pulmón murino produjo una eficiencia de administración del 40%11, mientras que hemos demostrado que IMIT ofrece una excelente alternativa a otros enfoques de administración pulmonar con su eficacia de administración del >98% y distribución multilobar. Esta mejora en la administración dirigida al pulmón tiene el potencial de aumentar la reproducibilidad de la administración terapéutica para el tratamiento de la enfermedad pulmonar. IMIT podría ofrecer beneficios similares a los estudios de: i) el impacto de los irritantes pulmonares ambientales, ii) estudios fenotípicos de cáncer de pulmón, iii) eliminación de ARNip específicos de pulmón.

Los ratones se han utilizado para modelar numerosas manifestaciones de enfermedades humanas, incluyendo una gran variedad de enfermedades respiratorias. Modelos de enfermedades sustitutos son a menudo incapaces de recapitular todos los aspectos de una enfermedad modelado, por lo general debido a la fisiológica importante o diferencias inmunológicas en los dos modelos de acogida. Por lo tanto, un objetivo de la mejora de los sistemas de modelo es el desarrollo de métodos que permitan a los sustitutos reflejan más de cerca un proceso de enfermedad o de acogida que la respuesta observada en el sistema host original. Hay varias diferencias fisiológicas clave entre ratones y seres humanos en el mecanismo por el que se inspiran aire. Se incluyen en estas diferencias son diferencias significativas en el tamaño radiométricos entre la URT y LRT. Se ha estimado que los ratones que poseen&gt; 100 veces el área de superficie URT relativa a los seres humanos, normalizado contra el total de la capacidad pulmonar 1,2. Por lo tanto, los cornetes nasales del ratón permiten más extensa de filtrado de aire inspirado para facilitar una mayor tasa de breathing, que puede tener un impacto significativo en los estudios de neumonía si la infección de la cavidad nasal juega un papel importante en la progresión de la enfermedad. Se han empleado varios enfoques diferentes para infundir bacterias en los pulmones de ratones para estudiar la enfermedad respiratoria similar a la humana. El más común de estos enfoques es la inoculación intranasal, en el que se aplica una suspensión líquida en uno o ambos orificios nasales de un ratón. Aunque es relativamente sencillo, advertencias, como el volumen de la instilación y el tipo de anestesia que se utiliza puede afectar la eficiencia de la instilación en la LRT a través de la inoculación intranasal 3-5. Específicamente, Miller et al. han mostrado que la instilación intranasal de Francisella tularensis en los volúmenes de menos de 50 l no dio lugar a la instilación de las bacterias en la LRT 6. Observaron además mejor instilación LRT al utilizar isoflurano inhalado en lugar de inyectar ketamina / xilacina para la anestesia. Sin embargo, nuestra experience con Yersinia pestis inoculación intranasal indica la inoculación más consistente se puede lograr usando ketamina / xilacina en comparación con isoflurano (MBL, datos no publicados). Estas diferencias podrían atribuirse a patógeno utilizado o a la variación en los procedimientos de laboratorio, pero importante destacar la variabilidad potencial en esta técnica. Además, los pulmones cosechadas poco después de la instilación intranasal muestran que un porcentaje relativamente bajo del inóculo bacteriano inicial alcanza el pulmón (en el caso de Y. pestis, sólo el 10% se recuperaron 1 hr después de la instilación 7), lo que sugiere que un gran número de bacterias podría ser retenido en la URT (o se ingiere en el tracto gastrointestinal). En ciertos modelos de enfermedad, esta deposición significativa de bacterias en la mucosa URT puede confundir nuestra comprensión de la evolución de la enfermedad si el organismo es capaz de colonizar la cavidad nasal murino de manera incompatible con la enfermedad humana. Por ejemplo, el uso in vivo &lt;/ Em&gt; de imágenes, se ha observado que Burkholderia pseudomallei, que no colonizan la URT humano, causa una infección oportunista abrumadora de la cavidad nasal murino cuando se entrega por el método de la instilación intranasal 8. Otros métodos para inculcar bacterias en los pulmones de ratones también se han empleado en investigación de enfermedades infecciosas. Sin embargo, en comparación con la instilación intranasal estos métodos tienden a requerir más conocimientos técnicos y / o un equipo costoso, sin eliminar el potencial para la iniciación de la infección en múltiples sitios (por ejemplo, aerosol [URT y LRT]; transoral [tracto digestivo y LRT]; y intratraqueal quirúrgica [LRT y corriente de la sangre]). Dadas las complicaciones potenciales que podrían estar asociados con los sitios secundarios de la infección, hemos tratado de desarrollar un enfoque intratraqueal que no pasa por la URT y entrega patógeno directamente en los pulmones de ratones anestesiados, pero también limita inoculados inadvertidade iones en el torrente sanguíneo o en el tracto GI. Hacia este fin, intratraqueal (IMIT) instilación intubación mediada fue desarrollado como un procedimiento no quirúrgico que garantiza LRT instilación de inóculo mediante la inclusión de un paso intermedio para verificar la colocación del catéter adecuado antes de la instilación. Este método se describe usando el tinte de la instilación de demostrar visualmente amplia distribución del inóculo en todo el pulmón, y P. aeruginosa instilación para demostrar la entrega altamente eficaz (&gt; 98% del inóculo) de este método para el pulmón. Es importante destacar que, mientras que originalmente desarrollado para la entrega bacteriana, IMIT también ofrece una herramienta eficaz para: i) la instilación de diferentes moléculas para el estudio de otros modelos de enfermedades respiratorias, ii) la entrega terapéutico-pulmonar específica, y iii) los estudios de función pulmonar básica, incluyendo dirigido siRNA entrega al pulmón.

<table><tbody><tr><td>Roedor, Soporte de trabajo basculante</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3467</td><td>La base debe separarse cuando se trabaja en un BSC</td></tr><tr><td>Cabezal de Otoscopio</td><td>Operativo Welch Allyn</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Otoscopio 3.5 V Li Batería</td><td>Welch Allyn</td><td>71900</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Intubación Espéculos cortos, Autoclavable</td><td>Hallowell EMC</td><td>200A3589S</td><td></td></tr><tr><td>Bucles Incisivos Hallowell</td><td>EMC</td><td>210A3490A Aplicador de punta fina</td><td></td></tr> de <tr><td>algodón</td><td>Puritan</td><td>871-PC DBL&nbsp;</td><td>Se utiliza para la retracción de la lengua</td></tr><tr><td>Catéter intravenoso, 20 G</td><td>Exel Int</td><td>26741</td><td>Opcional: ajuste un manguito de silicona con una superficie de catéter expuesta de 10 mm</td></tr><tr><td>Jeringa hermética al gas, 250 ul</td><td>Hamilton</td><td>81120</td><td>Se utiliza para la administración de inóculo líquido por IMIT</td></tr><tr><td>Aguja roma, 22 g</td><td>Hamilton</td><td>91022</td><td>Recorte a la longitud para que sobresalga 1 mm del catéter de 20 G</td></tr><tr><td>Cable guía (cable de fibra óptica, 0,5 mm)</td><td>TheFiberOpticStore.com</td><td>FOF .50</td><td>Cortado a 6" de longitud: utilizado como alambre guía para la intubación</td></tr><tr><td>Jeringa de tuberculina, 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>Ensamble con cable de fibra óptica como cable guía</td></tr><tr><td>Brilliant Blue R (Coomassie)</td><td>Sigma</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing, 1/16 "</td><td>Saint Gobain</td><td>ALC00002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Luer macho 1/16" lengüeta</td><td>Cole Parmer</td><td>45503-22</td><td></td></tr><tr><td>Luer hembra 1/16" lengüeta</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-00</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaína, USP</td><td>Spectrum</td><td>LI102</td><td>pH lidocaína en solución al 2% (p/v) pH7.0</td></tr><tr><td>Bolsa de muestra, 1 oz</td><td>Whirl-Pak</td><td>B01067</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos con fondo en U, Greiner estéril</td><td></td><td>650161</td><td></td></tr></tbody></table>

la intubación mediada intratraqueal (imit) instilación: a, sistema de entrega de pulmón-específica no invasiva

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Estudios de enfermedades respiratorias típicamente implican el uso de modelos murinos como sistemas sustitutos. Sin embargo, hay diferencias fisiológicas significativas entre el murino y los sistemas respiratorios humanos, especialmente en sus vías respiratorias superiores (URT). En algunos modelos, estas diferencias en la cavidad nasal murino pueden tener un impacto significativo sobre la progresión de la enfermedad y la presentación en el tracto respiratorio inferior (LRT) cuando se utilizan técnicas de instilación intranasal, limitando potencialmente la utilidad del modelo de ratón para estudiar estas enfermedades. Por estas razones, sería ventajoso desarrollar una técnica para inculcar bacterias directamente en los pulmones del ratón con el fin de estudiar la enfermedad LRT en ausencia de afectación de la URT. Hemos denominado este mediada por la intubación intratraqueal técnica de entrega (IMIT) la instilación específica del pulmón. Esta técnica no invasiva minimiza el potencial para la instilación en el torrente sanguíneo, lo cual puede ocurrir durante traditi más invasivaonal enfoques quirúrgicos intratraqueales infección, y limita la posibilidad de entrega tracto digestivo incidental. IMIT es un proceso de dos pasos en el que los ratones son intubados primero, con un paso intermedio para asegurar la colocación correcta del catéter en la tráquea, seguido por la inserción de una aguja roma en el catéter para mediar la entrega directa de las bacterias en el pulmón. Este enfoque facilita una eficacia&gt; 98% de la ejecución en los pulmones con una excelente distribución de reactivo de todo el pulmón. Por lo tanto, IMIT representa un nuevo enfoque para estudiar la enfermedad LRT y suministro terapéutico directamente en el pulmón, la mejora de la capacidad de utilizar los ratones como sustitutos para estudiar la enfermedad respiratoria humana. Además, la exactitud y reproducibilidad de este sistema de administración también hace que sea susceptible de Normas de Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP), así como la entrega de una amplia gama de reactivos que requieren la entrega de alta eficiencia en el pulmón.

Para visualizar la distribución del material instilado mediante el método IMIT, se instilaron 50 µl de colorante azul brillante de Coomassie al 0,1 % en los pulmones de un ratón anestesiado. El ratón fue sacrificado inmediatamente y los pulmones se extrajeron mediante necropsia estéril. Figura 1 muestra que el colorante se distribuyó en todos los lóbulos del pulmón.
Para determinar la cantidad de bacterias administradas a los pulmones mediante el método IMIT, tres grupos de ratones (n = 3) recibieron instilaciones con tres concentraciones diferentes de P. aeruginosa (1,21 x 108, 1,21x107, y 1,21 x 106 unidades formadoras de colonias [UFC] por 50 µl). Inmediatamente después de la instilación de IMIT, los ratones fueron sacrificados, se extrajeron los pulmones y se cuantificaron los números bacterianos, comparándolos con el inóculo (Figura 2). La administración del inóculo es altamente eficiente mediante este método, con &gt;98% del inóculo recuperado de los pulmones de los animales instilados. Además, la instilación IMIT fue altamente reproducible independientemente de la concentración del inóculo (R2 = 0.9951).
<img alt="Comparación de la penetración del colorante en pulmón, resultado experimental, medición de escala, análisis científico." src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: La instilación IMIT distribuye el inóculo a través de los pulmones. Los pulmones de ratones instilados con 50 µl de Azul Brillante de Coomassie al 0,1 % muestran distribución del colorante azul en todos los lóbulos.
<img alt="Gráfico que muestra la correlación entre la recuperación de UFC y la administración; R²=0,9951, Recuperación=98,1%." src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Instilación de bacterias en los pulmones mediante IMIT. Se instilaron ratones con P. aeruginosa y se comparó el número de bacterias instiladas en los pulmones (Log10 UFC – recuperadas) con el inóculo estimado (Log10 UFC – administradas). Cada círculo representa la UFC/pulmón de un ratón individual (n = 3 para cada dosis bacteriana).

La instilación de reactivos intratraqueal mediada por intubación (IMIT) es un método excelente y no invasivo para estudiar las enfermedades respiratorias, así como un método para instilar reactivos terapéuticos directamente en el pulmón. Es un método rápido y altamente reproducible que es adecuado para pruebas preclínicas.

La intubación mediada intratraqueal (IMIT) instilación: A, Sistema de Entrega de pulmón-específica no invasiva

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

El objetivo general de este procedimiento es administrar bacterias de forma no invasiva directamente en los pulmones de los ratones. Esto se logra cargando primero un colchón de aire de 150 microlitros en una jeringa hermética al gas, seguido de 50 microlitros de la suspensión bacteriana preparada. En el segundo paso, se intuba un ratón anestesiado con un catéter de calibre 20 utilizando un alambre guía para ayudar a la colocación.Luego, después de confirmar el éxito de la intubación con un medidor de flujo simple, el inóculo bacteriano se administra a través del catéter directamente al pulmón con una aguja roma de calibre 22 de largo. En última instancia, la intubación mediada por intubación intratraqueal u omitida se puede utilizar para estudiar la enfermedad del tracto respiratorio inferior en ratones, evitando la afectación concurrente del tracto respiratorio superior. La principal ventaja de imit sobre los métodos de inoculación internasal es que esta técnica permite la administración precisa y reproducible de un inóculo directamente a los pulmones.Debido a que la IIT es una técnica no quirúrgica, también reduce la posibilidad de complicaciones asociadas con los procedimientos quirúrgicos intratraqueales. Aunque este método puede proporcionar un mecanismo fiable para administrar bacterias al pulmón para estudiar la patogénesis, el IMA también se puede aplicar a la administración de otros reactivos, como compuestos ambientales para estudiar el daño pulmonar, la administración de dianas terapéuticas para el tratamiento y la administración de sondas de imagen o ARNs para estudiar la biología pulmonar básica. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con el paso de intubación, ya que el paso requiere un posicionamiento cuidadoso del animal y el endoscopio automático para la inserción de la guía.La demostración visual de este método es útil, ya que la colocación inicial de la guía en la tráquea es conceptualmente difícil de describir a los nuevos investigadores. 15 horas antes de la instalación, inocule tres mililitros de caldo de cultivo con una sola colonia bacteriana y cultive el cultivo a 37 grados centígrados y un agitador a 200 RPM. Después de 15 horas, centrifugar un mililitro de las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y volver a suspender el paladar en un mililitro de PBS.A continuación, mida una dilución de uno a 10 de la suspensión de reserva bacteriana a un diámetro exterior de 600 para determinar la concentración bacteriana. A continuación, diluya las células bacterianas en PBS hasta la concentración deseada de bacterias por cada 50 microlitros de inóculo. Para la instalación de IIT, los ratones se preparan para IIT mediante la administración de una solución de lidocaína al 2% a un ratón ligeramente anestesiado mediante ratones con aguja de sonda nasogástrica.Un retorno a la anestesia mientras la lidocaína hace efecto. Ahora extraiga 150 microlitros de aire en una jeringa de rescisión de gas de 250 microlitros, equipada con una aguja roma de calibre 22 de largo. A continuación, avance el émbolo de teflón desde la marca de 150 microlitros hasta la marca de 200 microlitros en el cuerpo de la jeringa para extraer 50 microlitros del inóculo bacteriano cuando la jeringa esté cargada.LA, un ratón sedado en decúbito supino sobre una plataforma de intubación que asegura al animal por los incisivos en un anillo sin anillas unido a una tira de Velcro conectada a la plataforma. Levante el mouse a una inclinación de 45 grados y luego use un aplicador de micro algodón para retraer la lengua con un movimiento de balanceo con la mano dominante. A continuación, con la mano no dominante, utilice un otoscopio quirúrgico con un especular de intubación para mantener la retracción de la lengua y visualizar la epiglotis.Luego, sosteniendo un alambre guía enhebrado a través de un catéter de calibre 20 en la mano dominante, intuble el ratón a una profundidad de 10 milímetros dentro de la tráquea y retire el otoscopio. Asegure el catéter con la mano no dominante. A continuación, conecte brevemente al catéter una longitud conectada al señuelo de un tubo transparente de 16 que contenga un tinte de color.El tinte debe migrar rápidamente hacia adelante y hacia atrás en respuesta a la respiración del animal cuando el animal ha sido intubado con éxito. Inserte la aguja roma de calibre 22 en el catéter y dispense el inóculo directamente en el pulmón con un solo movimiento de fluido. A continuación, retire inmediatamente la aguja y el catéter del animal y devuelva el ratón a su jaula con supervisión hasta que el animal se recupere por completo de la anestesia.Para evaluar la carga bacteriana del tejido pulmonar infectado, extraiga los pulmones mediante una técnica estéril y coloque el tejido en una bolsa de muestra estéril prepesada de una onza. Después de pesar la bolsa de muestras más los pulmones, agregue un mililitro de PBS estéril al tejido y revenda la bolsa de muestras. A continuación, haga rodar suavemente una pipeta serológica de 25 mililitros sobre la bolsa de muestras para homogeneizar el tejido.Retire el tejido conectado a través de un filtro de capa de pared de poliéster estéril y trate el homogeneizado con tritton X 100 a una concentración final del 1% para liberar las bacterias. A continuación, utilice una pipeta multicanal para realizar una dilución en serie séxtuple del homogeneizado en una placa de pocillos UBO 96. A continuación, utilice un multicanal de ocho pocillos para colocar las alícuotas de triplicado homogeneizado de 10 microlitros en una placa de agar LBA.Finalmente, incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados y enumerar las unidades formadoras de colonias al día siguiente. La liberación de las bacterias es altamente eficiente a través de este método, con más del 98% del inóculo aerogénico de pseudomonas recuperado de los pulmones de los animales instilados en este experimento representativo. Además, la instalación de IIT es altamente reproducible independientemente de la concentración del inóculo administrado.Para visualizar la distribución del material instilado a través del método IIT, se pueden administrar 50 microlitros de tinte azul brillante de Kumasi al 0,1% en los pulmones, como se acaba de demostrar para el inóculo. Nótese la distribución del tinte a todos los lóbulos del pulmón una vez dominado. Este método se puede realizar rápidamente con un equipo de dos investigadores en un tiempo promedio de dos a tres minutos, incluida la anestesia, la inoculación de IMA y la recuperación de la anestesia.Al intentar este procedimiento, es importante no hacer más de dos intentos fallidos de intubar el ratón. El fracaso de la intubación puede provocar un traumatismo potencial al insertar el catéter en el esófago en lugar de en la tráquea. Muchos patógenos respiratorios, incluidos los que requieren contención de abs L 3, pueden ser administrados de manera efectiva por imed, ya que este procedimiento se puede realizar como lo demuestran los gabinetes de seguridad y, además, por los investigadores que usan protección respiratoria completa, incluido un protector facial.Hemos demostrado que imit es un método muy preciso y eficiente para la administración de materiales directamente en los pulmones de ratones. Estas propiedades hacen que imit sea muy adecuado para estudios de tipo GLP que requieren sistemas de modelos altamente reproducibles.

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Intratraqueal instilaciones solutos entregar directamente a los pulmones. Este procedimiento objetivos de la entrega de los instilado en las regiones distales de los pulmones, y por lo tanto incorpora a menudo en los estudios dirigidos a estudiar los alvéolos. Ofrecemos un protocolo detallado para la supervivencia de realizar instilaciones intratraqueal en ratones.

La instilación directa traqueal de solutos en pulmón de ratón

Nos ilustran no quirúrgico de entrega de materiales de prueba en los pulmones de ratones anestesiados a través de la tráquea. Este método permite la exposición del pulmón a los patógenos bacterianos y virales, las citocinas, los anticuerpos, los granos, productos químicos, ni colorantes. Nos describen con más detalle la recolección y procesamiento de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón (LDLNs) por citometría de flujo.

No quirúrgico instilación intratraqueal de ratones con el análisis de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón por citometría de flujo

Este video describe un enfoque intrabronquial para administrar un agente experimental de forma selectiva en el pulmón distal derecho e izquierdo. En el protocolo presentado, administraremos bleomicina por vía intrabronquial en un ratón para obtener un mejor modelo de fibrosis pulmonar.

Administración intrabronquial: técnica para administrar un agente experimental de forma selectiva en un pulmón de ratón

El uso de un modelo que imita el estado de las enfermedades pulmonares en los seres humanos es crítico para el estudio de la fisiopatología y / o la etiología de una enfermedad en particular y para el desarrollo de la intervención terapéutica. Aquí un método intubación endotraqueal no invasivo que puede entregar directamente materiales exógenos a los pulmones del ratón se presenta.

No Invasiva Intratraqueal Intubación para Estudiar la Patología y Fisiología de pulmón de ratón

En este artículo se presenta un método rápido y sencillo para la administración de bleomicina directamente en la tráquea ratón a través de la intubación. Las principales ventajas de este método son que es altamente reproducible, fácil de dominar, y no requiere equipo especializado ni largos tiempos de recuperación.

Un método mejorado para la rápida intubación de la tráquea en ratones

La administración intratraal (IT) de agentes experimentales en ratones a menudo resulta en un parto asimétrico a los pulmones distales.  En este informe, describimos un enfoque intrabronquial directo (IB) para canalizar cada pulmón en ratones vivos de forma no operativa.  Este enfoque se puede utilizar para administrar selectivamente agentes a un pulmón o puede adaptarse para mejorar el suministro de agentes simétricos a ambos pulmones.

Administración intrabronquial directa para mejorar la deposición selectiva del agente dentro del pulmón del ratón

Las formulaciones de polvo seco para inhalación tienen un gran potencial en el tratamiento de enfermedades respiratorias. Antes de entrar en estudios en humanos, es necesario evaluar la eficacia de la formulación de polvo seco en estudios preclínicos. Un método simple y no invasor de la administración del polvo seco en ratones a través de la ruta intratraqueal se presenta.

Administración Intratraqueal De La Formulación De Polvo Seco En Ratones

Esta técnica de inculcar medicamentos directamente en la tráquea de roedores neonatales es importante para estudiar el impacto de los medicamentos o biológicos administrados localmente en las enfermedades pulmonares neonatales. Además, este método también se puede utilizar para inducir lesiones pulmonares en modelos animales.

Un método mínimamente invasivo para la instilación intratraqueal de medicamentos en roedores neonatales para tratar la enfermedad pulmonar

Aquí, proponemos un protocolo para la administración de lipopolisacáridos intratraqueales (LPS) a través de la intubación endotraqueal orofaríngea no invasiva. Este método minimiza el trauma del procedimiento quirúrgico para el animal y administra LPS con precisión a la tráquea y luego a los pulmones.

Instilación intratraqueal no invasiva de lipopolisacáridos en ratones

Este protocolo presenta cómo la posición óptima de un ratón y la inserción de un otoscopio basado en una cámara por vía transoral permite la visualización de la glotis, una intubación rápida con un traumatismo tisular mínimo y un suministro constante de líquido a los pulmones.

Metodología mejorada para la administración de líquido al pulmón de ratón: intubación mediante un otoscopio de consumo

La terapia celular ofrece una intervención prometedora para la fibrosis pulmonar mediante el uso de células progenitoras para reparar el tejido dañado y mejorar la función pulmonar. Dado que las imágenes desempeñan un papel fundamental en el seguimiento de la integración celular, en este trabajo describimos el seguimiento in vivo guiado por imágenes magnéticas de la terapia celular para la fibrosis pulmonar en un modelo de ratón.

Seguimiento in vivo guiado por imágenes de células progenitoras epiteliales pulmonares distales trasplantadas para fibrosis pulmonar mediante imágenes de partículas magnéticas

Aprende la técnica IMIT para la entrega no invasiva de bacterias directamente a los pulmones de ratones. Este método permite estudios reproducibles de enfermedades respiratorias con alta eficiencia de recuperación del inóculo.

La intubación mediada intratraqueal (IMIT) instilación: A, Sistema de Entrega de pulmón-específica no invasiva

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